李 運(yùn) 李燕君 張國(guó)強(qiáng) 李紅玉 景 明*

1.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院/甘肅省種植中藥材外源性污染物監(jiān)測(cè)工程研究中心，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

熏倒牛為民間常用藏藥，來(lái)源于牻牛兒苗科熏倒牛屬植物BiebersteiniaheterostemonMaxim的干燥全草，由于其花蕊色黑如紫菀，青海藏醫(yī)將其作為明見(jiàn)賽保的代用品[1]，主要分布于甘肅、寧夏六盤山西坡和中衛(wèi)、青海東部和南部、四川西北部(若爾蓋)等地[2]，資源豐富，具有散腫止痛、治熱性炭疽、疔瘡癰疔的功效[1]。據(jù)調(diào)研，民間可用于抑菌、鼻竇炎、腦膜炎及過(guò)敏性疾病等的治療，通常將新鮮的藥材切段后，搗碎、煎煮、去渣、熬至稠膏狀，與其他藥物配伍使用?，F(xiàn)代研究[3-5]表明，熏倒牛主要含有生物堿類、黃酮及其苷類、苯丙素類、脂肪酸類等化合物，具有抑菌[6]、抗炎鎮(zhèn)痛[7]、降血糖[8]等藥理活性。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)熏倒牛藥材提取物毒性研究表明，其口服安全可靠[9]；同時(shí)，利用藥理效應(yīng)法對(duì)其不同提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)熏倒牛70%乙醇提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用顯著[10]。然而，目前關(guān)于熏倒牛藥材的質(zhì)量控制研究相對(duì)較少，僅見(jiàn)其性狀、顯微鑒別與木犀草素[11]、山羊豆堿[12]的含量測(cè)定研究，較系統(tǒng)的對(duì)其所含主要化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。借助于高分辨質(zhì)譜技術(shù)，利用其具有靈敏度高，可提供精確質(zhì)量數(shù)的強(qiáng)大定性能力，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的化合物精確分子質(zhì)量、碎片離子信息及對(duì)照品信息，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，對(duì)熏倒牛中的主要物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行定性分析，從中初步鑒定出 25個(gè)化學(xué)成分，主要為脂環(huán)族有機(jī)酸類、香豆素類、多酚類、蒽醌類及黃酮醇類化合物，并首次鑒定出了熏倒牛中的14個(gè)黃酮類成分，為研究熏倒牛藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此，建立一種靈敏、可靠、快速的方法系統(tǒng)分析和鑒定熏倒牛中的化學(xué)成分，對(duì)該藥材的質(zhì)量控制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1290-6545高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Agilent Technologies，美國(guó))； MS105DU電子天平(Mettler Toledo,瑞士)，SBL-10DT超聲波恒溫清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó))。

1.2 材料 對(duì)照品兒茶素(批號(hào)：110877-201604)、橙皮苷(批號(hào)：110721-202019)、蘆丁(批號(hào)：100080-201811)、槲皮素(批號(hào)：100081-201610)、楊梅苷(批號(hào)：111860-201703)、芹菜素(批號(hào)：111901-201603)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；傘形花內(nèi)酯(批號(hào)：RFS-S02511812016)、異槲皮苷(批號(hào)： RFS-Y07601904023)、芹菜素(批號(hào)： RFS-Q00211801030)、木犀草素(批號(hào)： RFS-M00701904022)均購(gòu)自成都瑞芬思生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜級(jí)，水為Milli-Q超純水，其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)所用樣品信息詳見(jiàn)表1，采集于2019年8月至2020年10月，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)定西校區(qū)張尚智教授鑒定為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物BiebersteiniaheterostemonMaxim的干燥全草。

表1 樣品來(lái)源

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取各對(duì)照品適量，加50%甲醇使其溶解，制成各成分質(zhì)量濃度處于 10～20 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取熏倒牛藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 mL，稱定重量，超聲提取(頻率 40 kHz，功率 300 W)1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.3 色譜條件 采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×150 mm，1.8 μm)； 0.1%甲酸的乙腈(A)和含0.1%甲酸水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～35 min，5%-40%A；35-55 min，40%-95%A；55～60 min，95%-5%A；60～65 min，5%A)，流速：0.250 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式檢測(cè)；碰撞氣為氮?dú)猓桓稍餁饬魉贋?12.0 L·min-1；鞘氣流量為10.0 L·min-1；霧化氣壓力為 40 psi；毛細(xì)管電壓為3500 V；碰撞電壓為135 V；掃描范圍為50～1500 m/z；母離子的 MS/MS 碰撞能為 10～50 eV。

2.5 數(shù)據(jù)采集與處理 數(shù)據(jù)工作站為 MassHunter Version B.06.01軟件，通過(guò)對(duì)所有樣品的離子流圖進(jìn)行比較，遴選代表性藥材進(jìn)行質(zhì)譜解析。

2.6 化學(xué)成分鑒定 查閱藏藥熏倒牛相關(guān)化學(xué)成分研究文獻(xiàn)，并收集化學(xué)成分信息，應(yīng)用MassHunter Version B.06.01、PCDL Manager B.07.00軟件，根據(jù)測(cè)得的精確相對(duì)分子質(zhì)量，在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)(±5.0 ppm)計(jì)算可能的元素組成，并通過(guò)分析各物質(zhì)的保留時(shí)間、分子離子峰、二級(jí)特征碎片離子等信息，結(jié)合對(duì)照品確認(rèn)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)信息，對(duì)化合物進(jìn)行分析鑒定。

