車冰冰， 孫夢婷， 王寧寧， 岑 杰， 李國鵬， 趙冰冰， 魏 璨△

（1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150086；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150086）

糖尿?。╠iabetes mellitus）是全球常見的以血糖升高和代謝紊亂為特征的疾?。?］。糖尿病對機體的危害主要源于其并發(fā)癥的發(fā)生。糖尿病患者常發(fā)生原發(fā)性開角型青光眼（primary open angle glaucoma，POAG）、眼壓升高和視神經(jīng)病變等，使其視力下降甚至失明［2-3］。迄今為止，糖尿病性POAG 的發(fā)病機制尚未清晰闡明，亦缺乏有效的治療方法。

房水流出受阻和眼壓升高是POAG 患者不可逆性失明的主要原因［4］。小梁網(wǎng)（trabecular meshwork，TM）是房水流出的主要調(diào)節(jié)部位，在前房和Schlemm管之間起著過濾器的作用［5］。慢性眼壓升高會損害TM 細胞的功能，從而導(dǎo)致患者發(fā)生進行性視神經(jīng)喪失和視力損害［6］。因此，如何抑制TM 損傷而減少糖尿病患者眼部并發(fā)癥的發(fā)生成為我們的關(guān)注點。

鈣敏感受體（calcium-sensing receptor，CaSR）是G 蛋白偶聯(lián)受體C 家族成員，體內(nèi)分布于胃、腸、皮膚、腦、肝和心臟等部位，參與調(diào)控Ca2+穩(wěn)態(tài)、細胞增殖、分化、凋亡和離子通道開啟等［7］。本課題組前期研究已證實，CaSR 參與糖尿病心肌病和糖尿病肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［7-10］。然而，CaSR 在糖尿病TM 細胞中的表達變化及其作用，尚未見報道。

因此，本研究復(fù)制了高糖（high glucose，HG）處理的人小梁網(wǎng)細胞（human trabecular meshwork cells，HTMC）損傷模型，觀察CaSR 是否參與HG 誘導(dǎo)HTMC損傷的發(fā)生，并探討可能的機制。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞 HTMC 購自河北北納生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購 自Gibco；CCK-8 試 劑 盒 購 自Dojindo；CaSR 激動劑NPS R568 和CaSR 抑制劑Calhex231購自MedChemExpress；強效RIPA蛋白裂解液購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA 定量試劑盒購自BOSTER；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自Beyotime；抗CaSR、ATG7、P62、LC3-I、LC3-II、cleaved caspase-3、Bcl-2 和GAPDH 抗體購自Cell Signaling Technology、Thermo Fisher Scientific 或Proteintech；山羊抗兔IgG 購自Rockland Immunochemicals；超敏ECL顯色液購自HaiGene。

2 方法

2.1 細胞模型建立及其分組 將人小梁網(wǎng)細胞在含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。當細胞達到70%～80%匯合時進行實驗［8，11］。將HTMC 隨機分成4 組：（1）對照（control）組：用10% FBS-DMEM 培養(yǎng)；（2）HG 組：培養(yǎng)液中加入50 mmol/L葡萄糖；（3）HG+NPS R568組：HG 環(huán)境下加入10 μmol/L NPS R568 共培養(yǎng)［12］；（4）HG+Calhex231 組：HG 環(huán) 境 下 加 入3 μmol/L Calhex231共培養(yǎng)［13］。每組細胞培養(yǎng)時間均為72 h。

2.2 CCK-8 法檢測細胞活力 按照實驗分組，將HTMC 以每孔3×103個接種于96 孔板中，當細胞融合至50%時，使用含不同濃度（5.5、10、30、40、50 和60 mmol/L）葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。孵箱中培養(yǎng)72 h 后，取出孔板用預(yù)冷PBS 洗滌3 次，把液體甩干后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，避光在37 ℃孵箱中孵育1.5 小時，隨后用酶標儀在450 nm 處讀取吸光度（A）。

