劉 佩 鐘 鳴 王 麗 陳 紅 梁 彬 陳壯麗 張婷婷

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧市 530022，電子郵箱1069925914@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥研究院，南寧市 530022；廣西中醫(yī)藥研究院3 藥理所，4 門診部，南寧市 530022)

睡眠占據(jù)著人類生命時(shí)間的1/3，是生命活動的重要組成部分，其受環(huán)境、精神、軀體疾病、藥物、心理等多種因素影響。失眠是以頻繁的入睡困難、睡眠難以維持為主要癥狀，癥狀超過1個(gè)月、頻率每周≥3 次，且影響日間功能活動的睡眠障礙[1]。良好的睡眠質(zhì)量是維持健康的基本保障[2]。然而，現(xiàn)代社會生活節(jié)奏緊張、各種壓力增大，失眠發(fā)病率越來越高，全世界失眠患病率為10%～20%[3]。

壯醫(yī)刺血療法是用刺血針淺刺人體穴位、病理反應(yīng)點(diǎn)或淺表血絡(luò)，再通過擠壓或拔罐放出適量血液，從而由表達(dá)里疏通龍路、火路氣機(jī)，達(dá)到治病目的的一種民族特色外治法[4]。陳紅等[5]研究發(fā)現(xiàn)，壯醫(yī)刺血療法對失眠惡性循環(huán)具有抑制作用。5-羥色胺是參與調(diào)節(jié)多種生理反應(yīng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，參與并維持慢波睡眠。陳紅等[6]進(jìn)一步觀察壯醫(yī)穴位刺血療法治療實(shí)熱型失眠癥患者的臨床療效，結(jié)果顯示壯醫(yī)穴位刺血療法可提高血漿5-羥色胺含量、降低去甲腎上腺素含量，有效地緩解失眠癥狀。腹腔注射對氯苯丙氨酸(para-chlorophenylalanine,PCPA)可阻斷5-羥色胺合成，是目前建立失眠動物模型較為常用的方法，具有操作較簡單、成功率高、成本相對較低、可重復(fù)性好等特點(diǎn)[7]。因此，本文通過腹腔注射 PCPA建立失眠大鼠模型，探討壯醫(yī)刺血療法改善失眠的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體級SD大鼠40只(雌雄各半)，體重(200±20)g，7周齡，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號：SCXK桂2020-0003)。實(shí)驗(yàn)在廣西中醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，動物飼養(yǎng)房溫度為24℃～26℃，給予足夠水和飼料，動物自由飲水與進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 地西泮片由上海上藥信誼藥廠有限公司生產(chǎn)(批號：14210101)，PCPA由美國Sigma 公司生產(chǎn)(批號：OK201412Y)，大鼠5羥色胺ELISA試劑盒(貨號：MM-0442R1)、大鼠去甲腎上腺素(norepin-ephrine，NE)ELISA試劑盒(貨號：MM-20302R1)、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)ELISA試劑盒(貨號：MM-0520R1)、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)ELISA試劑盒(批號：202007)、大鼠皮質(zhì)醇ELISA試劑盒(批號：202107)均購于廣州康凱信生物科技有限公司，一次性無菌針灸針(25 mm×13 mm)購自吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司(批號：W2105024)。全波長全自動多功能酶標(biāo)儀Multiskan GO購自賽默飛世爾公司，高速臺式離心機(jī)TGL-16B購自上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 失眠模型的建立 依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為空白組、模型組、壯醫(yī)刺血組、西藥組，每組10只(雌雄各半)，雌雄分籠、分組飼養(yǎng)，5只/籠。除空白組外，均采用腹腔注射PCPA混懸液建立失眠模型[8]：取適量碳酸氫鈉片溶于30℃～40℃溫水中，配成濃度為5%的碳酸氫鈉水溶液，將其緩慢滴入生理鹽水中，滴加的同時(shí)用pH試紙測試酸堿度至7～8之間，制備成弱堿性生理鹽水，將PCPA加入弱堿性生理鹽水中，并加入阿拉伯膠攪拌使其濃度為10%，超聲波處理20 min，配置PCPA混懸液濃度為50 mg/mL。大鼠用藥量為1 mL/100 g，1次/d，注射2 d。末次腹腔注射28～30 h后如大鼠出現(xiàn)睡眠晝夜節(jié)律消失、白天活動增加、體重增長緩慢、毛發(fā)無光澤且攻擊性強(qiáng)等與空白組大鼠明顯不同的表現(xiàn)，即提示造模成功[9]。注射PCPA混懸液后30 min內(nèi)，大鼠狀態(tài)安靜，觀察到腹部微微扭轉(zhuǎn)爬行，30 min后恢復(fù)正常；造模后觀察12 h，造模的3組大鼠頻繁雙腳站立，攀爬籠蓋、互相撲倒，靜臥時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于空白組，感受到燈光、聲音刺激警覺性增強(qiáng)，呈攻擊狀態(tài)，開始打斗，耳朵尾巴可見傷痕，30只大鼠均建模成功。