3 結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地熏倒牛的總離子流圖比較 對(duì)不同產(chǎn)地熏倒?？傠x子流圖進(jìn)行分析，如圖1所示，結(jié)果提示各產(chǎn)地樣品的 TIC圖基本相似，但各峰相應(yīng)的離子強(qiáng)度有一定差異，說(shuō)明不同產(chǎn)地熏倒牛中的化學(xué)成分種類基本一致，但含量存在差異。其中，甘肅省合作市卡加曼鄉(xiāng)樣品(樣品編號(hào)：BH-01)中各離子強(qiáng)度相對(duì)較高，故以該樣品為典型樣品，對(duì)熏倒牛的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。

3.2 熏倒牛典型樣品中化學(xué)成分的鑒定 采用HPLC-Q-TOF-MS/MS對(duì)樣品1的50%甲醇提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行分析，如圖2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酮類、有機(jī)酸及酚酸類成分在負(fù)離子模式下有較高的響應(yīng)；從該樣品50%甲醇提取物中共鑒定出25個(gè)成分，包括 1個(gè)脂環(huán)族有機(jī)酸類、2個(gè)香豆素類、2個(gè)多酚類、1個(gè)蒽醌類及19個(gè)黃酮類化合物。相關(guān)質(zhì)譜信息見(jiàn)表2。

3.3 主要化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律及結(jié)構(gòu)鑒定 以峰 2 為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 787.2450 [M-H]-，推測(cè)分子式為 C33H40O22。該離子分別失去一分子葡萄糖殘基(C6H10O5)和一分子龍膽雙糖殘基C12H20O10產(chǎn)生碎片離子m/z 625.1861[M-H-162Da]-和m/z 463.1205[M-H-324Da]-。碎片離子 m/z 463.1205分別失去一分子H和一分子葡萄糖殘基C6H10O5產(chǎn)生碎片離子m/z 462.1181和m/z 300.0571。碎片離子 m/z 300.0571繼續(xù)失去一分子H得到碎片離子m/z 299.0498。因此，推斷該化合物為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-O-β-D-龍膽雙糖苷，其二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解規(guī)律如圖3所示。

以峰14為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 463.1244 [M-H]-，推測(cè)分子式為 C21H20O12。該離子分別失去一分子葡萄糖殘基(C6H10O5)產(chǎn)生碎片離子m/z 301.0642[M-H-162Da]-，繼而分別失去一分子中性離子CH2O和一分子中性離子C8H6O3得到碎片離子m/z 271.0552 [M-H-162Da-30Da]-和151.0045 [M-H-162Da-150Da]-。因此，推斷該化合物為異槲皮素，它的二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解規(guī)律如圖4所示。

以峰21 為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 285.0682 [M-H]-，推測(cè)分子式為 C15H10O6。該離子分別失去一分子離子C6H6O2，C8H6O2和C7H4O4產(chǎn)生碎片離子m/z 175.0616[M-H-110Da]-，m/z 151.0232[M-H-134Da]-和m/z 133.0477[M-H-152Da]-。碎片離子m/z 151.0232繼而失去一分子CO2得到碎片離子m/z 107.0301。因此，推斷該化合物為木犀草素，其二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解規(guī)律如圖5所示。

以峰23為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 269.0732[M-H]-，推測(cè)分子式為 C15H10O5。該離子分別失去一分子離子CO2，C8H6O和C7H4O4產(chǎn)生碎片離子m/z 225.0803[M-H-44Da]-，m/z 151.0230 [M-H-118Da]-和m/z 117.0515[M-H-152Da]-。碎片離子m/z 225.0803和m/z 151.0232繼而分別失去一分子C2H2O2和CO2得到碎片離子m/z 183.0669和107.0293。因此，推斷該化合物為芹菜素，其二級(jí)質(zhì)譜圖和可能的裂解規(guī)律如圖6所示。

4 討論

預(yù)試驗(yàn)對(duì)熏倒牛50%甲醇提取物分別進(jìn)行了正、負(fù)離子質(zhì)譜掃描模式考察，總離子流圖提示，熏倒牛藥材50%甲醇提取物的物質(zhì)組成在負(fù)離子掃描模式下具有較好的響應(yīng)值，信息豐富；而在正離子掃描模式下響應(yīng)值較低，且化合物數(shù)量較單一。故本文選用負(fù)離子模式進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集與分析。

本研究基于HPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)，建立了熏倒牛屬植物熏倒牛50%甲醇提取物中主要化合物的快速鑒別方法。對(duì)采集于不同產(chǎn)地、不同海拔的 4批熏倒牛藥材進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分組成基本一致，故從中選擇1批次典型樣品進(jìn)行分析鑒定。通過(guò)檢索、歸納已報(bào)到的熏倒牛屬及其近緣屬植物化學(xué)成分信息、結(jié)合SciFinder 和ChemSpider 等在線質(zhì)譜庫(kù)資源以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，建立熏倒牛屬植物物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)熏倒牛提取物中的25個(gè)化合物進(jìn)行了準(zhǔn)確歸屬。初步鑒定結(jié)果提示，熏倒牛 50%甲醇提取物主要含有黃酮類化合物(tR在11～37 min)，如槲皮素、山奈酚、芹菜素、木犀草素及以其為苷元的多種黃酮苷類成分，此類物質(zhì)在抗氧化、抗菌、抗炎及抗腫瘤等方面具有良好的藥理活性。另在tR為42～60 min內(nèi)的部分化合物尚未能準(zhǔn)確歸屬，有待進(jìn)一步的深入研究。

通過(guò)本研究，建立了一種快速、靈敏、重復(fù)性好的方法對(duì)熏倒牛中主要化學(xué)成分進(jìn)行較系統(tǒng)的定性分析，初步揭示了其主要物質(zhì)基礎(chǔ)，豐富了該藥材的成分信息，為進(jìn)一步挖掘潛在藥用價(jià)值、闡釋藥效機(jī)理及深入開(kāi)發(fā)、綜合利用該資源奠定了基礎(chǔ)。