王 義 牛延坪 戴 俊

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，江蘇省蘇州市 215000，電子郵箱:wangyi19900522@163.com)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種常見(jiàn)的臨床疾病，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。機(jī)械暴力等因素可造成原發(fā)性SCI，在原發(fā)性SCI的基礎(chǔ)上，出血、水腫、炎癥、壞死等情況又可導(dǎo)致繼發(fā)性SCI，原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷均可引發(fā)神經(jīng)功能永久性損害[2]。研究顯示在SCI急性期進(jìn)行干預(yù)可以促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，而減輕繼發(fā)性損傷并促進(jìn)脊髓組織存活可以作為SCI治療的基礎(chǔ)性研究[3]。

SCI后小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞被激活，然后釋放炎性因子，例如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)等[4]；過(guò)表達(dá)的炎性因子可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)繼發(fā)性SCI。SCI后星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，在炎癥中心快速增殖并遷移，在病變周?chē)纬赡z質(zhì)瘢痕[5]。其中，中間纖維蛋白水平的增高可反映出反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況[5-6]。炎癥和膠質(zhì)瘢痕過(guò)度增生在損傷區(qū)域邊緣形成屏障，阻礙神經(jīng)再生[7]，嚴(yán)重影響了SCI后的神經(jīng)再生[8]。

Kalderon和Fuks于1996年發(fā)現(xiàn)采用X線照射對(duì)某些細(xì)胞成分進(jìn)行適時(shí)干預(yù)，可抑制脊髓退化的發(fā)生，進(jìn)而使脊髓的結(jié)構(gòu)性再生過(guò)程不受阻礙，進(jìn)而促進(jìn)損傷脊髓結(jié)構(gòu)的恢復(fù)[9]。研究表明，適當(dāng)劑量的X線照射可清除那些激發(fā)神經(jīng)組織變性的細(xì)胞因素(小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)[10]；此外，適當(dāng)劑量的X線照射可以抑制膠質(zhì)瘢痕形成，從而改善神經(jīng)功能[11]。因此，本研究旨在探討X線照射治療SCI的效果及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 HE染色試劑盒(碧云天，批號(hào)：C0105S)，尼氏染色液(碧云天，批號(hào)C0117)，蛋白酶抑制劑(碧云天，批號(hào)：SG2000)，磷酸化蛋白酶抑制劑(碧云天，批號(hào)：P1081)，二喹啉甲酸法蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天，批號(hào)：P0010)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(CST公司，批號(hào)：2858),髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)抗體(CST公司，批號(hào)：78896)，TNF-α抗體(Novus Biologicals公司，批號(hào)：NBP1-19532)，IL-1β抗體(Novus Biologicals公司，批號(hào)：NB600-633)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(CST公司，批號(hào)：3670)，波形蛋白(Vimentin)抗體(CST公司，批號(hào)：5741)，二抗(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：FMS-RB01、FMS-MS01)，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)法辣根過(guò)氧化物酶顯色劑盒(碧云天，批號(hào)：P0203)，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：SQ202)。臨床直線加速器放射治療系統(tǒng)(Elekta公司，型號(hào)：Synergy)，正置光學(xué)顯微鏡(日本東京尼康公司，型號(hào)：ECLPSE 80i)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，型號(hào)：Bio-Rad GelDoc XR+)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 75只清潔級(jí)雌性SD大鼠(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK滬2017-0005)購(gòu)自蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，8周齡，體重(250±20)g。實(shí)驗(yàn)前，將大鼠置于室溫(23±2)℃的房間中飼養(yǎng)1周，以消除新環(huán)境可能產(chǎn)生的生理和心理影響。

1.3 動(dòng)物分組和SCI模型建立方法 采用簡(jiǎn)單隨機(jī)化方法，將SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、SCI組、SCI+2 Gy組、SCI+10 Gy組和SCI+20 Gy組，每組15只。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉大鼠，麻醉成功后，以俯臥位固定；以T10為中心做長(zhǎng)約2 cm的縱行皮膚切口，暴露出T10節(jié)段棘突后行椎板切除術(shù)暴露T10節(jié)段脊髓；除sham組外，根據(jù)Allen原理，對(duì)其他4組大鼠使用自制撞擊器(10 g×6 cm)撞擊暴露脊髓，造成T10段SCI，而對(duì)Sham組大鼠只做椎板切除術(shù)而不損傷脊髓。硬膜囊迅速淤血和水腫，以及大鼠出現(xiàn)雙下肢抖動(dòng)，則提示SCI模型建立成功?？p合切口并用碘附消毒，連續(xù)肌肉注射青霉素(0.8 mg/g)3 d。術(shù)后進(jìn)行輔助排尿，直至恢復(fù)自主排尿。所有大鼠建模均成功，其間死亡11只(SCI組3只，SCI+2 Gy組3只，SCI+10 Gy組2只，SCI+20 Gy組3只)，后續(xù)補(bǔ)充相應(yīng)大鼠，使每組達(dá)到15只。

