阮志平 林多茂 史魯云

(1 北京市朝陽區(qū)婦幼保健院麻醉科，北京市 100000,電子郵箱：et3842lzqx326@163.com；2 首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院，北京市 100000)

2020年女性乳腺癌首次取代肺癌，成為全球新發(fā)病例數(shù)最多的癌癥[1]。手術是治療乳腺癌的主要手段之一。而麻醉是乳腺癌患者手術治療過程中的一部分，其是否會影響患者的轉(zhuǎn)歸和預后，是否可以在手術時有針對性地選擇使用或者避免使用一些麻醉方法和麻醉藥物，以減少對乳腺癌患者的不利影響，甚至減少乳腺癌患者術后的轉(zhuǎn)移和復發(fā)，一直是麻醉醫(yī)生關注和研究的問題。右美托咪定作用于腦干藍斑核內(nèi)的α2腎上腺素受體，從而發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠的作用，并通過作用于藍斑和脊髓的α2腎上腺素受體，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用；同時其可降低交感神經(jīng)的活性、抑制去甲腎上腺素釋放，從而起到降低血壓的作用[2]。由于右美托咪定具有一定優(yōu)勢，如產(chǎn)生類似自然睡眠效果、易喚醒、呼吸抑制作用較弱、減輕應激反應、減少阿片類和麻醉藥物用量等，自上市以來得到了廣泛的使用。而且，由于其獨特的藥理學特性，歐美國家的一些研究將右美托咪定應用于美國食品藥品管理局規(guī)定以外的范圍，如兒科及神經(jīng)外科[3]。右美托咪定可抑制胰腺癌[4]、肝癌[5]等腫瘤細胞的增殖并促進其凋亡，且目前已有研究表明右美托咪定可減少乳腺癌患者認知功能障礙的發(fā)生,并減輕免疫反應[6]，但其對乳腺癌細胞生物學特性影響如何，有待進一步研究。

糖類抗原Tn最早于20世紀60年代被發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌、肺癌等多種腫瘤中均有表達，且已被證實與腫瘤的不良預后密切相關[7]。Tn是一種細胞間黏附的抑制因子，在體內(nèi)具有促進細胞遷移、誘導細胞增生、抑制細胞間黏附的作用，是一個與腫瘤侵襲有關的指標。腫瘤細胞膜上的糖脂和糖蛋白被認定為抗原(T抗原)，而Tn是T抗原的前體[8]；當細胞產(chǎn)生惡性變化時，細胞膜上糖脂發(fā)生糖基化或產(chǎn)生新糖基，從而產(chǎn)生Tn[9]。目前關于右美托咪定、乳腺癌細胞生物學特性與糖類抗原Tn水平三者之間的關系尚不明確。因此，本研究探討右美托咪定對乳腺癌細胞生物學特性和糖類抗原Tn表達的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞和組織標本來源 乳腺癌MCF-7細胞購自微蒙生物科技(上海)有限公司。選擇2019年11月至2020年11月于北京市朝陽區(qū)婦幼保健院治療的5例乳腺癌患者，留取其術后乳腺癌組織和癌旁組織(距離癌組織1.5 cm)標本，立即置于液氮中保存。所有患者組織標本均經(jīng)病理學診斷為乳腺癌，其中浸潤性導管癌3例,導管原位癌1例,小管癌1例，術前均未接受放化療。本研究經(jīng)北京市朝陽區(qū)婦幼保健院倫理委員會批準(批號：Y2019-011-03)，患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗試劑及儀器 右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H20090248)；胎牛血清(上海極威生物科技有限公司，編號：GV-168001)；RPMI-1640培養(yǎng)基(南京生航生物技術有限公司，貨號：BC-M-016)，完全培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：PM150421B-HR)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑(中國艾美捷科技有限公司，貨號：10009591-5)；膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)試劑(大連美侖生物技術有限公司，貨號：MA0220)；Transwell 小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；基質(zhì)膠(廣州合華科技有限公司，貨號：356234)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗、Tn抗體(上海滬崢生物科技有限公司，貨號：HS4316、HZK-10085)；辣根過氧化物酶標記的二抗(北京博爾西科技有限公司，貨號：BHR104)；細胞裂解液(上海吉至生化科技有限公司，貨號：AR0020)；蛋白提取試劑(上海博湖生物科技有限公司，貨號：BH-S63617)；增強型化學發(fā)光試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司，貨號：ECL-P-100)；總RNA提取試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，批號：SBJ-L0055)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海紅榮微再生物工程技術有限公司，批號：RR036A)；實時熒光PCR試劑盒(上海滬震實業(yè)有限公司，貨號：HZ-6028。)

1.3 實驗儀器 酶標儀(山東萊恩德智能科技有限公司，型號：LD-96A)；流式細胞儀(上海三崴醫(yī)療設備有限公司，型號：FACSVia)；顯微鏡(南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號：MS60)；顯影儀(濟南來寶醫(yī)療器械有限公司，型號：RZC-1202)；PCR儀(南京康維達生物科技有限公司，型號：QuantStudio 3)。

