王旭蘭 吳皓宇 張 濤 王亞萍 王群讓 常鳳軍

(1 咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院康復(fù)治療技術(shù)專業(yè)教研室，陜西省咸陽市 712000，電子郵箱：wangxulan84@126.com； 2 陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安市 710068； 3 商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護(hù)理系，河南省商丘市 476000； 4 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，咸陽市 712000)

急性ST段抬高型心肌梗死(acute ST-segment elevation myocardial infarction,ASTEMI)是指有典型心絞痛癥狀且癥狀持續(xù)時間超過20 min，舌下含服硝酸甘油緩解不明顯，并伴有肌鈣蛋白升高和動態(tài)演變，同時心電圖相應(yīng)導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高的急性心肌梗死。其病理基礎(chǔ)是在原有冠狀動脈狹窄的基礎(chǔ)上再次發(fā)生斑塊破裂而激活血小板，導(dǎo)致血栓形成和心肌細(xì)胞缺血、缺氧、壞死[1]。目前經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)是公認(rèn)的ASTEMI血運(yùn)重建的有效措施，但許多基層醫(yī)院尚無開展PCI的條件，或者患者及其家屬拒絕PCI。而早期且及時溶栓的即刻療效與直接PCI相似[2]。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)循環(huán)微?？赡芡ㄟ^內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和內(nèi)皮素1途徑損害內(nèi)皮功能，參與急性心肌梗死的發(fā)生和發(fā)展[3]。但溶栓治療是否會影響ASTEMI患者循環(huán)微粒的數(shù)量和功能，以及循環(huán)微粒是否參與溶栓后缺血再灌注損傷，目前尚未有研究報告。本研究探討ASTEMI患者溶栓前后循環(huán)微粒數(shù)量及功能的改變，及其參與溶栓后心肌缺血再灌注損傷的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年10月至2016年6月就診于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科的20例行溶栓治療的ASTEMI患者作為ASTEMI組。ASTEMI診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：(1)情緒激動或勞累誘發(fā)的胸骨后壓榨樣疼痛或呼吸困難；(2)心電圖存在ST段抬高、壓低、T波和Q波等動態(tài)演變；(3)肌鈣蛋白升高。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)自愿加入研究；(2)性別不限，年齡≥18歲且≤75歲；(3)患者及其家屬拒絕PCI；(4)臨床資料完整。排除患有腎功能衰竭、未控制的高血壓、嚴(yán)重感染性疾病等可能影響循環(huán)微粒數(shù)量及功能的疾病的患者。ASTEMI組中男性10例、女性10例，患者年齡35～60(42.34±12.68)歲。選取同期于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的20例志愿者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)自愿加入研究；(2)性別不限，年齡≥18歲且≤75歲；(3)臨床資料完整。排除患有冠心病、高血壓、 糖尿病、感染性疾病、嚴(yán)重創(chuàng)傷、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、肝腎功能衰竭等疾病的患者。對照組中男性10例、女性10例，研究對象年齡48～64(45.64±13.26)歲。兩組研究對象的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性；兩組的膽固醇水平、三酰甘油水平、高密度脂蛋白水平、低密度脂蛋白水平、體重指數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。本研究經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，所有研究對象簽署知情同意書。

表1 兩組研究對象的臨床資料的比較

1.2 溶栓方法 首先靜脈推注重組組織型纖溶酶原激活劑15 mg，繼而給予重組組織型纖溶酶原激活劑50 mg靜脈滴注30 min，最后給予重組組織型纖溶酶原激活劑35 mg靜脈滴注60 min。

