趙云博， 王寧?kù)o， 胡永員， 牛永潔， 孟永宏

(1.陜西海斯夫生物工程有限公司，陜西 楊凌 712199； 2.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119)

隨著我國(guó)居民對(duì)肉制品日益增長(zhǎng)的需求，我國(guó)的養(yǎng)殖規(guī)模也在不斷擴(kuò)大，但是如果養(yǎng)殖環(huán)境差、技術(shù)水平低，易引發(fā)飼養(yǎng)的動(dòng)物炎癥。飼養(yǎng)動(dòng)物發(fā)生炎癥，不僅造成其能量損失[1]，而且會(huì)引發(fā)大規(guī)模傳染，增加飼養(yǎng)動(dòng)物病死率，養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益受影響。同時(shí)，患病動(dòng)物也會(huì)對(duì)國(guó)民健康造成危害。因此，篩選有效抗炎的天然成分以抑制飼養(yǎng)動(dòng)物炎癥已成為養(yǎng)殖行業(yè)的重要課題[2-4]。

植物甾醇(Phytosterol，PS)是天然類固醇化合物，主要來(lái)源于植物油、植物種子和豆類產(chǎn)品[5-6]。《飼料添加劑品種目錄(2013)》中植物甾醇可作為飼料添加劑使用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)天然成分植物甾醇的體外抗炎功效做了大量研究，如：Caroprese等[2]研究揭示了植物甾醇對(duì)體外免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性的有益作用；Vilahur[3]、Fraile[7]等分別在綿羊和豬的體外研究中發(fā)現(xiàn)，植物甾醇可以增加外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的數(shù)量，從而提升動(dòng)物抗炎活性；于學(xué)珍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇凝膠對(duì)小鼠燒傷部位有抗炎作用，可減小潰瘍面積，減少炎癥細(xì)胞滲出。但上述研究主要在細(xì)胞水平上證實(shí)植物甾醇的抗炎作用，并且側(cè)重于研究植物甾醇的治療作用，而植物甾醇在生物體水平的預(yù)防炎癥效果和作用機(jī)制依然缺乏。

本研究利用脂多糖誘導(dǎo)小鼠發(fā)生炎癥，研究植物甾醇對(duì)小鼠血清炎癥因子，肝臟、脾臟組織病理學(xué)損傷，免疫組化，促炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄及通路蛋白表達(dá)的影響，揭示植物甾醇抗炎作用機(jī)制，為以植物甾醇為原料開(kāi)發(fā)新型抗炎產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)，并以期通過(guò)天然抗炎成分植物甾醇的推廣使用，提高養(yǎng)殖業(yè)利潤(rùn)，保障國(guó)民健康。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性SPF級(jí)KM小鼠，西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)SYXK(陜)2020-005)；小鼠顆粒型日糧維持飼料，河南天馳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料廠；植物甾醇(純度≥95%)，陜西海斯夫生物工程有限公司；脂多糖(LPS)、地塞米松(DXMS)、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)以及白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的ELISA試劑盒，北京索萊寶公司；蘇木精-伊紅(HE)染液，武漢賽維爾生物科技有限公司；Trizol，Invitrogen公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；一氧化氮合酶(iNOS)抗體，Bioss公司；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、NF-κB p65蛋白、NF-κB 磷酸化p65(Pp65)蛋白、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒、Tunel染色試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜，Merck Millipore公司。

Thermo1500全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Sigma高速離心機(jī)，BioRad ELITE300電泳儀，Light Cycler Nano 熒光定量PCR儀，TANON 5200MULTI顯影儀，DMi8AUTOL MATED倒置顯微鏡，Veriti 96 Well 梯度PCR儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

