盧曉微 周智鵬 張輝陽 曾陽東 成 戈 蔣 宇 蘇夢瑤

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院放射科，廣西桂林市 541001，電子郵箱：lxwsally@163.com)

近年來，我國腦血管疾病的發(fā)病率逐漸上升，其中以缺血性腦血管病多見，缺血性腦血管病具有發(fā)病率高、病死率高的特點，嚴重危害人類健康[1]。腦缺血損傷的發(fā)生機制復雜，治療時間窗短，目前臨床治療效果不佳，腦缺血后神經(jīng)保護相關藥物的研究和開發(fā)一直是腦缺血研究領域的熱點和難點。近年來，隨著醫(yī)學、藥學以及相關學科的不斷發(fā)展，對腦缺血性疾病大規(guī)模的研究使得相關的治療方案和治療藥物不斷涌現(xiàn)，不過從目前的研究結(jié)果來看，很多藥物在動物實驗中有效，但是在臨床試驗中卻不成功[2-4]。尋找新的作用靶點和藥物對腦缺血的臨床治療有重要意義。非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B(glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B，GPNMB)在惡性黑色素瘤細胞等多種腫瘤細胞中表達，屬于一種腫瘤生長因子。有學者發(fā)現(xiàn)，腦缺血后小鼠的神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞分泌的GPNMB增多，該蛋白可能具有減少神經(jīng)細胞凋亡、保護神經(jīng)細胞的作用[5]。本研究進一步探討GPNMB對腦缺血再灌注小鼠的神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57小鼠20只，由桂林醫(yī)學院動物飼養(yǎng)中心提供(SYXK桂2020-0005)，體重200～250 g，采用普通小鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為屏障級動物實驗室。

1.2 藥劑與儀器 主要藥物有：異丙酚(AstraZeneca公司，批號：CL738)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS；北京生物制品研究所，國藥準字S10850002)。主要儀器和設備有：美國Intramedic公司PE-50管,Phillip公司INTEGRIS CV型數(shù)字血管造影系統(tǒng)。

1.3 動物分組與模型建立 按照隨機數(shù)字表法將20只小鼠分成PBS組和GPNMB組，每組10只。兩組小鼠均于術前24 h禁食，適量食水。使用10%的水合氯醛(350 mg/kg)進行腹腔麻醉后，送入介入手術間，將小鼠仰臥位固定在手術臺上，鼻飼給氧，給予常規(guī)心電、呼吸和血壓監(jiān)護，使用微量泵靜脈注射異丙酚0.13 mL/h維持麻醉狀態(tài)。于麻醉狀態(tài)下建立大腦中動脈栓塞模型：常規(guī)消毒頸部皮膚、備皮，切開皮膚，分離皮下組織和肌肉，暴露頸總動脈。結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，將準備好的7-0尼龍線從頸外動脈切口插入頸內(nèi)動脈，松開動脈夾，將絲線頭端進一步插至大腦中動脈開口處，建立大腦中動脈阻塞模型。恢復灌注后，行大腦中動脈正側(cè)位造影確認栓塞成功，造影劑為優(yōu)維顯，濃度為300 mg/mL，購自拜爾醫(yī)藥保健公司，經(jīng)頸外動脈注入。術前、術中和術后24 h監(jiān)測小鼠的呼吸、體溫、血壓和血氣等生理指標。

1.4 干預方法 栓塞成功2 h后撤出尼龍線進行再灌注2 h，GPNMB組經(jīng)栓塞側(cè)頸內(nèi)動脈注射4 μL的GPNMB(濃度為50 ng/μL)，PBS組經(jīng)栓塞側(cè)頸動脈注射等量的PBS后拔管、縫合包扎，再灌注24 h。

1.5 觀察指標

1.5.1 梗死體積：給藥干預再灌注24 h后，按照隨機數(shù)字表法每組取5只小鼠，處死小鼠后取腦組織行冠狀位切片，每片厚度為2 cm。然后行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色。將4 g TTC(美國,Sigma公司)粉末溶于200 mL的PBS溶液，染色15 min，翻面再染10～15 min，甲醛溶液固定后測量梗死面積。正常腦組織呈紅色，梗死組織呈蒼白，通過病理圖文分析系統(tǒng)進行圖像分析，測量每張切片的總面積和梗死面積，每層梗死體積為該層梗死面積和層厚的乘積，各層的梗死體積之和為總的梗死體積。計算梗死體積和對側(cè)正常腦組織的體積，其比值即為梗死率。

1.5.2 行為學觀察：取每組剩下的5只小鼠，進行行為學觀察。分別于栓塞成功2 h后撤出尼龍線進行再灌注2 h時與給藥干預再灌注24 h時，對小鼠進行行為學缺陷評分。評價標準參考相關文獻[6-7],評分為5分制，0分為無功能障礙，1分為不能伸展前肢，2分為向一側(cè)旋轉(zhuǎn)，3分為向一側(cè)傾倒，4分為無自主活動伴意識抑制，5分為死亡。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠腦梗死體積的比較 干預再灌注24 h后，PBS組的腦梗死體積為(116.2±32.5 )mm3，腦梗死率為37.98%，GPNMB組的腦梗死體積為(67.3±21.3)mm3，梗死率為16.97%，GPNMB組的腦梗死體積小于PBS組(t=2.471,P=0.025)。見圖1。