1.4 治療方法 造模成功后連續(xù)治療干預(yù)12 d?？瞻捉M：每日定時(shí)抓放大鼠。模型組：給予生理鹽水10 mL/kg灌胃，1次/d。壯醫(yī)刺血組：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]穴位圖譜定位，取大鼠大椎、至陽、心俞、肝俞穴位，剃毛、常規(guī)消毒后用淺刺針點(diǎn)刺后擠壓放血，1滴/穴，1次/2 d，共治療6次。西藥組：給予地西泮灌胃，使用前用生理鹽水稀釋至0.092 mg/mL，按10 mL/kg給藥，1次/d。

1.5 體重測量 建模第1天記錄大鼠基礎(chǔ)體重，治療干預(yù)結(jié)束后次日，取材前再次稱重，計(jì)算各組大鼠治療前后體重增長情況。

1.6 取材及指標(biāo)檢測 由于機(jī)體受到刺激首先反映到下丘腦CRH神經(jīng)元，因此檢測下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)激素時(shí)，選擇下丘腦組織標(biāo)本，其他激素則選擇血清標(biāo)本。自開始造模的第14日20點(diǎn)禁食禁水，治療干預(yù)結(jié)束后次日，9點(diǎn)處死各組大鼠，腹主動脈取血5 mL，轉(zhuǎn)存至-80℃冰箱待測，檢測時(shí)，血液自然放置10～20 min，3 000 r/min離心15 min，仔細(xì)收集上清液至新的PC管備用，采用ELISA法檢測血清皮質(zhì)醇、ACTH含量。大鼠斷頭取腦冰上分離下丘腦，按1 g ∶30 mL的比例加入一定量的磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4)，手工將標(biāo)本充分勻漿，3 000 r/min離心10 min，仔細(xì)收集上清液，存放于-80℃冰箱待檢，采用ELISA法檢測大鼠下丘腦5-羥色胺、NE、CRH含量。均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，若方差齊組間比較采用單因素方差分析，多重兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，若方差不齊校正方差后，采用方差分析；若不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)(四分位距)表示，比較采用非參數(shù)秩和H檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 干預(yù)后4組大鼠的一般狀態(tài)的比較 模型組與空白組大鼠狀態(tài)持續(xù)差異明顯。干預(yù)結(jié)束后次日，壯醫(yī)刺血組和西藥組大鼠晝夜節(jié)律基本恢復(fù)正常，對光、聲音敏感度下降，活動度、激惹度相比模型組減弱，狂躁?duì)顟B(tài)減輕，靜臥時(shí)間增加。

2.2 干預(yù)后4組大鼠的體重增長情況的比較 4組大鼠干預(yù)前后體重增長幅度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 干預(yù)后4組大鼠體重增長情況的比較[M(Q),g]

2.3 干預(yù)后4組大鼠下丘腦組織中的神經(jīng)遞質(zhì)含量的比較 與空白組相比，模型組大鼠下丘腦內(nèi) 5-羥色胺含量降低，而NE含量升高(均P<0.05)；與模型組相比較，西藥組、壯醫(yī)刺血組大鼠下丘腦內(nèi) 5-羥色胺含量升高，而NE含量降低(均P<0.05)；西藥組和壯醫(yī)刺血組大鼠下丘腦內(nèi)5-羥色胺和NE的含量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 干預(yù)后4組大鼠下丘腦5-羥色胺和NE含量的比較(x±s，ng/mL)

2.4 干預(yù)后4組大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)激素的含量的比較 與空白組相比，模型組大鼠下丘腦內(nèi)CRH和血清皮質(zhì)醇、ACTH含量均升高(均P<0.05)；與模型組相比，壯醫(yī)刺血組和西藥組大鼠下丘腦內(nèi)CRH和血清皮質(zhì)醇、ACTH含量均下降(均P<0.05)；與西藥組相比，壯醫(yī)刺血組下丘腦內(nèi)CRH含量和血清皮質(zhì)醇含量均降低(均P<0.05)。見表3。

