張 揚(yáng)， 張文超， 劉鑫苗，2

（1吉林大學(xué)藥學(xué)院生物藥學(xué)系，吉林 長春 130022；2吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)系，吉林 長春 130062）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是一種多發(fā)于中老年人的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。目前治療PD 的傳統(tǒng)藥物，主要是基于增加腦內(nèi)多巴胺遞質(zhì)，如復(fù)方左旋多巴、多巴胺受體激動(dòng)劑等，但該類藥物長期服用會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且無法阻止神經(jīng)元細(xì)胞的變性［2］。因此，尋找新型有效的抗PD藥物具有重要意義。

近年來多項(xiàng)研究證實(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)在PD 發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，其中Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）-核因子E2 相 關(guān) 因 子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）信號(hào)通路是調(diào)控氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路之一［3］。

研究表明，梔子中環(huán)烯醚萜類有效成分—梔子苷具有抗氧化應(yīng)激、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，治療PD具有一定的療效［4-5］。但梔子中其他環(huán)烯醚萜類化合物活性成分如山梔苷，能否通過抑制氧化應(yīng)激治療PD 尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬利用6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y 細(xì)胞建立體外PD 氧化損傷模型，進(jìn)而基于Keap1/Nrf2/HO-1 通路探討山梔苷對(duì)PD 氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

材料和方法

1 細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（細(xì)胞編號(hào)：SCSP-5014）。

2 主要試劑

6-OHDA（產(chǎn)品編號(hào)H4381）購自Sigma；梔子苷購自中國食品藥品檢定研究院；山梔苷購自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)C0037）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)S0033）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗Keap1、Nrf2、血紅素加氧酶1（hemeoxygenase-1，HO-1）和GAPDH 抗體均購自Abcam；RIPA 裂解液和BCA 蛋白試劑盒均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；高糖DMEM 培養(yǎng)液購自Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自杭州天杭生物科技股份有限公司；胰蛋白酶（trypsin）-EDTA購自北京索萊寶科技有限公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SH-SY5Y 細(xì)胞用含10%滅活FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用0.25% trypsin-EDTA 進(jìn)行消化，制成單細(xì)胞懸液。

3.2 PD 體外損傷模型的建立及評(píng)價(jià) 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔8×103個(gè)接種于96 孔板內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后，設(shè)對(duì)照組及不同濃度的6-OHDA 處理組（終濃度分別為25、50、100、150 和200 μmol/L）誘導(dǎo)24 h，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，以評(píng)價(jià)建模是否成功。

3.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 待細(xì)胞完全貼壁后，按照分組情況，先加入不同濃度的山梔苷（終濃度分別為5、50、100 和200 μmol/L）及50 μmol/L 的梔子苷預(yù)處理2 h，再加入100 μmol/L 的6-OHDA 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，并設(shè)立對(duì)照組（只加入培養(yǎng)液）和模型組（只加入培養(yǎng)液和100 μmol/L 的6-OHDA），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL 的CCK-8溶液，37 ℃避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長450 nm 處檢測(cè)各孔的吸光度（absorbance，A），計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)活力。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（A加藥-A對(duì)照）/（A不加藥-A對(duì)照）×100%。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平 取各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔4×108/L 接種于8 孔板中，分為空白組、對(duì)照組、模型組、山梔苷組及梔子苷組，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h?？瞻捉M、對(duì)照組與模型組加入等量的完全培養(yǎng)液，山梔苷組加入100 μmol/L山梔苷，梔子苷組加入50 μmol/L 梔子苷預(yù)處理2 h，除空白組和對(duì)照組外均加入100 μmol/L6-OHDA 處理24 h。將各組處理好的細(xì)胞收集后，棄掉原有的培養(yǎng)液，每孔加入1 mL 以1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋的DCFH-DA 探針，避光孵育20 min，再用HBSS洗滌細(xì)胞3 次，每孔加入500 μL 胰酶消化，將消化液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中離心，棄上清，再每管加入300 μmol/L HBSS 重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度。

