李曉媚， 陳絲秦， 梁 雪， 占 玉， 劉志華， 楊彬珧

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院前沿醫(yī)學(xué)交叉研究中心，廣州市加速康復(fù)腹部外科重點實驗室，廣東 廣州 510700）

糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，分為1型糖尿病和2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM），其中95%以上為T2DM［1］，最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，截止到2015年，全球20～79歲年齡段的糖尿病患者人數(shù)已達(dá)到4.15 億，預(yù)計到2040年，人數(shù)將到達(dá)6.42 億［2］，因此，糖尿病已成為全球化的重大公共衛(wèi)生問題。近年來，研究表明高脂飲食或糖尿病時的高血糖可誘導(dǎo)改變腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄重編程，損傷細(xì)胞間緊密連接的完整性，致腸道屏障通透性增加，即腸屏障功能障礙［3-5］。腸屏障功能障礙與T2DM 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腸上皮屏障主要由腸黏膜上皮細(xì)胞和細(xì)胞間的緊密連接蛋白（如occludin、ZO-1等）及防御素等其它物質(zhì)共同構(gòu)成，可抵御有害菌的入侵和內(nèi)毒素的移位，避免代謝性內(nèi)毒素血癥，從而改善胰島素抵抗［6-7］。但糖尿病誘導(dǎo)腸道屏障功能障礙的分子機(jī)制尚未完全清楚。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因 子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）是內(nèi)源性調(diào)節(jié)線粒體生物合成和抗氧化損傷的信號通路，SIRT1通過煙酰胺腺嘌呤 二 核 苷 酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）依賴的去乙?；{(diào)控PGC-1α 活性，參與能量代謝、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)途徑。有研究報道，SIRT1 激活劑SRT1720 通過激活SIRT1/PGC-1α 信號通路，顯著改善由過氧化氫誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的線粒體氧化損傷和調(diào)控腸屏障緊密連接蛋白（ZO-1 和claudin-1）表達(dá)降低，而SIRT1 抑制劑EX 527 共孵育則加重過氧化氫誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞損傷［8］；激活SIRT1/PGC-1α信號通路還可保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受脂多糖誘導(dǎo)的單層屏障通透性升高、炎癥和細(xì)胞凋亡［9］。動物實驗研究也報道，SIRT1 激活劑白藜蘆醇顯著改善由母鼠產(chǎn)前高脂飲食或出生后高脂飲食引起的子代鼠腸道代謝失調(diào)與相關(guān)的腸道微生物區(qū)紊亂［10］。這些研究表明SIRT1/PGC-1α 信號通路激活可改善腸屏障功能。

蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）是一組催化蛋白質(zhì)精氨酸發(fā)生甲基化修飾的酶，PRMT1 是PRMTs 家族的主要成員，既有轉(zhuǎn)錄激活作用，也有轉(zhuǎn)錄抑制的作用，PRMT1 屬于Ⅰ型PRMTs，常以大分子復(fù)合體形式參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA 損傷修復(fù)、RNA 代謝、蛋白質(zhì)相互作用等多種細(xì)胞過程［11-12］。糖尿病大鼠的多種組織存在PRMT1 高表達(dá)情況［13-14］，并有研究顯示視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒過表達(dá)PRMT1后，可使SIRT1 的表達(dá)顯著抑制［15］，但是目前為止，甚少有國內(nèi)外文獻(xiàn)就PRMT1 蛋白調(diào)控SIRT1/PGC-1α 通路影響腸屏障功能的研究。因此，本研究通過制備T2DM 小鼠模型，檢測各組腸通透性、結(jié)腸組織的腸屏障蛋白、PRMT1 蛋白和SIRT1/PGC-1α 通路蛋白的改變，并觀察PRMT1 抑制劑AMI-1（arginine methyltransferase inhibitor 1）對糖尿病小鼠腸屏障功能障礙的治療作用影響；在細(xì)胞水平上，采用高糖（high glucose，HG；50 mmol/L葡萄糖）處理人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM-460，用PRMT1 抑制劑AMI-1 和SIRT1 激動劑白藜蘆醇（resveratrol，Resv）共孵育，觀察腸屏障緊密連接蛋白、PRMT1 蛋白和SIRT1/PGC-1α 通路蛋白的改變，并采用PRMT1-siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞以沉默PRMT1表達(dá)后，觀察HG 對腸細(xì)胞的緊密連接蛋白和SIRT1/PGC-1α 通路。通過上述實驗驗證PRMT1 是否通過抑制SIRT1/PGC-1α 通路引起糖尿病腸屏障功能障礙。