1.3 循環(huán)微粒的提取 抽取ASTEMI組溶栓前與溶栓2 h后和對照組體檢時的肘靜脈血4 mL。參考文獻(xiàn)[5]提取循環(huán)微粒：血液樣本于4℃下4 000 r/min離心10 min，提取上層血漿，將上層血漿進(jìn)一步離心(4℃，2 750 r/min，2 min)后所獲得的上層即為乏血小板血漿，然后取2 mL乏血小板血漿進(jìn)一步離心(4℃，3 250 r/min，45 min)使循環(huán)微粒沉淀于底部，加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：C11875500BT)將循環(huán)微粒從離心管底部重懸。用二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：P1511-1)測定循環(huán)微粒含量后置于4℃冰箱(中國海爾公司)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)動物 采用抓鬮法將18只SD大鼠隨機(jī)分為動物對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組，每組6只。大鼠購買自陜西中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(陜)2020-005]，均為6周齡，體重(150±10)g，飼養(yǎng)在溫度(20±2)℃、濕度(55±10)%環(huán)境下，12 ∶12暗光循環(huán)，自由飲用水、食用食物。

1.5 大鼠干預(yù)方法及內(nèi)皮功能的檢測 分別取來自動物對照組、ASTEMI組溶栓前和溶栓2 h后的循環(huán)微粒3 mg，用注射器經(jīng)陰莖背靜脈推注入對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組大鼠體內(nèi)反應(yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束后斷頭處死大鼠，取大鼠心臟組織經(jīng)固定、脫水、包埋后制作石蠟病理切片。然后采用免疫組化法(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法)，使用雙花扁豆凝集素試劑盒(中國上海雅吉生物科技有限公司，批號：YS06531B)檢測eNOS、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在大鼠心肌組織中的表達(dá)情況[6]。根據(jù)陽性細(xì)胞(黃染即為陽性)著色強(qiáng)度計分：無黃色計0分、淡黃色計1分、棕黃色計2分、深棕黃色計3分。200倍顯微鏡下隨機(jī)記錄3個視野細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)后計算各組得分，得分=著色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

1.6 血管舒張功能檢測 處死大鼠后取新鮮胸主動脈，參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行血管舒張功能檢測。首先將血管置于通氣(95% O2和5% CO2的混合氣)并預(yù)冷的Kreb′s平衡液(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：PB180348；氯化鈉119.0 mmol/L，碳酸氫鈉25.0 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L，氯化鈣1.6 mmol/L，氯化鉀4.7 mmol/L， 磷酸二氫鉀1.2 mmol/L，硫酸鎂1.2 mmol/L，pH 7.4)中，去除動脈周圍脂肪組織后將血管剪成3～4 mm的血管環(huán)。分別用各組循環(huán)微粒(3 mg)孵育血管環(huán)30 min后用1×10-6mol/L苯腎上腺素(美國Sigma公司，批號：59-42-7)收縮血管至平臺期，而后依次加入濃度為1×10-7mol/L至1×10-4mol/L的乙酰膽堿(美國Sigma公司，批號：60-31-1)，每個濃度干預(yù)2 min。將血管環(huán)連接至BL-420E+生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)(中國成都泰盟科技有限公司)進(jìn)行血管舒張功能檢測。血管舒張率=(苯腎上腺素孵育后血管張力-循環(huán)微粒孵育后血管張力/苯腎上腺素孵育后血管張力)×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0作圖，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對照組和ASTEMI組溶栓前后循環(huán)微粒含量的比較 對照組循環(huán)微粒含量為(3.02±0.72)mg/mL，ASTEMI組溶栓前、溶栓2 h后循環(huán)微粒水平分別為(4.16±1.65)mg/mL、(5.12±1.43)mg/mL。ASTEMI組溶栓前循環(huán)微粒含量高于對照組(t=2.832，P=0.007)，ASTEMI組溶栓2 h后循環(huán)微粒含量高于溶栓前(t=2.147，P=0.012)。

2.2 3組大鼠心肌組織中的eNOS、iNOS表達(dá)水平的比較 動物對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組大鼠心肌組織中的eNOS表達(dá)水平依次降低，iNOS表達(dá)水平依次升高(均P<0.05)，見表2、圖1和圖2。