3.5 分子對(duì)接 使用分子對(duì)接技術(shù)探索山梔苷與Keap1 之間的關(guān)系。選擇Keap1 蛋白作為受體，計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模擬梔子苷和山梔苷與受體蛋白的半柔性對(duì)接。從PDB 蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http：//www. rcsb.org/）獲得Keap1（PDBID：4IFN）的模擬分子結(jié)構(gòu)；從Pubchem Compound 數(shù)據(jù)庫（https：//www. ncbi. nlm.nih.gov/pccompound/）下載梔子苷和山梔苷小分子配體的3D 結(jié)構(gòu)文件，格式為SDF，并使用GaussView 5.0 軟件將下載的小分子配體化合物SDF 格式轉(zhuǎn)換為PDB；采用AutoDockTools 4.0 軟件處理Keap1 蛋白和陽性配體復(fù)合物，確定活性中心，設(shè)置GridBox參數(shù)，對(duì)接區(qū)域大小60；使用DiscoveryStudio 4.5 軟件拆分Keap1蛋白與陽性配體；AutoDockTools 4.0軟件為上一步拆分后的Keap1 蛋白單體結(jié)構(gòu)加氫、加電子；Autogrid 程序計(jì)算格點(diǎn)能量；AutoDockTools 4.0 軟件設(shè)置對(duì)接參數(shù)，選擇拉馬克遺傳算法篩選，設(shè)置運(yùn)行次數(shù)為10，“Maximum Number of Evals”選擇“Short”，其它按默認(rèn)設(shè)置，點(diǎn)擊運(yùn)行進(jìn)行對(duì)接，得到對(duì)接信息及結(jié)果構(gòu)象圖。

3.6 Western blot 檢測(cè)Keap1、Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS 洗滌2 次后，每孔加入60 μL裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并根據(jù)試劑盒說明書提取細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白。BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，取40 μg 蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，后加入TBST 稀釋的5%脫脂牛奶封閉2 h。洗膜后分別加入Ⅰ抗［anti-Keap1（1∶500）、anti-Nrf2（1∶500）和anti-HO-1（1∶500），以GAPDH 或histone H3為內(nèi)參照］，4 ℃孵育過夜。TBST洗脫3次后加入對(duì)應(yīng)的熒光鼠源Ⅱ抗，室溫孵育2 h，洗膜后利用ECL 化學(xué)發(fā)光顯像并在暗室曝光掃描。計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，即目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參照灰度值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3.7 RT-qPCR 檢測(cè)HO-1 的mRNA 表達(dá) 各組細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS 洗滌2 次后，每孔加入1 mL Trizol 裂解液，冰上裂解5 min，采用Trizol 試劑盒提取細(xì)胞總RNA。隨后，采用cDNA第一鏈合成試劑盒將得到的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后，采用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，以GAPDH 為內(nèi)參照，在實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)熱5 min；95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，共40 個(gè)循環(huán)。HO-1 的上游引物序列為5'-AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC-3'，下游引物序列為5'-AAAGCCCTACAGCAACTGTCG-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物序列為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。各組計(jì)數(shù)資料對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料（符合正態(tài)分布）以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間比較使用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié)果

1 6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

CCK-8 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，6-OHDA 以劑量依賴性方式逐漸降低SH-SY5Y 細(xì)胞的活力（P＜0.05）；其中100 μmol/L 濃度的6-OHDA 作用后SHSY5Y 細(xì)胞活力下降至（61.08±1.38）%，既可保證對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞的損傷作用，又不至于產(chǎn)生很大的細(xì)胞毒性，因此本研究選擇100 μmol/L 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中PD體外損傷模型的6-OHDA濃度，見表1。

表1 6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響Table 1. Effect of 6-OHDA on the viability of SH-SY5Y cells（Mean±SD. n=3）

2 6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)可見，對(duì)照組細(xì)胞生長狀況良好，密度大，細(xì)胞呈三角形或多邊形，胞體透明，單個(gè)細(xì)胞可見神經(jīng)突起；經(jīng)100 μmol/L 6-OHDA 處理后，細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞變圓、突觸減少或消失，可見細(xì)胞殘骸，見圖1。

