阮志平 林多茂 史魯云

(1 北京市朝陽(yáng)區(qū)婦幼保健院麻醉科，北京市 100000,電子郵箱：et3842lzqx326@163.com；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京市 100000)

2020年女性乳腺癌首次取代肺癌，成為全球新發(fā)病例數(shù)最多的癌癥[1]。手術(shù)是治療乳腺癌的主要手段之一。而麻醉是乳腺癌患者手術(shù)治療過(guò)程中的一部分，其是否會(huì)影響患者的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，是否可以在手術(shù)時(shí)有針對(duì)性地選擇使用或者避免使用一些麻醉方法和麻醉藥物，以減少對(duì)乳腺癌患者的不利影響，甚至減少乳腺癌患者術(shù)后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，一直是麻醉醫(yī)生關(guān)注和研究的問(wèn)題。右美托咪定作用于腦干藍(lán)斑核內(nèi)的α2腎上腺素受體，從而發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠的作用，并通過(guò)作用于藍(lán)斑和脊髓的α2腎上腺素受體，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用；同時(shí)其可降低交感神經(jīng)的活性、抑制去甲腎上腺素釋放，從而起到降低血壓的作用[2]。由于右美托咪定具有一定優(yōu)勢(shì)，如產(chǎn)生類似自然睡眠效果、易喚醒、呼吸抑制作用較弱、減輕應(yīng)激反應(yīng)、減少阿片類和麻醉藥物用量等，自上市以來(lái)得到了廣泛的使用。而且，由于其獨(dú)特的藥理學(xué)特性，歐美國(guó)家的一些研究將右美托咪定應(yīng)用于美國(guó)食品藥品管理局規(guī)定以外的范圍，如兒科及神經(jīng)外科[3]。右美托咪定可抑制胰腺癌[4]、肝癌[5]等腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，且目前已有研究表明右美托咪定可減少乳腺癌患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)生,并減輕免疫反應(yīng)[6]，但其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響如何，有待進(jìn)一步研究。

糖類抗原Tn最早于20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌、肺癌等多種腫瘤中均有表達(dá)，且已被證實(shí)與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[7]。Tn是一種細(xì)胞間黏附的抑制因子，在體內(nèi)具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、誘導(dǎo)細(xì)胞增生、抑制細(xì)胞間黏附的作用，是一個(gè)與腫瘤侵襲有關(guān)的指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞膜上的糖脂和糖蛋白被認(rèn)定為抗原(T抗原)，而Tn是T抗原的前體[8]；當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生惡性變化時(shí)，細(xì)胞膜上糖脂發(fā)生糖基化或產(chǎn)生新糖基，從而產(chǎn)生Tn[9]。目前關(guān)于右美托咪定、乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性與糖類抗原Tn水平三者之間的關(guān)系尚不明確。因此，本研究探討右美托咪定對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性和糖類抗原Tn表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和組織標(biāo)本來(lái)源 乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)自微蒙生物科技(上海)有限公司。選擇2019年11月至2020年11月于北京市朝陽(yáng)區(qū)婦幼保健院治療的5例乳腺癌患者，留取其術(shù)后乳腺癌組織和癌旁組織(距離癌組織1.5 cm)標(biāo)本，立即置于液氮中保存。所有患者組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷為乳腺癌，其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌3例,導(dǎo)管原位癌1例,小管癌1例，術(shù)前均未接受放化療。本研究經(jīng)北京市朝陽(yáng)區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：Y2019-011-03)，患者均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20090248)；胎牛血清(上海極威生物科技有限公司，編號(hào)：GV-168001)；RPMI-1640培養(yǎng)基(南京生航生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：BC-M-016)，完全培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)：PM150421B-HR)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑(中國(guó)艾美捷科技有限公司，貨號(hào)：10009591-5)；膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)試劑(大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：MA0220)；Transwell 小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；基質(zhì)膠(廣州合華科技有限公司，貨號(hào)：356234)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗、Tn抗體(上海滬崢生物科技有限公司，貨號(hào)：HS4316、HZK-10085)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京博爾西科技有限公司，貨號(hào)：BHR104)；細(xì)胞裂解液(上海吉至生化科技有限公司，貨號(hào)：AR0020)；蛋白提取試劑(上海博湖生物科技有限公司，貨號(hào)：BH-S63617)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司，貨號(hào)：ECL-P-100)；總RNA提取試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)：SBJ-L0055)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海紅榮微再生物工程技術(shù)有限公司，批號(hào)：RR036A)；實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：HZ-6028。)