將50只體重為(22±2)g的雄性SPF級(jí)KM小鼠平均分成5組，分別記為空白對(duì)照組、脂多糖對(duì)照組、植物甾醇低劑量組、植物甾醇高劑量組、地塞米松組。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食及飲水，3～4只/籠分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，室溫(20±2)℃，相對(duì)濕度40%～70%，每日明暗比12 h/12 h。適應(yīng)性飼喂5 d，然后進(jìn)行灌胃給藥，其中：空白對(duì)照組與脂多糖對(duì)照組灌胃0.5 mL 4%吐溫80溶液；植物甾醇低、高劑量組分別灌胃0.5 mL植物甾醇4%吐溫80溶液，使最終的植物甾醇灌胃劑量分別達(dá)到20、200 mg/kg；地塞米松組灌胃0.5 mL地塞米松4%吐溫80溶液，對(duì)應(yīng)地塞米松灌胃劑量為5 mg/kg。每日灌胃1次，連續(xù)7 d，最后1 d斷水?dāng)嗉Z，于最后一次灌胃1 h后，空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.5 mL，其余4組注射0.5 mL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的脂多糖。脂多糖處理6 h后，觀察小鼠狀態(tài)，待確認(rèn)小鼠建模成功后，采血后處死小鼠并進(jìn)行解剖，采集脾臟、肝臟，稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)；5組各選1例制作石蠟切片，用于組織病理學(xué)和免疫組化分析；剩余保存于-80℃，用于目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄和目的蛋白表達(dá)分析。

1.2.2 ELISA試劑盒檢測(cè)血清中相關(guān)炎癥因子

將血漿離心后得到血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α檢測(cè)。

1.2.3 HE染色法觀察肝臟、脾臟組織病理學(xué)

將肝臟和脾臟部分制作石蠟切片后進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察肝臟和脾臟組織的病理學(xué)變化。

1.2.4 免疫組化法檢測(cè)肝臟及脾臟的iNOS表達(dá)

參考繆福俊等[9]的方法對(duì)石蠟切片進(jìn)行染色和處理，采用Olym-pusDP-71圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照，其中陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，每張切片從(400×)的視野中隨機(jī)取樣5次，采用Image-ProPlus軟件計(jì)算分析每個(gè)視野中iNOS陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的平均光密度值。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)肝臟及脾臟中iNOS和SHP-1的mRNA轉(zhuǎn)錄

參考Rizzi等[10]的方法，iNOS、SHP-1和β-actin引物用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中iNOS引物序列(參考基因序列號(hào)NC_000077.7)、SHP-1引物序列(參考基因序列號(hào)NM_013545.3)見(jiàn)表1。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

表1 iNOS、SHP-1和β-actin基因引物序列

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)肝臟中NF-κB p65蛋白和磷酸化p65蛋白的表達(dá)

參考丁程程等[11]的方法，將孵育至PVDF膜上的蛋白顯色后，使用成像設(shè)備掃描蛋白條帶并用Image lab軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行分析，目的蛋白以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行校正。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，使用SPSS 17.0中的單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用LSD法檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，用Graphpad Prism5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物甾醇對(duì)小鼠體重與肝臟指數(shù)的影響(見(jiàn)表2)

表2 植物甾醇對(duì)小鼠體重與肝臟指數(shù)的影響

脂多糖是研究由細(xì)菌感染引起炎癥反應(yīng)的理想模型[12]，常用作甾體藥物抗炎實(shí)驗(yàn)的致炎因子。地塞米松是常用的抗炎類甾體藥物，與植物甾醇結(jié)構(gòu)類似[13]。經(jīng)脂多糖造模6 h后，可觀察到脂多糖對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)變?nèi)?，聚堆抱團(tuán)，而空白對(duì)照組與其他各處理組小鼠精神狀態(tài)良好，具有良好活力，說(shuō)明造模成功。由表2可知，脂多糖對(duì)照組小鼠肝臟指數(shù)相較空白對(duì)照組增加了4.66%，與脂多糖對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)預(yù)飼喂植物甾醇小鼠肝臟指數(shù)降低(差異不顯著，P>0.05)，且相比于植物甾醇低劑量組，植物甾醇高劑量組肝臟指數(shù)降低更多，證明炎癥有所減輕，而地塞米松組小鼠肝臟指數(shù)相比其他組顯著升高，可能與飼喂地塞米松顯著降低了小鼠的體重有關(guān)。

2.2 植物甾醇對(duì)小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的影響(見(jiàn)表3)