3 山梔苷對(duì)6-OHDA 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞活力的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組SH-SY5Y 細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，50、100 和200 μmol/L 的山梔苷及50 μmol/L 的梔子苷提高了6-OHDA 損傷細(xì)胞的活力（P＜0.05），而5 μmol/L山梔苷亦可提高細(xì)胞活力，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其中100 μmol/L 山梔苷組的細(xì)胞活力最好，故以此濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中山梔苷的實(shí)驗(yàn)濃度，見表2。

Figure 1. Morphological changes of SH-SY5Y cells in each group observed by inverted microscopy. A：control group；B：model group. Compared with control group，significant morphological changes were observed in model group，including significantly decreased cell density，turning round，and decreased or disappearing synapses.圖1 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化

表2 山梔苷對(duì)6-OHDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響Table 2. Effect of shanzhiside on viability of SH-SY5Y cells damaged by 6-OHDA（Mean±SD. n=5）

4 山梔苷對(duì)6-OHDA 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞ROS 水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組SH-SY5Y 細(xì)胞中DCF 的熒光強(qiáng)度增加（峰值右移），表明細(xì)胞內(nèi)ROS 水平在6-OHDA 處理后顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，100 μmol/L 山 梔 苷 組 和50 μmol/L 梔 子 苷 組SHSY5Y 細(xì)胞中DCF 的熒光強(qiáng)度均降低（峰值左移），表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低（P＜0.05），見圖2。

5 山梔苷與Keap1蛋白的分子對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接結(jié)果顯示，Keap1與山梔苷的結(jié)合能為-4.58 kcal/mol，與梔子苷的結(jié)合能為-3.95 kcal/mol。根據(jù)分子對(duì)接中結(jié)合能越小則配體與受體結(jié)合能力越強(qiáng)這一原理可得，與Keap1 蛋白結(jié)合能力：陽性配體＞山梔苷＞梔子苷，見表3。對(duì)接構(gòu)象圖顯示，山梔苷、梔子苷和陽性配體與Keap1 蛋白的可能作用位點(diǎn)中均含有Arg415、Ser602 和Tyr572 這三個(gè)氨基酸殘基，見圖3。

表3 山梔苷、梔子苷與Keap1蛋白分子對(duì)接信息Table 3. The binding of shanzhiside，geniposide and Keap1 by molecular docking

6 山梔苷對(duì)6-OHDA 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞Keap1/Nrf2/HO-1表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)均顯著下降（P＜0.05），且HO-1的mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，100 μmol/L 山梔苷組和50 μmol/L 梔子苷組細(xì)胞中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），且HO-1 的mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），但Keap1的蛋白表達(dá)無顯著差異（P＞0.05），見圖4及表4。

表4 山梔苷對(duì)6-OHDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響Table 4. Effect of shanzhiside on the protein expression of Keap1，Nrf2 and HO-1 in SH-SY5Y cells injured by 6-OHDA（Mean±SD.n=5）

討論

近年來PD 的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，加重社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。雖然，臨床上將左旋多巴作為PD 治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但其長期使用也會(huì)帶來一系列的副作用如惡心、嘔吐以及運(yùn)動(dòng)癥狀波動(dòng)現(xiàn)象、“開關(guān)”癥狀等［6］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種中藥活性成分可通過抑制氧化應(yīng)激等多種途徑對(duì)PD 產(chǎn)生較好的作用［7］。其中，梔子苷可促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子生成，促進(jìn)神經(jīng)突觸生成，具有保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞作用［8］，因此將其作為本研究的陽性藥物對(duì)照組。而梔子中另一環(huán)烯醚萜類成分——山梔苷的藥理作用報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)基于Keap1/Nrf2/HO-1 通路探討了山梔苷對(duì)PD 氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為山梔苷的進(jìn)一步藥理研究及應(yīng)用提供參考。

有研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激機(jī)制與PD 中多巴胺神經(jīng)元的退化密切相關(guān)［9］，且Keap1/Nrf2信號(hào)通路可以通過控制多種抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄來激發(fā)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激［3］，其中，Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的核心調(diào)控因子，活化后進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)多種抗氧化通路，抑制氧化應(yīng)激［10］。Keap1蛋白是Nrf2的負(fù)向調(diào)控因子，當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激時(shí)，Keap1 蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，不能繼續(xù)降解Nrf2，于是胞質(zhì)內(nèi)的Nrf2 蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與核內(nèi)小Maf 蛋白（small musculoaponeurotic fibrosarcoma protein）特異性結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)下游抗氧化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，增加細(xì)胞的抗氧化能力［11］。