2.3 試劑盒檢測SOD 活性和MDA 含量 收集各組細胞的上清液，具體操作參見使用說明書。

2.4 免疫熒光染色檢測CaSR 定位和表達 將接種在載玻片上的HTMC 洗滌、固定并透膜。使用特異性抗CaSR 抗體（1∶100）在4 ℃下免疫標記過夜；用PBS 洗滌后，將細胞與相應(yīng)熒光Ⅱ抗（山羊抗兔IgG）和DAPI 核復(fù)染劑孵育，然后利用熒光顯微鏡進行觀察。

2.5 Western blot檢測蛋白表達 收集細胞，裂解后取上清液，用BCA 法測定蛋白含量。用SDS-PAGE分離蛋白，根據(jù)目的蛋白分子量選擇配制不同濃度的分離膠，上樣，電泳，至溴酚蘭抵達凝膠底部時，停止電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，裁剪目的蛋白所在的條帶。將目的條帶分別置于抗體盒中，加入相應(yīng)的Ⅰ抗（CaSR、ATG7、P62、LC3-I、LC3-II、cleaved caspase-3、Bcl-2 和GAPDH 按1∶1 000 比例配制），4 ℃過夜。次日用TBST 洗膜，然后加入稀釋過的Ⅱ抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜，ECL 法進行顯色。應(yīng)用ImageJ 圖像處理軟件對條帶進行分析，測量灰度值，計算各組目的蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 HG環(huán)境下HTMC活力的動態(tài)變化

CCK-8 檢測結(jié)果顯示，以control 組（5.5 mmol/L葡萄糖）HTMC活力為1，HTMC活力在葡萄糖濃度超過50 mmol/L 后逐漸下降（P＜0.05），在10、30 和40 mmol/L 時變化不顯著（P＞0.05），見表1。因此，后續(xù)實驗選定50 mmol/L為HG損傷的葡萄糖濃度。

表1 CCK-8法檢測不同濃度葡萄糖下HTMC活力Table 1. Detection of HTMC viability under different concentrations of glucose by CCK-8 assay（Mean±SD. n=8）

2 HG誘導(dǎo)HTMC中CaSR表達

Western blot 結(jié)果顯示，與control 組相比，HG 組CaSR 蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+NPS R568 組CaSR 表達進一步增多（P＜0.05），而HG+Calhex231 組CaSR 表達顯著下降（P＜0.05），見圖1及表2。

Figure 1. Comparison of CaSR protein expression in HTMC of each group. Western blot was used to detect the expression of CaSR.圖1 比較各組HTMC中CaSR的蛋白表達

表2 分析各組中CaSR和其他相關(guān)蛋白的表達Table 2. Analysis of CaSR and other related protein expression in each group（Mean±SD. n=3）

免疫熒光染色結(jié)果顯示，CaSR 主要在HTMC 的胞漿中表達；與control 組相比，HG 組CaSR 熒光強度增強；與HG 組相比，HG+NPS R568 組CaSR 熒光強度進一步增強，而HG+Calhex231 組CaSR 熒光強度減弱，見圖2。

3 CaSR促進HG誘導(dǎo)的HTMC氧化應(yīng)激

與control 組 相 比，HG 組SOD 活 性 顯 著 下 降 而MDA 含量顯著增多（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+NPS R568 組SOD 活性進一步下降而MDA 含量進一步增多，HG+Calhex231 組SOD 活性顯著升高，MDA含量顯著減少（P＜0.05），見表3。

表3 比較各組SOD活性和MDA含量Table 3. Comparison of superoxide dismutase（SOD）activity and malondialdehyde（MDA）content in each group（Mean±SD. n=8）

Western blot 結(jié)果顯示，與control 組相比，HG 組SOD2 蛋白表達顯著減少（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+NPS R568 組SOD2 表達進一步減低（P＜0.05），而HG+Calhex231 組SOD2 表達顯著增加（P＜0.05），見圖3及表2。

4 CaSR抑制HG引起的HTMC自噬

Figure 2. The localization and expression of CaSR in HTMC of each group detected by immunofluorescence. Cell images under confocal laser scanning microscope were shown. Scale bar=50 μm.圖2 免疫熒光染色檢測各組HTMC中CaSR的表達和定位

Figure 3. Comparison of SOD2 protein expression in HTMC of each group. Western blot was used to detect the expression of SOD2.圖3 比較各組HTMC中SOD2蛋白表達