材料和方法

1 主要試劑

SIRT1 激動劑Resv 和PRMT1 抑制劑AMI-1 購于MedChemExpress；兔抗ZO-1、β-actin和PGC-1α，以及鼠抗SIRT1 購于Abcam；鼠抗occludin 購于Proteintech；鼠 抗PRMT1 購 于Cell Signaling Technology；DMEM 培養(yǎng)液、胰蛋白酶和胎牛血清購于Gibco；DMSO 和戊巴比妥鈉購于Sigma；脫脂奶粉購于伊利公司；BCA Protein Assay Kit和I抗稀釋液購于上海碧云天生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿和離心管購于Corning；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）共軛葡聚糖（FITC-葡聚糖）購于Sigma；PRMT1-siRNA、non-targeting siRNA（NT-siRNA）和Lipofectamine ?RNAiMAX Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑盒購于Thermo Fisher Scientific；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒購于南京建成生物研究所。人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM-460 購自American Type Culture Collection（ATCC）。

2 T2DM動物模型

8周齡體重為（20±5）g的SPF級C57BL/6雄鼠購于廣東省實驗動物中心［SCXK（粵）2018-0002］；適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為為正常 對 照（control）組、T2DM 組、T2DM+AMI-1 組 和T2DM+Resv 組，每組5只。根據(jù)已報道制備T2DM 的方法［16］，采用先高脂飼養(yǎng)4 周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（45 mg/kg，溶于0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液，pH 4.2），于第3 天檢測小鼠空腹血糖高于16 mmol/L，再繼續(xù)高脂飼養(yǎng)12 周。AMI-1 灌胃治療T2DM 小鼠的劑量為50 mg·kg-1·d-1，Resv 灌胃治療T2DM 小鼠的劑量為10 mg·kg-1·d-1［10］，給藥12 周。4 組小鼠均自由飲用水和食物，晝夜比12 h∶12 h，飼養(yǎng)完成后，1.5%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉4 組小鼠，測量結(jié)腸長度，收集結(jié)腸組織置于液氮冷凍，并在-80 ℃保存。

3 HG細(xì)胞模型

采用NCM-460細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞實驗。首先是藥物濃度的確定，葡萄糖處理細(xì)胞的濃度參考已報道的文獻(xiàn)設(shè)為50 mmol/L［17］，AMI-1 和Resv 則分別采取與HG共孵育的量效實驗確定最適濃度，實驗分組如下：（1）HG 組；（2）HG+10 μmol/L AMI-1 共孵育組；（3）HG+30 μmol/L AMI-1 共 孵 育 組；（4）HG+100 μmol/L AMI-1 共孵育組。Resv 的量效實驗與AMI-1一致。然后，再進(jìn)行如下實驗，組別為：（1）正常對照（control）組；（2）HG組；（3）HG+AMI-1（30 μmol/L）共孵育組；（4）HG+Resv（30 μmol/L）共孵育組。先分別用AMI-1 和Resv 預(yù)處理2 h，再與HG 共孵育48 h，然后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

4 PRMT1-siRNA細(xì)胞模型

根據(jù)Lipofectamine?RNAiMAX Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明，構(gòu)建細(xì)胞PRMT1基因沉默模型，將細(xì)胞（1×105）鋪板至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將Lipofectamine?RNAiMAX Reagent 與Opti-MEM 培養(yǎng)液按照每孔用量9 μL∶150 μL混合作為轉(zhuǎn)染混合液；將PRMT1-siRNA 和NT-siRNA 分別混勻于Opti-MEM培養(yǎng)液作為siRNA混合液，終濃度為10 μmol/L；然后將前面得到的轉(zhuǎn)染混合液與siRNA 混合液以1∶1 的比例混勻，在常溫狀態(tài)孵育5 min，得到siRNA 轉(zhuǎn)染試劑，最后將siRNA 轉(zhuǎn)染試劑按照每孔250 μL 加入到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育細(xì)胞48 h。通過Western blot實驗驗證沉默效果。構(gòu)建成功的細(xì)胞模型，再使用HG 處理，分組如下：（1）NT-siRNA 組；（2）NTsiRNA+HG 組；（3）PRMT1-siRNA 組；（4）PRMT1-siRNA+HG 組。HG 孵育時間為48 h，然后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