Figure 2. Effect of shanzhiside on reactive oxygen species（ROS）in SH-SY5Y cells injured by 6-OHDA. A：blank group；B：control group；C：model group；D：shanzhiside group；E：gardenitin group. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖2 山梔苷對(duì)6-OHDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平的影響

Figure 3. The docking conformation of shanzhiside，geniposide and Keap1. A：binding conformation of shanzhiside and Keap1；B：binding conformation of gardenitin and Keap1.圖3 山梔苷、梔子苷與Keap1蛋白對(duì)接構(gòu)象圖

因此，首先我們利用AutoDockTools 4.0 等軟件將Keap1 蛋白對(duì)陽性配體、梔子苷和山梔苷進(jìn)行虛擬匹配，進(jìn)行生物活性測(cè)定。結(jié)果顯示梔子苷、山梔苷與Keap1 蛋白均具有較強(qiáng)結(jié)合活性。山梔苷和梔子苷共有作用位點(diǎn)為Arg415、Ser602 和Tyr572，這提示山梔苷藥理學(xué)機(jī)制可能與梔子苷接近，可能是抑制PD 氧化應(yīng)激的潛在活性成分。并且梔子苷與Keap1 蛋白結(jié)合耗能低于山梔苷與Keap1 蛋白結(jié)合耗能，這表明山梔苷與Keap1 蛋白結(jié)合能力強(qiáng)于梔子苷。此外，山梔苷與Keap1 蛋白受體形成4 個(gè)氫鍵，氫鍵的形成強(qiáng)化了配體與受體結(jié)合能力。對(duì)接結(jié)果說明山梔苷很可能通過作用于Keap1 來發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激作用。

Figure 4. Effect of shanzhiside on the expression of Keap1，Nrf2 and HO-1 in SH-SY5Y cells injured by 6-OHDA. A：determination of the protein levels of Keap1，Nrf2 and HO-1 in the 4 groups by Western blot；B：RT-qPCR analysis of the mRNA level of HO-1 in the 4 groups. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖4 山梔苷對(duì)6-OHDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞中Keap1、Nrf2和HO-1表達(dá)的影響

有報(bào)道在多種神經(jīng)退行性疾病中Nrf/HO-1 信號(hào)通路可減少炎癥因子的生成，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷［12］，并且已證實(shí)Nrf/HO-1 通路6-OHDA 誘導(dǎo)的PD 大鼠模型中的保護(hù)作用［13］。因此，我們進(jìn)一步采用Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞Keap1、Nrf2 和HO-1 總蛋白及核內(nèi)Nrf2 的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，梔子苷和山梔苷組Nrf2 和HO-1 總蛋白表達(dá)均有升高，Keap1水平未見明顯改變，且核內(nèi)Nrf2 蛋白表達(dá)也顯著升高。此外，RT-qPCR 結(jié)果顯示梔子苷和山梔苷組細(xì)胞HO-1 的mRNA 表達(dá)含量顯著高于模型組。由此推斷，山梔苷并未對(duì)Keap1 蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響，可能通過促進(jìn)Keap1 與Nrf2 的解離，升高細(xì)胞內(nèi)Nrf2水平，使Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)抗氧化應(yīng)激通路，并活化結(jié)合ARE，促進(jìn)其下游抗氧化酶的表達(dá)，發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激的作用，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷和死亡，使細(xì)胞的存活率上升［14］。同時(shí)，山梔苷可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)HO-1 表達(dá)，增強(qiáng)6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞的抗氧化能力，分析原因可能是山梔苷促進(jìn)PD 細(xì)胞游離血紅素產(chǎn)生一氧化碳、膽綠素和游離鐵，從而降低6-OHDA引起的神經(jīng)損傷［15］。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，山梔苷能通過Keap1 上調(diào)Nrf2 和HO-1 蛋白的表達(dá)水平，顯著抑制細(xì)胞中ROS，減輕6-OHDA 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞損傷，即山梔苷可能通過調(diào)控Keap1/Nrf/HO-1 通路，抑制6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的氧化應(yīng)激。