鄧志英， 龍景新， 顧 暉， 唐吉偉， 皮 倩

［湖南省腦科醫(yī)院（湖南省第二人民醫(yī)院），湖南長沙410007］

抑郁癥是全球范圍內(nèi)殘疾的主要原因之一，其在精神病學上涉及情緒障礙和認知障礙，持續(xù)的認知障礙嚴重影響抑郁癥患者的身心健康，是影響抑郁癥治療及預后的主要因素之一［1］。抑郁癥給社會以及家庭帶來嚴重的經(jīng)濟負擔，雖已有相應的治療方法，但療效低，復發(fā)率較高，因此改善認知功能障礙可能是抑郁癥治療的一個有效治療方向［2］。但目前抑郁癥認知障礙的病理及治療機制還未明確，所以，有必要對其進行深入了解。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）作為一個有效的選擇性α2 受體激動劑，是一種常見的鎮(zhèn)靜麻醉藥，有研究表明，其可預防抑郁大鼠電休克療法造成的學習和記憶障礙，具有認知保護作用，但關于其對抑郁癥認知功能改善的機制研究甚少［3-4］。自噬是細胞對不良環(huán)境的保護機制，其已被證明參與帕金森氏癥和阿爾茲海默癥等疾病認知功能障礙的發(fā)生。研究顯示，激活自噬可改善老齡大鼠認知障礙［5］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，Sirt1）/叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1）作為一條自噬相關通路，在多種腦損傷疾病中具有神經(jīng)保護作用［6-7］；除此之外，有研究表明，激活該通路可減輕抑郁癥小鼠的抑郁行為［8］。DEX 是否可能通過調(diào)控Sirt1/FOXO1介導的自噬通路影響抑郁癥認知功能還未可知，由于抑郁癥大鼠病理特征與人類抑郁癥的病理特征相同，因此本研究通過構建抑郁癥大鼠模型，探究DEX 調(diào)控Sirt1/FOXO1 介導的自噬通路對抑郁癥大鼠認知功能的影響，以期為DEX 在抑郁癥認知功能中的作用機制研究提供依據(jù)。

材料和方法

1 動物

將從三峽大學所購買的50 只雄性SD 大鼠（SPF級，8 周齡），235～280 g，于12 h 明暗交替環(huán)境下飼養(yǎng)7 d，許可證號為SCXK（鄂）2017-0012。

2 主要試劑

右美托咪定（國藥準字H20133331，規(guī)格1 mL：0.1 mg，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；EX527（CSN10146-25 mg，CSNpharm，Inc.）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（G1120-100，北京祥生興業(yè)科技有限公司）；總蛋白提取試劑盒（MB12716，北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司）；BCA試劑盒［UBI2001，攸碧艾（上海）貿(mào)易有限公司］；兔抗Sirt1、FOXO1、GAPDH、LC3-Ⅱ/-Ⅰ和beclin-1抗體、Anti-rabbit IgG 及HRP-linked Antibody（Cell Signaling Technology）。

3 主要方法

3.1 分組與抑郁癥模型構建 隨機選取10 只作為對照（control）組，其余大鼠以10 只每組隨機分為模型（model）組、DEX 低劑量（low dose of DEX，DEX-L）組（2.5 μg/kg DEX）、DEX 高劑量（high dose of DEX，DEX-H）組（10 μg/kg DEX）［9］及DEX-H+EX-527 組（10 μg/kg DEX+50 μg/kg SIRT1抑制劑EX527）［10］，通過慢性不可預知溫和刺激構建抑郁癥模型：連續(xù)56 d，每天隨機給予大鼠一種刺激，刺激包括24 h傾斜、5 min 強迫性游泳（45 ℃）、5 min 強迫性游泳（4 ℃）、24 h 禁食、24 h 潮濕環(huán)境、1 h 束縛、24 h 禁水、1 min夾尾、晝夜顛倒和5 min振蕩［11］，DEX-L組、DEX-H 組及DEX-H+EX-527 組大鼠于第29 天起進行腹腔注射相應劑量藥物，對照組及模型組注射等量生理鹽水，每天1次，共28 d。