5 主要實驗方法

5.1 口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT） 根據(jù)已報道的OGTT 方法［18］，將4 組小鼠隔夜禁食12 h 后，經(jīng)尾靜脈采血檢測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），給小鼠一次性灌胃40%葡萄糖溶液（2 g/kg），分別在灌胃后30、60、90和120 min 測定血糖（blood glucose，BG），繪制血糖-時間曲線，并采用梯形法計算曲線下面積（area under the curve，AUC），AUC（mmol/L·min）=1/2×（BG0min+BG30min）×30 min+1/2×（BG30min+BG60min）×30 min+1/2×（BG60min+BG90min）×30 min+1/2×（BG90min+BG120min）×30 min。

5.2 FITC-葡聚糖檢測腸道通透性實驗 根據(jù)已報道的FITC-葡聚糖法檢測腸屏障通透性［19］，4 組小鼠隔夜禁食12 h后，將FITC-葡聚糖溶于無菌生理鹽水（100 g/L）中，給4 組小鼠灌胃FITC-葡聚糖（500 mg/kg），禁水4 h后，用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，從腹主動脈采集血樣避光制備血清，使用Thermo Scientific ?Varioskan ?LUX 多功能熒光酶標(biāo)儀檢測熒光值（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm），并根據(jù)血清FITC-葡聚糖濃度校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

5.3 Western blot實驗 根據(jù)已報道的方法［20］，將結(jié)腸組織或細(xì)胞加入適量體積RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑（100∶1），并在組織破碎儀作用下制備成勻漿液，置于冰上，再4 ℃、10 000×g離心10 min，收集樣本上清液，通過BCA Protein Assay Kit 檢測樣本蛋白濃度，剩余上清液中加入5× loading buffer 再100 ℃煮10 min 進(jìn)行蛋白變性；每個樣本取30 μg 總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 分離蛋白，再經(jīng)過電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，PBST清洗封閉的奶粉后；加入Ⅰ抗抗體并置于小型搖床上4 ℃孵育12 h，回收Ⅰ抗后，PBST 清洗3 次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育2 h，然后PBST洗脫Ⅱ抗，每次10 min；最后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，用ChemiDoc MRS+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）采集圖像，用Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行灰度值分析。

5.4 血脂檢測實驗 根據(jù)TG 試劑盒的操作步驟，利用CPO-PAP酶法檢測各組小鼠血清中的TG含量；根據(jù)TC試劑盒的操作步驟，利用CPO-PAP酶法檢測各組小鼠血清中的TC 含量；根據(jù)HDL-C 試劑盒的操作步驟，利用微板法檢測各組小鼠血清中的HDL-C含量。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），T2DM 組與control組及治療組之間比較采用Dunnet-t檢驗；兩個變量相關(guān)關(guān)系采用Pearson 相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 PRMT1 抑制劑AMI-1 改善T2DM 小鼠血脂代謝

OGTT結(jié)果顯示，與control組相比，T2DM 組小鼠具有顯著的糖耐受異常，檢測到在0、30、60、90 和120 min 的BG 均顯著升高（P＜0.01），見圖1A，且血糖-時間曲線的AUC 也顯著增加（P＜0.01），見圖1B；血脂檢測結(jié)果也顯示，T2DM 組小鼠血清TG 和TC 含量都高于control 組，而HDL-C 含量則低于control 組（P＜0.01），見表1。這些結(jié)果表明T2DM 小鼠模型構(gòu)建成功。此外，與T2DM 組相比，PRMT1抑制劑AMI-1 治療T2DM 小鼠12 周后，觀察到0 和120 min 兩個時點的BG 均降低（P＜0.01），見圖1A，但血糖-時間曲線的AUC 無顯著差異；在血脂指標(biāo)方面，PRMT1抑制劑AMI-1 可顯著降低T2DM 小鼠的血清TG 和TC含量，增加HDL-C含量（P＜0.01），見表1。