表3 植物甾醇對(duì)小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響 ng/L

炎癥的發(fā)生和促進(jìn)主要由免疫細(xì)胞驅(qū)動(dòng)[14]，所以由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的相關(guān)炎癥因子可以反映炎癥的嚴(yán)重程度。IL-1β、IL-6、TNF-α參與了炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)和抗炎指標(biāo)[15]。由表3可以看出：與空白對(duì)照組比較，脂多糖對(duì)照組小鼠血清中的炎癥因子含量極顯著升高(P<0.01)；與脂多糖對(duì)照組相比，植物甾醇低、高劑量組小鼠炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)降低，且高劑量組降低更多，相比于脂多糖對(duì)照組分別降低了54.75%、60.12%、63.50%，說(shuō)明植物甾醇可有效降低炎癥的損害程度。

2.3 植物甾醇對(duì)小鼠肝臟、脾臟組織形態(tài)的影響

圖1為小鼠肝臟、脾臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果。

注：A.空白對(duì)照組；B.脂多糖對(duì)照組；C.植物甾醇低劑量組；D.植物甾醇高劑量組；E.地塞米松組。下同

由圖1可知：空白對(duì)照組小鼠的肝臟組織、肝血竇及中央靜脈細(xì)胞無(wú)明顯形態(tài)改變，肝細(xì)胞輪廓清晰；經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)，小鼠肝細(xì)胞腫脹且部分細(xì)胞核染色加深；植物甾醇低、高劑量組與地塞米松組小鼠的腫脹肝細(xì)胞數(shù)目明顯減少，肝細(xì)胞細(xì)胞核邊界明顯。脾臟組織病理學(xué)觀察顯示，空白對(duì)照組小鼠脾臟組織無(wú)明顯病理學(xué)變化，脂多糖誘導(dǎo)后小鼠脾臟白髓異常增生，生發(fā)中心出現(xiàn)，植物甾醇低劑量組小鼠依然可見(jiàn)白髓和生發(fā)中心，但相比脂多糖對(duì)照組有所改善，植物甾醇高劑量組和地塞米松組小鼠白髓增生明顯減輕，接近空白對(duì)照組。病理學(xué)觀察結(jié)果顯示飼喂植物甾醇后可以有效抑制炎癥導(dǎo)致的小鼠內(nèi)臟損傷。

2.4 植物甾醇對(duì)小鼠肝臟、脾臟中iNOS表達(dá)的影響(見(jiàn)表4、圖2)

表4 植物甾醇對(duì)小鼠肝臟、脾臟中iNOS 基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平、平均光密度值的影響

圖2 小鼠肝臟、脾臟iNOS基因分布(400×)

在正常生理?xiàng)l件下，iNOS一般不表達(dá)或低表達(dá)，但是發(fā)生炎癥后會(huì)在巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞中分泌[16]。鄭海崇等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肺部發(fā)生炎癥感染時(shí)，可以通過(guò)抑制iNOS表達(dá)來(lái)抑制炎癥因子的分泌。因此，組織內(nèi)的iNOS可以反映炎癥的發(fā)生情況。

由表4可知：植物甾醇對(duì)經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠的肝臟和脾臟中iNOS基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平有一定的抑制作用，且植物甾醇高劑量組的抑制效果更好；相較于脂多糖對(duì)照組，植物甾醇高劑量組小鼠的肝臟和脾臟中iNOS轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低(P<0.01)，分別降低了39.85%、56.05%。由圖2可以看出，5組小鼠肝臟細(xì)胞中出現(xiàn)了不同程度的iNOS陽(yáng)性染色，主要出現(xiàn)在肝血竇，破裂的細(xì)胞周邊區(qū)域也有少量。脾臟組織的白髓區(qū)有較為明顯的陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)，脾臟血管中也有部分陽(yáng)性信號(hào)，植物甾醇高劑量組與地塞米松組iNOS陽(yáng)性信號(hào)相對(duì)降低。相比于脂多糖對(duì)照組，植物甾醇低、高劑量組小鼠肝臟和脾臟iNOS平均光密度值極顯著降低(P<0.01)，且高劑量組降低更多，較脂多糖對(duì)照組分別降低了70.62%、48.70%，鏡下可明顯觀察到植物甾醇處理對(duì)炎癥的減輕有明顯效果。

2.5 植物甾醇對(duì)小鼠NF-κB p65蛋白和磷酸化p65蛋白水平的影響(見(jiàn)表5、圖3)