3.2 糖水偏好實驗 糖水偏好實驗開始前在每個籠中放置兩瓶1%糖水，24 h 后將其中一瓶更換為純水，繼續(xù)24 h 后結束適應訓練；大鼠禁水禁食24 h 后進行糖水偏好實驗：每個籠中分別放置1 瓶1%糖水（20 mL）和1 瓶純水（20 mL），自由飲水24 h，計算糖水偏愛度（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%。

3.3 大鼠行為學觀察

3.3.1 強迫游泳實驗 將大鼠預先放入透明圓柱桶（高50 cm，直徑25 cm）中，于實驗前1 d 強迫游泳15 min，隨后放回籠中，次日再次強迫游泳5 min，實驗結束后記錄5 min 內(nèi)強迫游泳不動時間（forced swimming immobility time，F(xiàn)SIT）。

3.3.2 曠場實驗 將大鼠放入100 cm×100 cm×30 cm 的觀察箱中，使用曠場實驗視屏分析系統(tǒng)記錄大鼠3 min內(nèi)穿越觀察箱底部的方格數(shù)（身體的50%以上進入格中），即水平運動得分和大鼠直立次數(shù)（兩個前肢離開底部）記為垂直運動得分，每只大鼠實驗結束后將觀察箱用75%乙醇擦拭干凈，避免干擾后續(xù)大鼠實驗。

3.3.3 Morris 水迷宮實驗 將一個距離水面3 cm的黑色圓形平臺（直徑12 cm，高22 cm）放入底部均等劃分成4 個象限的水迷宮水池（高50 cm，直徑150 cm，水深25 cm）中，平臺到第一象限池壁的距離為35 cm；將小鼠從第三象限放入池中，將其引導至平臺上停留20 s，再推入水中尋找平臺，訓練5 d（每天4 次），計算機攝像系統(tǒng)觀察大鼠運動軌跡，第6 天取出平臺，記錄穿越平臺次數(shù)和逃避潛伏期（入水中至到找平臺的時間），用于評估大鼠認知功能。

3.4 HE 和尼氏（Nissl）染色分別觀察大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況 行為學實驗結束后，將其中5 只大鼠經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉后，取其海馬組織，一部分海馬組織浸于多聚甲醛中固定，經(jīng)過脫水后浸蠟包埋，連續(xù)冠狀切片（4 μm），HE染色后光鏡下觀察；另一部分用于Nissl 染色：將所剩余海馬組織進行低溫冷凍，制作冰凍切片，二甲苯脫蠟后無水乙醇脫水，焦油紫染色（0.1%）后使用鹽酸-乙醇分色，經(jīng)脫水透明后使用中性樹膠進行封片（×400），于顯微鏡下選取CA1區(qū)5個視野進行神經(jīng)元計數(shù)（n=5）。

3.5 Western blot 檢測大鼠海馬組織中Sirt1/FOXO1通路相關蛋白、LC3 和beclin-1 的表達情況 將其余大鼠（5只）海馬組織置于冰上裂解，勻漿后19 830×g離心15 min，取上清液用于提取蛋白，經(jīng)BCA 法定量濃度后，取50 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 分離，低溫轉膜1 h 后用脫脂奶粉（5%）封閉，添加兔抗Sirt1、FOXO1、GAPDH、LC3和beclin-1 Ⅰ抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，使用HRP 標記的IgG Ⅱ抗（1∶3 000）孵育1.5 h，暗室中使用ECL 化學發(fā)光試劑進行顯色后系統(tǒng)拍照，ImageJ 軟件分析Sirt1、FOXO1、LC3-I、LC3-II和beclin-1條帶的灰度，計算相對表達量。

3.6 免疫組化法檢測大鼠海馬組織中Sirt1/FOXO1通路相關蛋白的陽性表達情況 將3.4 所得冰凍切片浸于枸櫞酸鈉緩沖液中孵育后，胎牛血清封閉，添加兔抗Sirt1 和FOXO1 Ⅰ抗過夜后于次日孵育生物素標記的Ⅱ抗，DAB 顯色后蘇木素復染，經(jīng)過脫水、透明、封片，光鏡下隨機挑選5 個視野觀察棕黃色陽性細胞（×200）。