表1 PRMT1抑制劑AMI-1對T2DM小鼠血脂代謝的影響Table 1. The effect of PRMT1 inhibitor AMI-1 on lipid metabolism of T2DM mice（mmol/L. Mean±SEM. n=5）

2 PRMT1 抑制劑AMI-1 改善T2DM 小鼠腸屏障功能

與control組相比，T2DM 組小鼠的結(jié)腸長度縮短（P＜0.05），見圖2A；T2DM 小鼠血清FITC-葡聚糖含量顯著升高（P＜0.05），即腸屏障通透性顯著升高，見圖2B；結(jié)腸組織的緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖2C。這表明T2DM 小鼠腸屏障損傷。與T2DM 組相比，PRMT1 抑制劑AMI-1 治療減緩結(jié)腸長度變短，降低腸屏障通透性，增加緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達(dá)（P＜0.05），效果與SIRT1 激動劑Resv基本一致，見圖2。

3 PRMT1 抑制劑AMI-1 上調(diào)T2DM 小鼠結(jié)腸組織SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達(dá)

Western blot 實驗結(jié)果顯示，相對于control 組，T2DM 組小鼠結(jié)腸PRMT1 蛋白表達(dá)顯著升高，而SIRT1 和PGC-1α 蛋白表達(dá)則顯著下降（P＜0.05），見圖3A；Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PRMT1 蛋白表達(dá)與SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見圖3B、C。

4 PRMT1 對HG 環(huán)境下結(jié)腸上皮細(xì)胞中SIRT1/PGC-1α通路的影響

首先量效實驗確定細(xì)胞的給藥濃度，AMI-1 和Resv 的實驗濃度均為30 μmol/L，見圖4A、B。細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，HG 孵育可上調(diào)結(jié)腸上皮細(xì)胞的PRMT1 蛋白表達(dá)，并降低SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)；而PRMT1 抑制劑AMI-1 可抑制HG 誘導(dǎo)的PRMT1 高表達(dá)，并抵抗HG 誘導(dǎo)的SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)抑制（P＜0.05），與SIRT1 激動劑Resv 作用一致，見圖4C。此外，與NT-siRNA 組相比，HG 孵育刺激可上調(diào)轉(zhuǎn)染NT-siRNA 細(xì)胞的PRMT1 蛋白表達(dá)，并降低SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)（P＜0.05）；而與PRMT1-siRNA 組相比，HG 孵育刺激并未能降低轉(zhuǎn)染PRMT1-siRNA 細(xì)胞的SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)（P＞0.05），見圖4D。

Figure 1. The effect of PRMT1 inhibitor AMI-1 on glucose tolerance of T2DM mice determined by oral glucose tolerance test（OGTT）. A：plasma glucose levels in OGTT；B：the area under the concentration-time curve（AUC）. Mean±SEM. n=5.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs T2DM group.圖1 PRMT1抑制劑AMI-1對T2DM小鼠糖耐量的影響

Figure 2. The intestinal barrier function in colonic tissues of T2DM mice after 12-week PRMT1 inhibitor AMI-1 treatment. A：colon length；B：serum FITC-dextran level；C：the protein levels of intestinal barrier indicators ZO-1 and occludin. Mean±SEM.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs T2DM group.圖2 PRMT1抑制劑AMI-1對T2DM小鼠腸屏障功能的影響

Figure 3. Protein levels of PRMT1 and SIRT1/PGC-1α and their correlation in colon tissues of T2DM mice. A：the protein levels of PRMT1 and SIRT1/PGC-1α；B：the correlation between PRMT1 protein and SIRT1 protein；C：the correlation between PRMT1 protein and PGC-1α protein. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs T2DM group.圖3 T2DM小鼠結(jié)腸組織PRMT1和SIRT1/PGC-1α通路的蛋白表達(dá)和相關(guān)性分析

5 PRMT1 對HG 環(huán)境下腸屏障緊密連接蛋白表達(dá)的影響

與control 組相比，HG 可顯著降低結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 表達(dá)；而PRMT1 抑制劑AMI-1 和SIRT1 激動劑Resv 均顯著逆轉(zhuǎn)HG 誘導(dǎo)的緊密連接蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖5A。與NT-siRNA 組相比，HG 孵育刺激可降低轉(zhuǎn)染NTsiRNA細(xì)胞的緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)；而與PRMT1-siRNA 組相比，HG 孵育刺激并未能降低轉(zhuǎn)染PRMT1-siRNA 細(xì)胞的緊密連接蛋白ZO-1 和occludin表達(dá)，見圖5B。