表5 小鼠肝臟中NF-κB p65蛋白和Pp65蛋白水平 ng/L

圖3 小鼠肝臟中NF-κB p65蛋白和Pp65蛋白的表達(dá)

NF-κB幾乎存在于所有動(dòng)物中，當(dāng)受到外界刺激時(shí)NF-κB與其抑制蛋白IκB分離并磷酸化產(chǎn)生活性，是體內(nèi)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵一環(huán)[18]。iNOS是NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[19]。因此，NF-κB p65蛋白和磷酸化p65(Pp65)蛋白的表達(dá)情況可以反映小鼠炎癥的程度。由表5可知，與空白對(duì)照組相比，脂多糖對(duì)照組小鼠的p65蛋白及Pp65蛋白水平極顯著升高(P<0.01)，分別升高180.6%和94.6%。與脂多糖對(duì)照組相比，植物甾醇低、高劑量組小鼠肝臟組織中p65蛋白及Pp65蛋白水平顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)降低，證明炎癥發(fā)展程度更低，圖3也直觀地證明了該結(jié)論。

2.6 植物甾醇對(duì)小鼠肝臟、脾臟SHP-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響(見(jiàn)表6)

SHP-1是許多信號(hào)通路中必不可少的調(diào)節(jié)分子，免疫反應(yīng)過(guò)程中其功能涉及先天免疫和適應(yīng)性免疫，可以抑制NF-κB等因子的活化，在抗炎癥方面發(fā)揮了重要作用[20-21]。由表6可以看出，與脂多糖對(duì)照組相比，植物甾醇低、高劑量組小鼠肝臟、脾臟SHP-1基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高(P<0.01)，且高劑量組與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，表明植物甾醇可以顯著提高小鼠的抗炎能力，控制炎癥發(fā)展。

表6 在小鼠肝臟、脾臟中SHP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平

2.7 討論

Gupta等[22]首次發(fā)現(xiàn)天然活性物質(zhì)植物甾醇的抗炎能力后，其他科研人員在細(xì)胞水平上做了很多驗(yàn)證。通過(guò)分析已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，植物甾醇的生物活性都是基于植物甾醇與膽固醇競(jìng)爭(zhēng)抑制進(jìn)入機(jī)體后發(fā)生的，其主要抗炎機(jī)制在于抑制NF-κB p65蛋白及其磷酸化，其原因是攝入植物甾醇后，提升了法尼醇X受體(FXR)/SHP-1合成膽汁酸通路的表達(dá)水平[23]，其中SHP-1又可作為NF-κB的上游負(fù)調(diào)控因子，因此結(jié)合本文研究結(jié)果推測(cè)，SHP-1的升高抑制NF-κB激活，進(jìn)而降低iNOS表達(dá)水平，抑制下游炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的生成，從而降低炎癥對(duì)機(jī)體器官的損害，對(duì)炎癥發(fā)生起到預(yù)防作用。

相比于白藜蘆醇、大蒜素、?；撬岷桶倮锵惴拥染哂幸种蒲装Y作用的天然活性物質(zhì)，植物甾醇具有更加全面的生理功能。白藜蘆醇通過(guò)抑制MAPK蛋白激酶減輕炎癥對(duì)肝臟的損傷[24]。大蒜素通過(guò)提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，抑制 IL-6的分泌發(fā)揮抗炎作用[25]。?；撬嶂饕ㄟ^(guò)內(nèi)皮依賴性和非依賴性機(jī)制誘導(dǎo)血管擴(kuò)張，減少炎癥對(duì)內(nèi)皮損傷[26]。百里香酚的主要作用器官多為乳腺、子宮等雌性特有器官[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)植物甾醇不僅抗炎效果顯著，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其還具有良好的促進(jìn)生長(zhǎng)效果，機(jī)制明確，有更廣泛的應(yīng)用范圍。

3 結(jié) 論

研究了植物甾醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠炎癥的抑制作用。結(jié)果表明，植物甾醇可提高飼養(yǎng)小鼠的抗炎能力，通過(guò)抑制炎癥發(fā)展降低炎癥導(dǎo)致的器官損傷，可在我國(guó)養(yǎng)殖行業(yè)全面替代抗生素方面發(fā)揮重要作用。