圖1 兩組小鼠腦梗死體積的比較(TTC染色，×5)

2.2 兩組小鼠行為學缺陷評分的比較 栓塞再灌注后2 h與給藥干預再灌注后24 h時，PBS組的行為學缺陷評分均高于GPNMB組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠行為學缺陷評分的比較(x±s，分)

3 討 論

急性缺血性腦卒中是一種因局限性腦缺血而突發(fā)的神經(jīng)功能障礙性疾病，以腦組織缺血及缺血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)，是全球人類致殘的首要病因，也是全球第二大死因，現(xiàn)已成為我國首要死因[1]。

GPNMB是一種由572個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，是一種腫瘤生長因子，又被稱為骨活素、樹突細胞肝素整合素配體、造血干細胞生長因子誘導神經(jīng)肽Ⅰ型[8]，在多種細胞中都有表達，如皮膚基底層細胞、免疫細胞、成骨細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞、神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞[9-10]。GPNMB具有多種作用，其在腫瘤細胞中表達，可以調(diào)節(jié)腫瘤的侵犯和轉(zhuǎn)移能力，抑制免疫系統(tǒng)，減少細胞凋亡，并有誘導血管再生，增強細胞黏附等作用，從而參與黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的生長[5,11-13]。外源性的重組GPNMB可以增加小鼠成纖維細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶3的表達，其機制可能是激活了細胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑，參與細胞保護和炎癥調(diào)節(jié)[14]。有學者發(fā)現(xiàn)，正常小鼠尿液中GPNMB表達水平極低，但腎缺血模型小鼠尿液中GPNMB的表達水平升高，且主要表達于巨噬細胞和上皮細胞內(nèi)，參與細胞吞噬和炎癥反應[15]。還有研究表明，GPNMB陽性表達的巨噬細胞具有更強的吞噬作用，以及清除壞死細胞碎片的能力，同時還分泌一些組織因子，對壞死組織的再生有明顯促進作用[16-17]。以上研究表明，GPNMB可以通過參與炎癥反應的調(diào)控、減少細胞死亡，參與腎缺血后的細胞保護機制。

Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，GPNMB除了存在于膠質(zhì)瘤細胞外，在正常神經(jīng)系統(tǒng)的細胞內(nèi)也有表達，其主要由小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞合成和分泌，可通過激活T淋巴細胞、促進其增殖；GPNMB可促進巨噬細胞浸潤和吞噬細胞碎片，從而促進細胞的自噬參與免疫與炎癥反應；GPNMB可能是神經(jīng)系統(tǒng)疾病一個新的治療靶點。還有研究結(jié)果顯示，GPNMB可以刺激巨噬細胞表達炎癥相關基因，發(fā)揮抗炎作用，從而起到神經(jīng)保護作用，由此可以推測GPNMB可作為神經(jīng)保護藥物的作用靶點[13,15,18-20]。Murata等[21]研究發(fā)現(xiàn)，GPNMB基因攜帶小鼠的記憶力優(yōu)于非攜帶小鼠，而且其海馬區(qū)域的離子型谷氨酸受體水平升高，這提示GPNMB可以促進海馬區(qū)離子型谷氨酸受體的表達，達到增強記憶的作用，故其認為GPNMB與神經(jīng)細胞代謝及腦功能有關。還有研究結(jié)果顯示，GPNMB在運動神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中均有表達，在肌萎縮性側(cè)索硬化癥患者腦脊液中的表達增高，高水平的GPNMB可以減輕運動神經(jīng)元的變性和萎縮，其作用機制與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶和絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)信號通路的激活有關，而該信號通路可以抑制神經(jīng)細胞凋亡，保護神經(jīng)細胞[22]。Nakano等[5]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后，小鼠神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞分泌的GPNMB增多，GPNMB可以激活ERK1/2和蛋白激酶B信號通路，從而減少神經(jīng)細胞凋亡、保護神經(jīng)細胞，縮小缺血后的腦梗死體積，這提示GPNMB可以作為腦缺血治療的新靶點。

本研究結(jié)果顯示，GPNMB組小鼠腦梗死體積小于PBS組，且栓塞再灌注后2 h、給藥干預再灌注后24 h時小鼠的行為學缺陷評分均低于PBS組(均P<0.05)，這提示GPNMB可以改善腦缺血再灌注小鼠的神經(jīng)功能缺血的癥狀。這一結(jié)果為GPNMB應用于腦缺血治療提供更多的理論基礎，但GPNMB神經(jīng)保護作用機制如何，其通過哪些信號通路發(fā)揮作用，還有待進一步研究。

綜上所述，GPNMB可以縮小腦缺血再灌注小鼠的腦梗死體積，并改善其梗死后行為學缺陷，但其具體的作用機制還有待進一步研究。