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀(山東萊恩德智能科技有限公司，型號(hào)：LD-96A)；流式細(xì)胞儀(上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：FACSVia)；顯微鏡(南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號(hào)：MS60)；顯影儀(濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：RZC-1202)；PCR儀(南京康維達(dá)生物科技有限公司，型號(hào)：QuantStudio 3)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的高糖RPMI-1640培養(yǎng)基(含酚紅)培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)傳代：用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)變圓、連接松解時(shí)，立即加入含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞，以一傳二的比例傳代，取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將第3～5代的乳腺癌MCF-7細(xì)胞以3×104個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔200 μL，將細(xì)胞分為RX組(空白組)、YMD組(低劑量組)、YMZ組(中劑量組)、YMG組(高劑量組)，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在YMD組、YMZ組、YMG組的MCF-7細(xì)胞中加入20 μL的右美托咪定，使其終濃度分別為10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L，RX組細(xì)胞中加入20 μL的生理鹽水，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 MTT法檢測(cè)各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制率：收集各組細(xì)胞，將密度調(diào)整為3×104個(gè)/mL后接種到96孔板中，每孔200 μL， 加入RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)，更換培養(yǎng)基；再培養(yǎng)48 h后加 MTT 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處吸光度值，并計(jì)算增殖抑制率。設(shè)立空白孔，加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)零。增殖抑制率=[1-加樣孔平均吸光度值/空白孔平均吸光度值]×100%。設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡情況：收集各組細(xì)胞，接種于6孔板中(2×105個(gè)/孔)，胰蛋白酶消化乳腺癌細(xì)胞后，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化；磷酸緩沖鹽溶液清洗細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，1 250 r/min離心6 min，棄上清，加入500 μL 結(jié)合緩沖液重懸。加入 5 μL Annexin V-FITC混勻、 10 μL PI混勻，室溫避光孵育5～15 min，隨即放入流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 Transwell法檢測(cè)各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力：取出凍存的Matrigel基質(zhì)膠于4℃下過(guò)夜以溶膠。包被基底膜(冰上操作)，即用無(wú)血清的冷RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠使其濃度最終達(dá)到200 μg/mL，取100 μL稀釋膠加到24孔Transwell上室中，37℃孵育6 h。用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基輕洗凝膠，以水化基底膜。消化、重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。棉簽拭去上室底部膜表面的細(xì)胞。移去Transwell小室，倒置，風(fēng)干?，F(xiàn)配結(jié)晶紫，每孔加入500 μL，將小室置于25℃染色30 min，磷酸緩沖鹽溶液清洗1次，晾干。顯微鏡下觀察每個(gè)樣本，連續(xù)選5個(gè)清晰視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后計(jì)算平均數(shù)。設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.4 Transwell法檢測(cè)各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移能力：取各組MCF-7細(xì)胞并饑餓12 h后，將細(xì)胞消化、離心重懸，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，在Transwell小室下室中加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，Transwell小室上室加入100 μL無(wú)血清的細(xì)胞懸液，將Transwell小室置于37.2℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，4%甲醛固定小室，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，用棉簽擦去上室底部膜表面細(xì)胞后觀察拍照。設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.5 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)Tn的mRNA在乳腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)：取癌組織及癌旁組織標(biāo)本各20 mg，將其剪碎、研磨、裂解液裂解后離心(800 r/min，5 min)，取上清液于試管中并置于-70℃冰箱中保存；收集各組乳腺癌細(xì)胞，使用胰蛋白酶消化后提取細(xì)胞懸液，沖洗，放于無(wú)菌試管中。采用TRIzol法提取組織細(xì)胞總RNA，檢測(cè)濃度和純度后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過(guò)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由吉林省奇健生物技術(shù)有限公司合成。Tn上游引物序列為5′-GGTACAGTGGGACAGCAGGTG-3′,下游引物序列為5′-GAGAGGATCTGCCATTGTGG-3′；內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白上游引物序列為5′-CTC CATCCT GGCCTC GCT GT-3′,下游引物序列為5′-GCTGTC ACCTTCACC GTT CC-3′。配置10 μL的反應(yīng)體系(2×Green Mix 5 μL、引物混合物0.6 μL、模板1 μL、DEPC水3.4 μL)。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)40次。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中Tn的蛋白表達(dá)：收集各組MCF-7細(xì)胞進(jìn)行裂解后提取總蛋白，采用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度。將提取的蛋白溶液和緩沖溶液按照4 ∶1的比例進(jìn)行混合后將其煮沸，使蛋白變性，以每孔上樣蛋白量20 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，條件為濃縮膠80V，分離膠120 V。電泳后配制轉(zhuǎn)印緩沖液并放入4℃冰箱內(nèi)預(yù)冷，經(jīng)電轉(zhuǎn)印將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗(1 ∶150)4℃孵育過(guò)夜，磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，10 min/次,最后加入二抗(1 ∶1 000),常溫孵育1.5 h。取出聚偏二氟乙烯膜用PBS漂洗3次，10 min/次。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影3 min，用ImageJ軟件(北京柏奧易杰科技公司)分析條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，即為Tn蛋白的相對(duì)表達(dá)量。設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡情況的比較 RX組、YMD組、YMZ組、YMG組的細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率均依次升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 4組乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率的比較(x±s，%)