與control 組相比，HG 組ATG7 表達顯著減少，LC3-II/LC3-I 比值顯著降低，而P62 表達顯著增加（P＜0.05）；與HG組相比，加入NPS R568使上述變化進一步增強（P＜0.05），而Calhex231 抑制HG 引起的細胞自噬下降（P＜0.05），見圖4及表2。

Figure 4. Comparison of autophagy-related protein expression in HTMC of each group. Western blot was used to detect the expression of ATG7，P62 and LC3.圖4 比較各組HTMC中自噬相關(guān)蛋白表達

5 CaSR促進HG引起的HTMC凋亡

與control 組相比，HG 組Bcl-2 蛋白表達顯著減少而cleaved caspase-3 表達顯著增加（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+NPS R568 組上述變化加重（P＜0.05），而HG+Calhex231 組上述改變減輕（P＜0.05），見圖5及表2。

Figure 5. Comparison of apoptosis-related protein expression in HTMC of each group. Western blot was used to detect the expression of Bcl-2 and cleaved caspase-3.圖5 比較每組HTMC中凋亡相關(guān)蛋白表達

討論

糖尿病是由胰島素分泌不足和/或胰島素抵抗引起的以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［1］。據(jù)報道，糖尿病顯著增加青光眼的患病風(fēng)險，特別是POAG［14］。POAG 是一種以TM、視神經(jīng)頭、外側(cè)膝狀體核和視皮層為靶點的多組織疾病，氧化應(yīng)激和嚴重的線粒體損傷可誘發(fā)TM細胞凋亡激活，加重POAG進展［15-16］。CaSR屬于G蛋白偶聯(lián)受體，已被證實參與多種糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，然而其在糖尿病性青光眼中的作用尚未有報道［7-10］。因此，我們用HG 誘導(dǎo)HTMC 損傷，觀察CaSR在其中的作用并探討相關(guān)機制。

本研究用不同濃度葡萄糖處理HTMC，CCK-8結(jié)果顯示，50 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)72 h 可使HTMC 活力顯著降低，而CaSR 表達增加。以上結(jié)果初步提示，CaSR 的表達上調(diào)可能參與糖尿病性TM 損傷的發(fā)生。

SOD 和MDA 常 被用來評價氧化應(yīng)激水平［17］。本實驗采用試劑盒測定培養(yǎng)液中SOD 活性和MDA含量，并用免疫印跡檢測SOD2 的蛋白表達，結(jié)果顯示，HG 組HTMC 中SOD 活性下降，SOD2 表達減少而MDA含量增加。凋亡和自噬是兩種不同類型的程序性細胞死亡過程，自噬通過維持細胞循環(huán)抑制細胞凋亡，而自噬和自噬通量下降可引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞在內(nèi)的多種細胞功能障礙［18-19］。Western blot 結(jié)果顯示，HG 引起凋亡標志物cleaved caspase-3 表達增加而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達減少，同時自噬相關(guān)蛋白LC3-II 和ATG7 表達下降而P62 表達增加。也就是說，HG 誘導(dǎo)HTMC 發(fā)生氧化應(yīng)激和凋亡，抑制細胞自噬。

為了進一步探究CaSR 在HG 誘導(dǎo)HTMC 損傷中的作用和機制，我們加入CaSR靶向激動劑NPS R568和變構(gòu)抑制劑Calhex231 作為干預(yù)因素，觀察了二者對HG 誘導(dǎo)HTMC 損傷的影響。Western blot 和免疫熒光染色結(jié)果顯示，NPS R568和Calhex231分別促進和抑制了HG 誘導(dǎo)HTMC 的CaSR 表達。NPS R568通過激活CaSR 促進HG 誘導(dǎo)的HTMC 氧化應(yīng)激損傷和凋亡，并抑制自噬，而Calhex231 逆轉(zhuǎn)了HG 和NPS R568誘導(dǎo)的細胞損傷。這些結(jié)果表明，CaSR對糖尿病性青光眼，特別是TM損傷存在一定的調(diào)控機制。

我們的實驗結(jié)果初步觀察到CaSR 的激活參與了糖尿病性TM 損傷的過程，可能與促進氧化應(yīng)激和細胞凋亡以及抑制自噬有關(guān)。詳細的機制還有待今后進一步研究。