4 統(tǒng)計學處理

SPSS 21.0 軟件分析計量資料并以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 DEX對大鼠抑郁行為的影響

相較于對照組，模型組大鼠的糖水偏愛度、水平運動得分和垂直運動得分顯著降低，F(xiàn)SIT 顯著增加（P＜0.05）；相較于模型組，DEX-L 組及DEX-H 組糖水偏愛度、水平運動得分和垂直運動得分顯著增加，F(xiàn)SIT 顯著降低（P＜0.05）；相較于DEX-L 組，DEX-H組糖水偏愛度、水平運動得分和垂直運動得分顯著增加，F(xiàn)SIT 顯著降低（P＜0.05）；相較于DEX-H 組，DEX-H+EX-527 組糖水偏愛度、水平運動得分和垂直運動得分顯著降低，F(xiàn)SIT顯著增加（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 DEX對大鼠抑郁行為的影響Table 1. Effect of DEX on depressive behavior in rats（Mean±SD. n=10）

2 DEX對大鼠認知功能的影響

相較于對照組，模型組大鼠穿越平臺次數(shù)顯著降低，逃避潛伏期顯著增加（P＜0.05）；相較于模型組，DEX-L組及DEX-H組穿越平臺次數(shù)顯著增加，逃避潛伏期顯著降低（P＜0.05）；相較于DEX-L 組，DEX-H 組穿越平臺次數(shù)顯著增加，逃避潛伏期顯著降低（P＜0.05）；相較于DEX-H組，DEX-H+EX-527組穿越平臺次數(shù)顯著降低，逃避潛伏期顯著增加（P＜0.05），見表2。

表2 DEX對小鼠認知功能的影響Table 2. Effects of DEX on cognitive function in mice（Mean±SD. n=10）

3 HE染色觀察大鼠海馬組織病理損傷

對照組大鼠海馬組織神經(jīng)元排列整齊、形態(tài)結構正常，未見壞死細胞；模型組神經(jīng)元排列疏松、紊亂，核固縮、胞質染色加深、胞體水腫，出現(xiàn)空泡、變性、壞死現(xiàn)象；相較于模型組，DEX-L 組及DEX-H 組神經(jīng)元排列較為整齊，核固縮、空泡變性減輕，上述病理癥狀均得到改善；相較于DEX-H 組，DEX-H+EX-527組上述癥狀加重，見圖2。

4 Nissl染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元情況

對照組大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)良好，尼氏體豐富、染色清晰；模型組神經(jīng)元紊亂、稀疏、斷裂、壞死嚴重，尼氏體減少、皺縮，CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；相較于模型組，DEX-L 組及DEX-H組神經(jīng)元層次較為豐富，排列較為緊湊、壞死減少，尼氏體數(shù)量增多，CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著增加（P＜0.05）；相較于DEX-H 組，DEX-H+EX-527 組神經(jīng)元損傷加重，CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見表3、圖3。

表3 海馬神經(jīng)元存活情況比較Table 3. Comparison of survival of hippocampal neurons（Mean±SD. n=5）

Figure 1. Behavioral observation of the rats. A：control group；B：model group；C：DEX-L group；D：DEX-H group；E：DEX-H+EX-527 group.圖1 大鼠行為學觀察

5 DEX 對大鼠海馬組織中LC3-II/-I 和beclin-1 表達的影響

相較于對照組，模型組大鼠海馬組織中LC3-II/-I和beclin-1 表達顯著降低（P＜0.05）；相較于模型組，DEX-L 組 及DEX-H 組LC3-II/-I 和beclin-1 表 達 顯 著增加（P＜0.05）；相較于DEX-L 組，DEX-H 組LC3-II/-I和beclin-1 表達顯著增加（P＜0.05）；相較于DEX-H組，DEX-H+EX-527 組LC3-II/-I 和beclin-1 表達顯著降低（P＜0.05），見表4、圖4。