1.4 細胞培養(yǎng)及實驗分組 將乳腺癌MCF-7細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的高糖RPMI-1640培養(yǎng)基(含酚紅)培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。當細胞達80%～90%融合時傳代：用0.25%胰蛋白酶消化細胞，顯微鏡下觀察，當細胞形態(tài)變圓、連接松解時，立即加入含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心5 min，重懸細胞，以一傳二的比例傳代，取第3～5代細胞進行實驗。將第3～5代的乳腺癌MCF-7細胞以3×104個/mL接種于96孔板中，每孔200 μL，將細胞分為RX組(空白組)、YMD組(低劑量組)、YMZ組(中劑量組)、YMG組(高劑量組)，每組設置2個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在YMD組、YMZ組、YMG組的MCF-7細胞中加入20 μL的右美托咪定，使其終濃度分別為10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L，RX組細胞中加入20 μL的生理鹽水，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后進行相關指標的檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 MTT法檢測各組乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制率：收集各組細胞，將密度調(diào)整為3×104個/mL后接種到96孔板中，每孔200 μL， 加入RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，當細胞密度達到50%時，更換培養(yǎng)基；再培養(yǎng)48 h后加 MTT 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后使用酶標儀測490 nm處吸光度值，并計算增殖抑制率。設立空白孔，加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基進行調(diào)零。增殖抑制率=[1-加樣孔平均吸光度值/空白孔平均吸光度值]×100%。設2個復孔，實驗重復3次。

1.5.2 流式細胞儀檢測各組乳腺癌MCF-7細胞的凋亡情況：收集各組細胞，接種于6孔板中(2×105個/孔)，胰蛋白酶消化乳腺癌細胞后，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化；磷酸緩沖鹽溶液清洗細胞后進行細胞計數(shù)，1 250 r/min離心6 min，棄上清，加入500 μL 結合緩沖液重懸。加入 5 μL Annexin V-FITC混勻、 10 μL PI混勻，室溫避光孵育5～15 min，隨即放入流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。設2個復孔，實驗重復3次。

1.5.3 Transwell法檢測各組乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力：取出凍存的Matrigel基質(zhì)膠于4℃下過夜以溶膠。包被基底膜(冰上操作)，即用無血清的冷RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠使其濃度最終達到200 μg/mL，取100 μL稀釋膠加到24孔Transwell上室中，37℃孵育6 h。用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基輕洗凝膠，以水化基底膜。消化、重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5×106個/mL，上室加入200 μL細胞懸液，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。棉簽拭去上室底部膜表面的細胞。移去Transwell小室，倒置，風干?，F(xiàn)配結晶紫，每孔加入500 μL，將小室置于25℃染色30 min，磷酸緩沖鹽溶液清洗1次，晾干。顯微鏡下觀察每個樣本，連續(xù)選5個清晰視野進行計數(shù)，然后計算平均數(shù)。設2個復孔，實驗重復3次。

1.5.4 Transwell法檢測各組乳腺癌MCF-7細胞的遷移能力：取各組MCF-7細胞并饑餓12 h后，將細胞消化、離心重懸，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5×105個/mL，在Transwell小室下室中加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，Transwell小室上室加入100 μL無血清的細胞懸液，將Transwell小室置于37.2℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，4%甲醛固定小室，0.1%結晶紫溶液染色，用棉簽擦去上室底部膜表面細胞后觀察拍照。設2個復孔，實驗重復3次。

1.5.5 實時熒光PCR檢測Tn的mRNA在乳腺癌組織及細胞中的表達：取癌組織及癌旁組織標本各20 mg，將其剪碎、研磨、裂解液裂解后離心(800 r/min，5 min)，取上清液于試管中并置于-70℃冰箱中保存；收集各組乳腺癌細胞，使用胰蛋白酶消化后提取細胞懸液，沖洗，放于無菌試管中。采用TRIzol法提取組織細胞總RNA，檢測濃度和純度后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過Primer 5.0軟件設計引物，由吉林省奇健生物技術有限公司合成。Tn上游引物序列為5′-GGTACAGTGGGACAGCAGGTG-3′,下游引物序列為5′-GAGAGGATCTGCCATTGTGG-3′；內(nèi)參β-肌動蛋白上游引物序列為5′-CTC CATCCT GGCCTC GCT GT-3′,下游引物序列為5′-GCTGTC ACCTTCACC GTT CC-3′。配置10 μL的反應體系(2×Green Mix 5 μL、引物混合物0.6 μL、模板1 μL、DEPC水3.4 μL)。PCR反應條件為95℃預變性10 min，95℃變性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)40次。以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。設2個復孔，實驗重復3次。