1.4 X線照射治療 SCI+2 Gy組、SCI+10 Gy組和SCI+20 Gy組的大鼠在SCI后2 h分別接受2 Gy、10 Gy、20 Gy劑量的單次X線照射。以SCI部位為照射中心(T10水平)，照射范圍為30 mm×15 mm(長(zhǎng)×寬)，皮源距離50 cm。以200 cGy/min的劑量率使用6 MeV X射線照射。

1.5 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估 于術(shù)前及建模成功后(即術(shù)后)第1天、第14天，采用巴索-貝蒂-布雷斯納漢(Basso-Beattie-Bresnahan,BBB)量表[12]和斜板試驗(yàn)[12]評(píng)估大鼠運(yùn)動(dòng)功能的情況。BBB量表總分21分，0分表示“完全癱瘓”，21分表示“正常運(yùn)動(dòng)”；斜板試驗(yàn)的傾斜角度可自由調(diào)節(jié)，記錄大鼠可在斜板上停留5 s而不掉落的最大傾斜角。術(shù)前所有大鼠的運(yùn)動(dòng)功能均正常，BBB量表評(píng)分均為21分，斜板試驗(yàn)的最大傾斜角為73°。

1.6 脊髓組織病理染色 在術(shù)后第14天每組取8只大鼠，處死大鼠后用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，收集受損脊髓樣品0.5 cm。將脫水后的脊髓樣品包埋在石蠟中，然后將石蠟塊制作成5 μm厚的切片。切片通過(guò)脫蠟、脫水等處理后，再使用HE染色試劑盒和尼氏染色液分別對(duì)切片進(jìn)行HE染色和尼氏染色。所有切片均在正置光學(xué)顯微鏡下(400倍鏡)觀察并拍攝。尼氏小體呈現(xiàn)藍(lán)色，從每個(gè)切片中隨機(jī)選擇3個(gè)成像區(qū)域進(jìn)行分析，后通過(guò)ImageJ 1.48軟件統(tǒng)計(jì)損傷部位中空腔及尼氏小體所占的面積比例。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 將上述制備的切片在0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中煮沸(95℃)15 min以修復(fù)抗原。在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌3次(5 min/次)后，將切片與下列一抗在4℃下孵育過(guò)夜:MBP(1 ∶400)、TNF-α(1 ∶200)、IL-1β(1 ∶200)、GFAP(1 ∶50)、Vimentin (1 ∶200)。切片過(guò)夜后在磷酸緩沖鹽溶液中洗滌3次(5 min/次)，然后與二抗(1 ∶3 000)在室溫下孵育60 min，最后用DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒顯色。在正置顯微鏡(400倍鏡)下進(jìn)行觀察拍攝。陽(yáng)性蛋白呈現(xiàn)棕褐色，從每個(gè)切片中隨機(jī)選擇3個(gè)成像區(qū)域用以分析，使用ImageJ 1.48軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞的面積比例。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 在術(shù)后第14天每組取7只大鼠，處死大鼠后用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，收集受損脊髓樣品0.5 cm。將樣品在含有蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑的裂解液中完全勻漿后離心(4℃，14 000 r/min，15 min)。用二喹啉甲酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。采用10%和12.5%凝膠電泳分離各組蛋白后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將聚偏二氟乙烯膜在5% BSA中封閉1 h，然后與一抗在4℃下孵育過(guò)夜：MBP(1 ∶1 000)、TNF-α(1 ∶500)、IL-1β(1 ∶1 000)、GFAP(1 ∶1 000)、Vimentin (1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)。將聚偏二氟乙烯膜與二抗(1 ∶3 000)在室溫下孵育1 h。孵育結(jié)束后在TBST中洗滌3次(10 min/次)，滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，經(jīng)Bio-Rad成像系統(tǒng)可視化。使用ImageJ 1.48軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參(GAPDH)灰度值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組內(nèi)前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，多重比較采用Dunnett檢驗(yàn)。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中Sham組大鼠的BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)的最大傾斜度均不變，運(yùn)動(dòng)功能均正常。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，與Sham相比，其他組大鼠的BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)的最大傾斜度均降低或減小(均P< 0.05)，且術(shù)后第14天，SCI組、SCI+2 Gy組、SCI+20 Gy組、SCI+10 Gy組中大鼠的BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)的最大傾斜度依次增加(均P< 0.05)。除Sham組外，其他組大鼠術(shù)后第14天的BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)的最大傾斜度均較術(shù)后第1天增加(均P< 0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)結(jié)果的比較(x±s)