表4 DEX 對大鼠海馬組織中LC3-II/LC3-I 和beclin-1 表達的影響Table 4. Effects of DEX on the expression of LC3-II/LC3-I and beclin-1 in rat hippocampus（Mean±SD. n=5）

6 DEX 對大鼠海馬組織中Sirt1/FOXO1 通路相關蛋白表達的影響

相較于對照組，模型組大鼠海馬組織中Sirt1 和FOXO1 表達顯著降低（P＜0.05）；相較于模型組，DEX-L 組及DEX-H 組Sirt1 和FOXO1 表達顯著增加（P＜0.05）；相 較 于DEX-L 組，DEX-H 組Sirt1 和FOXO1 表達顯著增加（P＜0.05）；相較于DEX-H 組，DEX-H+EX-527 組Sirt1 和FOXO1 表達顯著降低（P＜0.05），見圖5及表5。

表5 DEX對大鼠海馬組織中Sirt1/FOXO1通路相關蛋白表達的影響Table 5. Effect of DEX on the expression of Sirt1/FOXO1 pathway-related proteins in rat hippocampus（Mean±SD.n=5）

Figure 2. Histopathological observation of the hippocampus（HE staining，scale bar=50 μm）. A：control group；B：model group；C：DEX-L group；D：DEX-H group；E：DEX-H+EX-527 group.圖2 海馬組織病理學觀察

Figure 3. Observation of hippocampal neurons in rats（Nissl staining，scale bar=50 μm）. A：control group；B：model group；C：DEX-L group；D：DEX-H group；E：DEX-H+EX-527 group.圖3 大鼠海馬神經(jīng)元情況觀察

Figure 4. Effects of DEX on the protein expression of LC3-I，LC3-II and beclin-1 in rat hippocampus. A：control group；B：model group；C：DEX-L group；D：DEXH group；E：DEX-H+EX-527 group.圖4 DEX 對大鼠海馬組織中LC3-I、LC3-II和beclin-1表達的影響

7 免疫組化法檢測大鼠海馬組織中Sirt1/FOXO1通路相關蛋白的表達

相較于對照組，模型組大鼠海馬組織中Sirt1 和FOXO1陽性表達顯著降低；相較于模型組，DEX-L組及DEX-H組Sirt1和FOXO1陽性表達顯著增加；相較于DEX-L 組，DEX-H 組Sirt1、FOXO1 陽性表達顯著增加；相較于DEX-H 組，DEX-H+EX-527 組Sirt1 和FOXO1陽性表達顯著降低，見圖6。

Figure 5. Effect of DEX on the expression of Sirt1/FOXO1 pathway related protein in rat hippocampus. A：control group；B：model group；C：DEX-L group；D：DEXH group；E：DEX-H+EX-527 group.圖5 DEX對大鼠海馬組織中Sirt1/FOXO1通路相關蛋白表達的影響

討論

抑郁癥作為一種常見的精神疾病，不僅會導致患者負面的情緒狀態(tài)，還可能因此造成認知功能障礙的發(fā)生，有研究顯示，其發(fā)生與神經(jīng)受損有關，表明抑郁癥是一種以認知及神經(jīng)功能障礙為特征的疾病［12-13］。故此，改善神經(jīng)受損及認知障礙對抑郁癥的治療十分重要，有必要對其發(fā)生及治療機制進行深入研究。

Figure 6. The expression of Sirt1/FOXO1 pathway-related proteins in rat hippocampus detected by immunohistochemistry（scale bar=50 μm）. A：control group；B：model group；C：DEX-L group；D：DEX-H group；E：DEX-H+EX-527 group.圖6 免疫組化法檢測大鼠海馬組織中Sirt1/FOXO1 通路相關蛋白的表達