1.5.6 蛋白免疫印跡法檢測各組細胞中Tn的蛋白表達：收集各組MCF-7細胞進行裂解后提取總蛋白，采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。將提取的蛋白溶液和緩沖溶液按照4 ∶1的比例進行混合后將其煮沸，使蛋白變性，以每孔上樣蛋白量20 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，條件為濃縮膠80V，分離膠120 V。電泳后配制轉(zhuǎn)印緩沖液并放入4℃冰箱內(nèi)預冷，經(jīng)電轉(zhuǎn)印將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗(1 ∶150)4℃孵育過夜，磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，10 min/次,最后加入二抗(1 ∶1 000),常溫孵育1.5 h。取出聚偏二氟乙烯膜用PBS漂洗3次，10 min/次。用增強型化學發(fā)光試劑曝光顯影3 min，用ImageJ軟件(北京柏奧易杰科技公司)分析條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，即為Tn蛋白的相對表達量。設2個復孔，實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制率和凋亡情況的比較 RX組、YMD組、YMZ組、YMG組的細胞增殖抑制率、細胞凋亡率均依次升高(均P<0.05)。見表1、圖1。

表1 4組乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制率和凋亡率的比較(x±s，%)

圖1 各組細胞凋亡情況

2.2 各組乳腺癌MCF-7細胞的侵襲和遷移能力的比較 (1)YMD、YMZ、YMG組侵襲細胞數(shù)量均少于RX組，且YMZ、YMG組侵襲細胞數(shù)量少于YMD組(均P<0.05)。見表2、圖2。(2)RX組、YMD組、YMZ組、YMG組遷移細胞數(shù)量依次降低(均P<0.05)。見表2、圖3。

表2 4組乳腺癌MCF-7細胞侵襲和遷移能力的比較(x±s，個)

圖2 各組細胞的侵襲情況(×400)

圖3 各組細胞的遷移能力(×400)

2.3 不同組織中Tn mRNA相對表達水平的比較 乳腺癌組織中Tn mRNA的相對表達量為2.14±0.25，高于癌旁組織的1.00±0.00(t=10.200，P<0.001)。

2.4 各組乳腺癌MCF-7細胞中Tn 的mRNA和蛋白相對表達情況的比較 RX組、YMD組、YMZ組、YMG組細胞中的Tn mRNA相對表達量依次降低(均P<0.05)。YMD、YMZ、YMG組Tn蛋白的相對表達量均低于RX組(均P<0.05)，YMZ、YMG組Tn蛋白相對表達量均低于YMD組(均P<0.05)。見表3和圖4。

表3 4組乳腺癌MCF-7細胞中Tn mRNA和蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖4 各組細胞中 Tn蛋白的表達情況

3 討 論

乳腺癌是乳腺上皮細胞在多種致癌因子的作用下發(fā)生異常增殖所導致的疾病，在早期表現(xiàn)為乳房腫塊等，晚期可因癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲等造成多種器官發(fā)生病變，嚴重威脅患者的生命健康[10-12]。乳腺癌細胞極易脫落于血液中并隨著血液及淋巴液傳播至全身，因此乳腺癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移[13-15]。

已有研究表明，右美托咪定對不同的腫瘤具有抑制作用。例如，羅栩偉等[16]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可抑制骨巨細胞瘤細胞增殖、遷移、侵襲；連紅梅等[17]發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡，并可抑制其遷移能力、侵襲能力；唐瑤[18]建立了卵巢癌大鼠模型，發(fā)現(xiàn)給予右美托咪定干預后卵巢癌大鼠的腫瘤體積明顯縮小，卵巢癌組織中的細胞出現(xiàn)不同程度死亡。本研究結果顯示，給予右美托咪定干預后，乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制率、凋亡率增高，侵襲、遷移細胞數(shù)量減少，且具有一定的劑量依賴性。由此可見，右美托咪定對乳腺癌的抑制作用與上述研究結果相似，不僅可抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，還可有效促進乳腺癌細胞的凋亡。因此，可在乳腺癌患者的手術中應用右美托咪定，其在發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時抑制癌細胞惡性行為，為乳腺癌的治療提供一定的價值。

Tn是一種腫瘤標志物,其可使機體受到刺激后產(chǎn)生免疫應答，并與免疫應答的產(chǎn)物結合引發(fā)免疫效應，導致機體免疫功能異常，從而引起甲狀腺炎等免疫疾病的發(fā)生[19-20]。有學者發(fā)現(xiàn)，糖類抗原Tn在心臟和動脈損傷、腫瘤的血管發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移，以及調(diào)節(jié)干細胞活動中具有關鍵作用[21-22]。Tn在人類許多腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達，能夠刺激腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞遷移[23]。本研究結果也顯示，Tn mRNA在乳腺癌組織中的表達水平高于癌旁組織。給予右美托咪定后，乳腺癌MCF-7細胞中Tn的mRNA和蛋白相對表達水平均降低，且中、高劑量的右美托咪定干預效果更為明顯(均P<0.05)。有研究顯示，通過激活細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化信號通路使糖類抗原Tn過表達，可以增強結腸癌細胞的侵襲能力及遷移能力[23]；而當給予糖類抗原Tn免疫佐劑或是與載體蛋白結合后，可使腫瘤細胞的增殖、擴散等受到阻礙[24]。結合上述研究結果，我們推測，右美托咪定可能是通過抑制糖類抗原Tn表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移并促進其凋亡，發(fā)揮抗乳腺癌的作用。

綜上所述，右美托咪定可抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲、遷移，并促進細胞凋亡，其或通過抑制糖類抗原Tn表達而發(fā)揮抗乳腺癌的作用。