討論

腸上皮屏障具有防止腸內(nèi)高負(fù)荷的細(xì)菌和毒素穿過腸黏膜進(jìn)入人體血液循環(huán)的重要作用，當(dāng)腸道緊密連接蛋白表達(dá)抑制，會導(dǎo)致腸道通透性增加，有毒代謝物滲透進(jìn)入腸內(nèi)，導(dǎo)致持續(xù)的組織損傷，炎癥性腸病患者表現(xiàn)出腸細(xì)胞通透性增加［21-23］。近年大量研究表明，腸道上皮屏障功能異常與T2DM 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腸上皮屏障功能障礙既是T2DM惡化的結(jié)果，也是促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展的重要因素［24-26］。本研究首次觀察到，T2DM 小鼠模型中的腸道屏障功能障礙伴隨著結(jié)腸組織PRMT1 蛋白表達(dá)顯著升高，且PRMT1 抑制劑AMI-1 灌胃治療可顯著改善T2DM小鼠的腸屏障功能。細(xì)胞實驗也顯示，結(jié)腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染PRMT1-siRNA 沉默PRMT1表達(dá)，或者PRMT1 抑制劑AMI-1 共孵育均能顯著抵抗HG 誘導(dǎo)的腸屏障緊密連接蛋白表達(dá)降低。因此，PRMT1 蛋白高表達(dá)可能是導(dǎo)致T2DM 小鼠結(jié)腸屏障功能障礙的重要因素。雖然目前尚未見T2DM 誘導(dǎo)腸道組織PRMT1變化的相關(guān)報道，但有文獻(xiàn)報道，腸屏障功能障礙、腸菌紊亂和炎癥是潰瘍性結(jié)腸炎的重要表征［27］，使用PRMT1 抑制劑AMI-1 可顯著降低結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織PRMT1和PRMT5的表達(dá)，并顯著改善結(jié)腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，緩解結(jié)腸炎的發(fā)展［28］。這些結(jié)果是對本研究觀點的有力佐證，但PRMT1 誘導(dǎo)腸屏障功能障礙的機(jī)制未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。

本研究顯示PRMT1 抑制劑AMI-1 顯著改善T2DM 小鼠的血脂代謝，但并不緩解其糖耐受。也有研究報道了相似的結(jié)果，小鼠脂肪細(xì)胞特異性敲除PRMT1，可激活體內(nèi)能量途徑促進(jìn)體內(nèi)脂肪組織的線粒體脂質(zhì)分解代謝增加，從而減少小鼠的脂肪量，但有趣的是，小鼠的總體體重不變，脂肪外圍組織發(fā)生TG 異位積聚，并促進(jìn)了胰島素抵抗，抑制血糖代謝［29］。也許是由于敲除PRMT1基因與PRMT1 抑制劑藥物治療兩種方式的作用效果相差較大，也可能是因為本研究中AMI-1 的劑量（50 mg/kg）適當(dāng)?shù)仍?，與該研究相比，本研究利用PRMT1抑制劑AMI-1灌胃治療T2DM 小鼠12 周后，只表現(xiàn)出促血脂代謝等作用，并不減輕T2DM 小鼠的糖耐受損傷。機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂是飲食不當(dāng)誘導(dǎo)腸菌紊亂和腸屏障功能損傷的重要原因，攝入過量的膳食脂肪可以不同程度地提高小鼠的腸道通透性和腸道炎癥反應(yīng)［30-31］。我們的前期研究也觀察到，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠出現(xiàn)顯著的腸屏障功能障礙，而利用硝普鈉激活腸道AMPK/SIRT1 能量代謝通路，顯著降低了肥胖小鼠的腸系膜脂肪量，并緩解高脂飲食誘導(dǎo)結(jié)腸長度縮短、腸屏障功能緊密連接蛋白表達(dá)減少和腸屏障通透性增加等［32］。也有其它研究報道，急性或慢性葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的年輕和老年小鼠都出現(xiàn)結(jié)腸炎，表現(xiàn)為體重減輕、結(jié)腸長度縮短、炎癥評分升高、腸屏障功能緊密連接蛋白表達(dá)減少和腸屏障通透性增加等；但也觀察到小鼠表現(xiàn)出肝臟脂肪堆積和血脂代謝異常等，而DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)脂質(zhì)代謝障礙是由于調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的相關(guān)途徑，比如SIRT1/PGC-1α 等途徑被抑制［33］。