動物對照組 實(shí)驗(yàn)1組 實(shí)驗(yàn)2組

動物對照組 實(shí)驗(yàn)1組 實(shí)驗(yàn)2組

2.3 3組大鼠血管舒張功能的比較 動物對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組大鼠的血管舒張率依次降低(均P<0.05)，見表2。

表2 3組大鼠心肌組織中的eNOS、iNOS表達(dá)水平和血管舒張率的比較(x±s)

3 討 論

ASTEMI因其高致死率而受到廣泛關(guān)注和重視，目前針對ASTEMI患者最有效的血運(yùn)重建方法是PCI，然而眾多基層醫(yī)院尚無開展PCI的條件，且部分患者或家屬對PCI存在抵觸心理。因此，溶栓治療仍然是有效改善ASTEMI患者預(yù)后不可或缺的措施。但是，溶栓后冠狀動脈缺血再灌注所致的心律失常等情況仍然是困擾廣大醫(yī)療工作者的一大問題[8]。缺血再灌注所致的各種自由基(如烷自由基、烷氧自由基、烷過氧自由基等)、血管活性物質(zhì)(如白三烯、血小板激活因子等)、內(nèi)皮素和血管緊張素等[9]有可能引起循環(huán)微粒數(shù)量和功能的改變。而循環(huán)微粒已被證實(shí)可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和自由基失衡，內(nèi)皮功能障礙和自由基失衡又可以刺激循環(huán)微粒產(chǎn)生，進(jìn)而形成惡性循環(huán)[3，10]。本研究結(jié)果顯示，與健康志愿者比較，ASTEMI患者體內(nèi)循環(huán)微粒含量升高(P<0.05)，而溶栓可使ASTEMI患者體內(nèi)循環(huán)微粒水平進(jìn)一步升高(P<0.05)，說明循環(huán)微?？赡軈⑴c了溶栓后冠狀動脈缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展。

eNOS作為正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮的主要蛋白酶，是維持血管收縮和舒張穩(wěn)定的主要物質(zhì)。iNOS在正常情況下不表達(dá)，只有在機(jī)體受到各種刺激下才會大量表達(dá)，大量表達(dá)的iNOS會誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的一氧化氮，過多的一氧化氮與體內(nèi)的自由基結(jié)合產(chǎn)生氫氧根離子和亞硝酸根離子，這些產(chǎn)物對內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮功能的損害更大[11]。而正常濃度的一氧化氮對血管是有益的，可以舒張血管、促進(jìn)血管新生等。研究顯示，冠心病患者體內(nèi)的循環(huán)微粒能夠通過抑制離體大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮而損害內(nèi)皮依賴的血管舒張功能[6]。本研究顯示，動物對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組大鼠心肌組織中的eNOS表達(dá)水平依次降低，iNOS表達(dá)水平依次升高，血管舒張率依次下降(均P<0.05)。這說明ASTEMI患者體內(nèi)的循環(huán)微?？纱碳ご笫笮募〗M織中iNOS的表達(dá)，同時抑制大鼠心肌組織中eNOS的表達(dá)和胸主動脈的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，而溶栓后循環(huán)微粒的上述作用較溶栓前進(jìn)一步強(qiáng)化。溶栓后循環(huán)微粒的上述作用可導(dǎo)致氫氧根離子和亞硝酸根離子的大量產(chǎn)生，進(jìn)而損害內(nèi)皮功能，這也許是冠狀動脈缺血再灌注發(fā)生和發(fā)展損傷的機(jī)制之一[12]。

綜上所述，ASTEMI患者體內(nèi)循環(huán)微粒數(shù)量增加，導(dǎo)致iNOS過表達(dá)而eNOS表達(dá)下調(diào)，從而引起血管舒張功能障礙，而溶栓治療導(dǎo)致循環(huán)微粒數(shù)量進(jìn)一步增加及其上述作用增強(qiáng)，這可能是溶栓后發(fā)生冠狀動脈缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。然而由于本研究將人體來源的循環(huán)微粒注入大鼠體內(nèi)，存在種屬差異所致的免疫源因素，因此今后仍需要更多的基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果。