3 討 論

壯醫(yī)刺血療法是具有壯醫(yī)特色的外治法之一，是廣西壯族地區(qū)家族代代相傳、使用甚廣的一種古老療法，其形成和發(fā)展受壯民生活習(xí)慣、文化習(xí)俗、氣候地理環(huán)境的影響，具有顯著的壯族民族和地域特點(diǎn)，是壯醫(yī)學(xué)的重要組成部分。壯醫(yī)稱失眠為“年鬧諾”“夜不寐”“巧塢病”，壯語中“年”為睡之意，“鬧”為不的意思，“年鬧諾”意譯為睡不著。壯醫(yī)將失眠的病機(jī)概括為陰陽失衡論、三氣不同步論、三道兩路不通論、臟腑骨肉失調(diào)論、氣血失衡論、毒虛致病論六大理論。思慮過度、情志內(nèi)傷、胃失和降傷及心和咪隆(脾)，以及巧塢(大腦)失養(yǎng)或驚恐、房勞傷及咪腰(腎)，均可導(dǎo)致心火熾盛、心腎不交、陰陽不調(diào)的失眠[11]。從壯醫(yī)學(xué)理論來看，壯醫(yī)刺血療法依據(jù)“血實(shí)宜決之”“治其病必先去其血”的治療原則，調(diào)補(bǔ)氣血、通調(diào)三道兩路、平衡陰陽的治療原理，可對失眠起到實(shí)則瀉之、恢復(fù)陰陽平衡的治療作用；現(xiàn)代研究也表明，壯醫(yī)刺血療法通過刺激體表微血管管壁神經(jīng)而改善微血管循環(huán)功能，從而加強(qiáng)機(jī)體組織器官的功能,提升免疫機(jī)能，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)，增強(qiáng)抗應(yīng)激能力[12-14]。由此可見，壯醫(yī)刺血療法可用于治療失眠。已有學(xué)者基于壯醫(yī)刺血平衡陰陽、激發(fā)調(diào)暢人體氣血、暢通三道兩路、同步三氣的治療原理，采用壯醫(yī)刺血療法治療失眠，并獲得一定的臨床效果[15]。本研究結(jié)果也顯示，干預(yù)結(jié)束后，壯醫(yī)刺血組大鼠的晝夜節(jié)律基本恢復(fù)正常，由失眠引起的不良癥狀也有所減輕，表明壯醫(yī)刺血療法治療失眠具有較好的效果。

5-羥色胺是一種可以改變?nèi)梭w生理功能如睡眠、食欲等的重要神經(jīng)遞質(zhì)。5-羥色胺能神經(jīng)元對睡眠覺醒有雙向調(diào)節(jié)作用,是非快速眼動睡眠的必備條件，既能促進(jìn)覺醒，又能協(xié)同NE觸發(fā)快速眼動睡眠[16]。有研究顯示，失眠模型大鼠腦內(nèi)的5-羥色胺水平已低于正常水平，故5-羥色胺是睡眠與覺醒的關(guān)鍵樞紐之一[17]。NE與覺醒呈正相關(guān)，NE水平低則睡眠覺醒少[18]。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠下丘腦內(nèi)5-羥色胺含量降低，而NE含量升高(均P<0.05)，符合上述失眠引起的神經(jīng)遞質(zhì)含量變化。人是一個(gè)有機(jī)整體，體內(nèi)也蘊(yùn)藏著天地人三部之氣，“巧塢”位于人體上部屬天，主宰全身各臟腑器官活動，調(diào)控人的視聽嗅覺和思維感覺，故神志思維方面的疾病都與“巧塢”密切相關(guān)[19]。本研究中，與模型組相比較，西藥組、壯醫(yī)刺血組大鼠下丘腦內(nèi)5-羥色胺含量升高，而NE含量降低(均P<0.05)。這提示壯醫(yī)刺血療法可以調(diào)節(jié)5羥色胺和NE等神經(jīng)遞質(zhì)，從而減少覺醒時(shí)間，改善失眠狀態(tài)，恢復(fù)“巧塢”正常生理功能，與西藥地西泮效果相當(dāng)。這一研究結(jié)果與陳紅等[5]臨床觀察結(jié)論相似。

下丘腦-垂體-腎上腺神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)是最原始的內(nèi)源性晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其活動受視交叉上核的調(diào)節(jié)，是機(jī)體對應(yīng)激刺激的反應(yīng)中樞[20]。當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)源性或外源性刺激時(shí)，會將刺激反應(yīng)信息匯聚于下丘腦為CRH神經(jīng)元，興奮下丘腦-垂體-腎上腺軸，進(jìn)而引起垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)[21]，隨即杏仁核被激活，CRH分泌增加，ACTH和皮質(zhì)醇的含量也隨之增加，從而導(dǎo)致覺醒效應(yīng)[22]。本研究顯示，與空白組相比，模型組大鼠下丘腦內(nèi)CRH和血清皮質(zhì)醇、ACTH含量均升高(均P<0.05)，失眠大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)激素的變化符合上述描述。本研究結(jié)果還顯示，與模型組相比，壯醫(yī)刺血組和西藥組大鼠下丘腦內(nèi)CRH和血清皮質(zhì)醇、ACTH含量均下降(均P<0.05)。這表明壯醫(yī)刺血療法治療失眠，可能與其緩解下丘腦-垂體-腎上腺軸過激現(xiàn)象，從而降低下丘腦內(nèi)CRH和血清皮質(zhì)醇、ACTH激素水平有關(guān)。

綜上所述，壯醫(yī)刺血療法治療失眠的作用，可能與緩解下丘腦-垂體-腎上腺軸過激從而降低下丘腦內(nèi)CRH和血清皮質(zhì)醇、ACTH激素水平，以及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)含量有關(guān)。但本研究僅從NE、5-羥色胺、下丘腦-垂體-腎上腺軸相關(guān)激素方面進(jìn)行了探討，今后將從更多層面著手更深入、全面地探索壯醫(yī)刺血療法療效的相關(guān)機(jī)制。