Figure 4. The effect of PRMT1 on SIRT1/PGC-1α signaling in colon mucosa cell line NCM-460 after high glucose（HG；50 mmol/L glucose）treatment. A：the dose-response of AMI-1 on expression of PRMT1 protein in combination with HG；B：the doseresponse of resveratrol（Resv）on expression of SIRT1 protein in combination with HG；C：the protein levels of PRMT1 and SIRT1/PGC-1α signaling in normal NCM-460 cells treated with HG；D：the protein levels of PRMT1 and SIRT1/PGC-1α signaling in PRMT1-silencing NCM-460 cells treated with HG. Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group；△△P＜0.01 vs NT-siRNA group.圖4 PRMT1對HG環(huán)境下結(jié)腸上皮細(xì)胞SIRT1/PGC-1α通路影響

Figure 5. The effect of PRMT1 on intestinal barrier indicators ZO-1 and occludin in colon mucosa cell line NCM-460 after high glucose（HG；50 mmol/L glucose）treatment. A：the protein levels of ZO-1 and occludin in normal NCM-460 cells treated with HG；B：the protein levels of ZO-1 and occludin in PRMT1-silencing NCM-460 cells treated with HG. Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group；△△P＜0.01 vs NT-siRNA group.圖5 PRMT1對高糖環(huán)境下腸屏障緊密連接蛋白的影響

SIRT1/PGC-1α 信號通路主要是脫乙酰酶SIRT1激活PGC-1α，參與線粒體生物合成、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等［34-35］。本研究結(jié)果中，SIRT1 激動劑Resv 激活SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)后，顯著促進(jìn)T2DM 小鼠的血脂代謝，改善腸屏障功能；結(jié)腸上皮細(xì)胞實驗也顯示，Resv顯著上調(diào)由HG抑制的緊密連接蛋白表達(dá)。關(guān)于SIRT1 激活劑Resv 減輕腸道炎癥、腸屏障功能障礙和促進(jìn)脂質(zhì)代謝等已被大量報道［36-39］。另 一 種SIRT1 激 活 劑SRT1720 通 過 激 活SIRT1/PGC-1α 信號通路，顯著緩解過氧化氫誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞線粒體氧化損傷和腸屏障緊密連接蛋白（ZO-1 和claudin-1）表達(dá)抑制，而SIRT1 抑制劑EX 527 共孵育則加重過氧化氫誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)減少［8］。以上研究表明SIRT1/PGC-1α信號通路參與調(diào)控腸屏障功能。

本研究還觀察到T2DM 小鼠結(jié)腸組織PRMT1 蛋白高表達(dá)，伴有SIRT1/PGC-1α 通路蛋白降低；且PRMT1 與SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；使用其抑制劑AMI-1 可顯著激活T2DM 小鼠結(jié)腸組織SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)；細(xì)胞實驗也顯示，PRMT1 抑制劑AMI-1 顯著逆轉(zhuǎn)HG 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)抑制，并且當(dāng)細(xì)胞的PRMT1表達(dá)沉默后，HG 未能誘導(dǎo)SIRT1/PGC-1α通路抑制。這些結(jié)果提示，PRMT1 高表達(dá)可能抑制結(jié)腸組織SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)。有研究報道，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒過表達(dá)PRMT1后，可使SIRT1 的表達(dá)顯著抑制［15］；該研究佐證了PRMT1參與調(diào)控SIRT1/PGC-1α通路蛋白表達(dá)。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建T2DM 小鼠模型，揭示了PRMT1高表達(dá)與T2DM 腸上皮屏障功能障礙密切相關(guān)，其機(jī)制可能與抑制SIRT1/PGC-1α 通路蛋白表達(dá)密切相關(guān)；并且提示了PRMT1 抑制劑AMI-1 對糖尿病腸屏障功能較好的治療效果。