圖1 各組細(xì)胞凋亡情況

2.2 各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移能力的比較 (1)YMD、YMZ、YMG組侵襲細(xì)胞數(shù)量均少于RX組，且YMZ、YMG組侵襲細(xì)胞數(shù)量少于YMD組(均P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。(2)RX組、YMD組、YMZ組、YMG組遷移細(xì)胞數(shù)量依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 4組乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移能力的比較(x±s，個(gè))

圖2 各組細(xì)胞的侵襲情況(×400)

圖3 各組細(xì)胞的遷移能力(×400)

2.3 不同組織中Tn mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較 乳腺癌組織中Tn mRNA的相對(duì)表達(dá)量為2.14±0.25，高于癌旁組織的1.00±0.00(t=10.200，P<0.001)。

2.4 各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Tn 的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)情況的比較 RX組、YMD組、YMZ組、YMG組細(xì)胞中的Tn mRNA相對(duì)表達(dá)量依次降低(均P<0.05)。YMD、YMZ、YMG組Tn蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于RX組(均P<0.05)，YMZ、YMG組Tn蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于YMD組(均P<0.05)。見(jiàn)表3和圖4。

表3 4組乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Tn mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖4 各組細(xì)胞中 Tn蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

乳腺癌是乳腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子的作用下發(fā)生異常增殖所導(dǎo)致的疾病，在早期表現(xiàn)為乳房腫塊等，晚期可因癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲等造成多種器官發(fā)生病變，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[10-12]。乳腺癌細(xì)胞極易脫落于血液中并隨著血液及淋巴液傳播至全身，因此乳腺癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移[13-15]。

已有研究表明，右美托咪定對(duì)不同的腫瘤具有抑制作用。例如，羅栩偉等[16]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可抑制骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲；連紅梅等[17]發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡，并可抑制其遷移能力、侵襲能力；唐瑤[18]建立了卵巢癌大鼠模型，發(fā)現(xiàn)給予右美托咪定干預(yù)后卵巢癌大鼠的腫瘤體積明顯縮小，卵巢癌組織中的細(xì)胞出現(xiàn)不同程度死亡。本研究結(jié)果顯示，給予右美托咪定干預(yù)后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率、凋亡率增高，侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)量減少，且具有一定的劑量依賴性。由此可見(jiàn)，右美托咪定對(duì)乳腺癌的抑制作用與上述研究結(jié)果相似，不僅可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，還可有效促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。因此，可在乳腺癌患者的手術(shù)中應(yīng)用右美托咪定，其在發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)抑制癌細(xì)胞惡性行為，為乳腺癌的治療提供一定的價(jià)值。

Tn是一種腫瘤標(biāo)志物,其可使機(jī)體受到刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物結(jié)合引發(fā)免疫效應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常，從而引起甲狀腺炎等免疫疾病的發(fā)生[19-20]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，糖類抗原Tn在心臟和動(dòng)脈損傷、腫瘤的血管發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移，以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞活動(dòng)中具有關(guān)鍵作用[21-22]。Tn在人類許多腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)，能夠刺激腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[23]。本研究結(jié)果也顯示，Tn mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織。給予右美托咪定后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Tn的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低，且中、高劑量的右美托咪定干預(yù)效果更為明顯(均P<0.05)。有研究顯示，通過(guò)激活細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化信號(hào)通路使糖類抗原Tn過(guò)表達(dá)，可以增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力及遷移能力[23]；而當(dāng)給予糖類抗原Tn免疫佐劑或是與載體蛋白結(jié)合后，可使腫瘤細(xì)胞的增殖、擴(kuò)散等受到阻礙[24]。結(jié)合上述研究結(jié)果，我們推測(cè)，右美托咪定可能是通過(guò)抑制糖類抗原Tn表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移并促進(jìn)其凋亡，發(fā)揮抗乳腺癌的作用。

綜上所述，右美托咪定可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其或通過(guò)抑制糖類抗原Tn表達(dá)而發(fā)揮抗乳腺癌的作用。