2.2 各組大鼠脊髓的空腔病變情況 取脊髓樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，SCI大鼠的受損脊髓因瘢痕和空腔的形成出現(xiàn)萎縮。術(shù)后第14天，其他組大鼠的脊髓空腔面積比例均大于Sham組(均P< 0.05)，而所有X線照射組大鼠的脊髓空腔面積比例均小于SCI組，且SCI+2 Gy組、SCI+20 Gy組、SCI+10 Gy組中大鼠的脊髓空腔面積比例依次減小(均P<0.05)，見(jiàn)表2和圖1。

表2 各組大鼠脊髓的空腔面積比例的比較(x±s，%)

圖1 各組大鼠脊髓的空腔病變情況(HE染色)

2.3 各組大鼠脊髓組織中尼氏小體所占的面積比例和MBP相對(duì)表達(dá)量的比較 術(shù)后第14天，SCI組和各個(gè)X線照射組大鼠的脊髓(受損部位)組織中尼氏小體所占面積比例及MBP相對(duì)表達(dá)量均低于Sham組(均P< 0.05)，而各個(gè)X線照射組大鼠的脊髓(受損部位)組織中尼氏小體所占面積比例及MBP相對(duì)表達(dá)量均高于SCI組，且SCI+2 Gy組、SCI+20 Gy組、SCI+10 Gy組大鼠的脊髓(受損部位)組織中尼氏小體所占面積比例及MBP相對(duì)表達(dá)量依次升高(均P< 0.05)，見(jiàn)表3和圖2。

表3 各組大鼠脊髓組織中尼氏小體所占的面積比例和MBP相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

圖2 各組大鼠脊髓組織尼氏染色情況和MBP蛋白表達(dá)情況

2.4 各組大鼠脊髓組織炎癥和膠質(zhì)瘢痕形成相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組比較，術(shù)后第14天，其他組大鼠脊髓中的炎癥因子(TNF-α和IL-1β)和中間纖維蛋白(GFAP、Vimentin)的相對(duì)表達(dá)量均增加；而與SCI組比較，各個(gè)X線照射組大鼠脊髓中的TNF-α、IL-1β、GFAP、Vimentin的相對(duì)表達(dá)量均降低(均P< 0.05)，且SCI+2 Gy組、SCI+20 Gy組、SCI+10 Gy組大鼠脊髓中上述指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量依次降低(均P< 0.05)，見(jiàn)表4、圖3和圖4。

蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，術(shù)后第14天，其他組大鼠脊髓中的TNF-α、IL-1β、GFAP、Vimentin的相對(duì)表達(dá)量均增加(均P<0.05)；與SCI組比較，SCI+10 Gy組和SCI+20 Gy組脊髓中的TNF-α、IL-1β相對(duì)表達(dá)量，SCI+2 Gy組、SCI+10 Gy組和SCI+20 Gy組脊髓中的GFAP、Vimentin相對(duì)表達(dá)量均下降(均P<0.05)，而SCI+2 Gy組大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；SCI+20 Gy組、SCI+10 Gy組大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β相對(duì)表達(dá)量均低于SCI+2 Gy組，且SCI+2 Gy組、SCI+20 Gy組、SCI+10 Gy組大鼠脊髓中GFAP、Vimentin的相對(duì)表達(dá)量依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表4、圖3和圖4。

表4 各組大鼠脊髓組織炎癥和膠質(zhì)瘢痕形成相關(guān)蛋白表達(dá)情況的比較(x±s)

注:與Sham組比較，*P<0.05;與SCI組比較，#P<0.05;與SCI+2 Gy組比較，▲P<0.05;與SCI+10 Gy組比較，￡P(guān)<0.05。