有數(shù)據(jù)支持，DEX 對治療躁動和抵抗性抑郁的患者具有幫助［14-15］，研究顯示，DEX 有效緩解了頑固性癌痛患者的疼痛和抑郁，而鞘內(nèi)注射DEX 有作為治療疼痛相關抑郁癥輔助藥物的潛能［16］。DEX 在多種動物模型中具有的抗抑郁作用已被證實，睡眠剝奪可造成抑郁癥狀的發(fā)生，而DEX 可通過增加5-羥色胺及D1 多巴胺受體水平來緩解睡眠剝奪小鼠的抑郁行為［17］。還有報道稱，DEX 能夠通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路來改善抑郁癥大鼠空間學習、記憶及行為能力［9］。除此之外，DEX 可通過激活N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體NR2B 亞基/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路改善電休克大鼠抑郁行為和認知障礙［18］。但目前關于DEX對抑郁癥認知功能改善的相關機制研究甚少。海馬是大腦神經(jīng)干細胞所在區(qū)域之一，可維持新神經(jīng)元的生成，海馬神經(jīng)發(fā)生與學習、記憶和情緒調(diào)節(jié)有關，其損傷與焦慮、抑郁等心理障礙的發(fā)生密切相關［19］。本研究結果顯示，DEX處理能顯著降低抑郁癥大鼠的抑郁行為，增加其認知行為，緩解海馬神經(jīng)元損傷，與前人研究結果一致［9］，該結果表明DEX 可有效改善抑郁癥大鼠認知功能障礙及神經(jīng)損傷，減輕其抑郁行為，具有有效的抗抑郁作用。

自噬作為依賴于細胞溶酶體的一種分解代謝過程，該過程對細胞正常發(fā)育及生理功能的行使十分重要，已被認作為一種細胞存活機制［19］，當神經(jīng)損傷發(fā)生時，激活自噬可清除細胞內(nèi)凋亡因子及受損線粒體等細胞器，以此起到神經(jīng)保護的作用［20］。研究表明，激活自噬可改善七氟醚誘導的老齡大鼠的認知障礙，抑制神經(jīng)元凋亡［20］。本研究顯示，DEX 可顯著增加海馬自噬激活相關因子LC3-II/-I 和beclin-1的表達，該結果表明，DEX 可通過激活自噬起到神經(jīng)保護作用，改善抑郁癥大鼠神經(jīng)損傷。

Sirt1/FOXO1 信號通路是一個經(jīng)典的自噬途徑，Sirt1作為一種廣泛分布于各種組織細胞中的去乙?；?，不僅可通過促使自噬相關基因去乙酰化來影響自噬，還可通過激活FOXO1 表達來誘導自噬的發(fā)生。除此之外，有研究表明，其還能通過激活線粒體途徑的自噬來維持神經(jīng)功能的穩(wěn)定［6］。研究顯示，促進Sirt1表達可通過抑制細胞凋亡及炎癥反應的發(fā)生來保護神經(jīng)功能，并且已在帕金森氏癥和阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病中等到證實［21］。研究表明，丹參注射液可通過激活Sirt1/FOXO1 自噬途徑來改善腦損傷大鼠神經(jīng)損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護的作用［6］。此外，姜黃素可通過促進Sirt1 表達及FOXO1去乙?；瘉砀纳颇摱景Y小鼠認知障礙［22］。DEX 可通過激活Sirt1 通路來抑制腦損傷大鼠神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)損傷［23］，但關于其調(diào)控Sirt1/FOXO1 介導的自噬通路對抑郁癥認知功能的影響機制研究還未見報道。本研究結果顯示，DEX 能夠顯著促進抑郁癥大鼠Sirt1/FOXO1 信號通路的激活，與前人研究結果相似［23］。除此之外，Sirt1抑制劑EX-527可逆轉DEX 對抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元損傷、認知功能障礙的改善及自噬的激活，該結果表明，DEX 可通過激活Sirt1/FOXO1 介導的自噬來改善抑郁癥大鼠認知功能障礙，以此起到抗抑郁的作用。

綜上所述，DEX 通過激活Sirt1/FOXO1 通路來促進抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元自噬，從而改善神經(jīng)損傷及認知功能障礙。本研究不僅為DEX在抑郁癥中的治療機制研究提供了實驗依據(jù)，還對抑郁癥的發(fā)生機制的研究具有一定參考價值。