圖3 各組大鼠脊髓中TNF-α和IL-1β的表達(dá)情況

圖4 各組大鼠脊髓中GFAP和Vimentin的表達(dá)情況

3 討 論

眾所周知，在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中，SCI具有不可逆性，神經(jīng)組織再生非常有限。治療SCI有多種策略，例如干細(xì)胞治療、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療等。其中，干細(xì)胞治療可以通過(guò)直接替換SCI后不久死亡的神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[13]，而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療可以通過(guò)輸送神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3)誘導(dǎo)上行感覺(jué)軸突的趨化再生，并防止SCI后不同神經(jīng)元群的萎縮和死亡[14]。前者具有組織特異性，后者具有靶向效應(yīng)，但它們治療SCI具有不可控性、無(wú)法精準(zhǔn)分化、生物多樣性、費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，適應(yīng)證群體較窄。而X線照射具有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和減輕炎癥的作用，是一種非特異性的預(yù)防性治療[15]。X線照射治療可單獨(dú)也可聯(lián)合其他療法對(duì)SCI患者進(jìn)行綜合性治療，是治療繼發(fā)性SCI的潛在療法。

研究表明，在原發(fā)性SCI后的最初幾小時(shí)內(nèi)機(jī)體即可發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死、膠質(zhì)瘢痕的形成[16]。Kalderon等[9]的研究結(jié)果顯示，損傷后3周內(nèi)是預(yù)防膠質(zhì)瘢痕形成的最佳時(shí)間。然而，Morin-Richaud等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在損傷后2周星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的增生現(xiàn)象將不再顯著。綜合以上結(jié)果，原發(fā)性SCI后的急性期是抑制繼發(fā)性SCI進(jìn)展的治療窗口期，所以本研究在SCI術(shù)后2 h進(jìn)行單次X線照射治療。本研究結(jié)果顯示，SCI+2 Gy組、SCI+10 Gy組、SCI+20 Gy組大鼠術(shù)后的BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)的最大傾斜度隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，且術(shù)后14 d，各個(gè)X線照射組上述指標(biāo)均優(yōu)于SCI組，且脊髓空腔病變面積比例小于SCI組(均P< 0.05)，這提示SCI后2 h進(jìn)行單次X線照射治療可有效地改善SCI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，并可減少SCI后空腔病變的形成。當(dāng)SCI發(fā)生時(shí)，許多成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡并脫髓鞘。MBP主要由成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞合成，其對(duì)于脫髓鞘損傷后新髓鞘的及時(shí)形成至關(guān)重要[18]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后第14天SCI各組大鼠的脊髓中尼氏小體面積比例減少、MBP的相對(duì)表達(dá)量較Sham組降低(均P<0.05)，而SCI+2 Gy組、SCI+10 Gy組、SCI+20 Gy組大鼠SCI部位中尼氏小體面積比例增加、MBP蛋白的相對(duì)表達(dá)量較SCI組均升高(均P<0.05)。以上結(jié)果表明，一定劑量的X線照射治療可減少神經(jīng)元細(xì)胞的損失、促進(jìn)髓鞘存活，從而促進(jìn)大鼠SCI后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。更重要的是，在各個(gè)X線照射組中SCI+10 Gy組的優(yōu)勢(shì)最顯著，這可能與大劑量X線的毒性作用有關(guān)[19]。

SCI發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被激活從而釋放炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。而炎癥反應(yīng)可以誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，故控制炎癥反應(yīng)是治療繼發(fā)性SCI的目標(biāo)之一[20]。此外，膠質(zhì)瘢痕可導(dǎo)致脊髓形成空腔病變從而阻礙中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的修復(fù)，所以抑制膠質(zhì)瘢痕形成也是治療繼發(fā)性SCI的目標(biāo)之一[21]。有研究表明，抑制損傷部位中GFAP和Vimentin的表達(dá)可以減少膠質(zhì)瘢痕的形成，從而改善損傷脊髓的神經(jīng)功能[4]。而X線照射可能通過(guò)一種不涉及細(xì)胞破壞的機(jī)制防止炎性因子上調(diào)而保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[15]。綜上，本研究從炎癥和膠質(zhì)瘢痕形成方面探討X線照射治療SCI的可能機(jī)制。結(jié)果顯示，大鼠SCI后脊髓中的炎癥因子、中間纖維蛋白的表達(dá)量均升高(P<0.05)，而各個(gè)X線照射組大鼠脊髓的炎癥因子、中間纖維蛋白的表達(dá)量均降低(P<0.05)。由此推測(cè)，X線照射治療可能是通過(guò)減輕炎癥、抑制膠質(zhì)瘢痕形成，從而減少脊髓空腔病變、神經(jīng)元細(xì)胞和髓鞘的損失，最終促進(jìn)SCI大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，X線照射治療可有效地改善SCI大鼠的神經(jīng)功能，其機(jī)制可能為通過(guò)抑制炎癥和膠質(zhì)瘢痕形成為神經(jīng)元存活和髓鞘再生提供有利的微環(huán)境。X線照射或可為治療SCI提供一種新的策略。