曾 玥，李龍國，李一晗，譚 霄，譚 博

（1水力學與山區(qū)河流開發(fā)保護國家重點實驗室，成都 610065；2四川大學水利水電學院，成都 610065）

0 引言

水稻是世界上最重要的經濟作物之一，而稻瘟病是影響水稻產量最嚴重的病害之一[1]。稻瘟病能引起氧化脅迫，導致大量的活性氧積累，從而降低植物的活力、影響植物的生長過程，最終導致產量的降低甚至顆粒無收[2-3]。選擇種植抗病品種是一種抗稻瘟病和減少農藥使用污染最有效的方法[4-5]。但由于稻瘟病真菌的高度變異性，抗病品種會喪失抗性[4-5]；化學防治會造成環(huán)境污染[7-8]。所以選擇一種環(huán)境友好的提高水稻稻瘟病抗性的方法有重要的意義。

研究表明，施用外源Si可以有效降低水稻染病程度，改善水稻的生長狀況從而提高水稻產量。Si可以通過物理和生理的方式提高植物的抗病性，水稻吸收的Si素沉積在葉片中，與表皮細胞形成硅化細胞，構成一道限制真菌吸器形成和防止菌絲定殖的物理屏障[9-10]。防御相關酶活性對增強水稻抗病能力具有重要的作用，Si能夠通過提高抗氧化酶活性，如SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（過氧化氫酶）和POD（過氧化物酶）等，降低活性氧的積累，從而緩解病菌侵染引起的氧化脅迫[2,11]。除此之外，Si還能夠通過誘導產生次生抗病害物質如木質素、酚類物質和提高相關抗病基因的表達來提高寄主抗病性[12-13]。因此，Si被證明是一種緩解脅迫的環(huán)境友好的方法，但由于水稻抗逆機制復雜，目前針對外源Si緩解生物脅迫的認識不足，特別是施加Si肥后植物的生長及代謝反饋等。因此，本研究在人工接種稻瘟病菌的條件下，通過向水稻根際土壤添加硅酸鈉作為Si肥，研究外源Si對水稻生長狀況以及防御性相關蛋白酶活性的影響，旨在揭示水稻應激防御系統(tǒng)對外源Si的響應機制，為Si肥的研發(fā)和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻幼苗(Oryza sativa)為‘蓉18B’品種。供試土壤采集于中國四川省邛崍市的水稻田（北緯30°25′，東經103°27′），采樣深度為0～20 cm。經自然風干后用木錘敲碎，經研缽研磨后，過2 mm篩。土壤有機質47.75mg/g，有效Si68.82mg/kg；pH6.46；Eh123.47mV；總氮16 mg/kg。供試外源Si為偏硅酸鈉（Na2SiO3·9H2O，分析純）。試驗于2020年6—9月進行。

1.2 稻瘟菌的培養(yǎng)和分生孢子懸液的制備

稻瘟菌株(Magnaporthe griseae)為Zhong10-8-14菌株。采用燕麥瓊脂培養(yǎng)基，在28℃的生長箱中光照培養(yǎng)1周。用軟毛刷蘸含有1%明膠的無菌水將分生孢子沖洗下來。經雙層紗布過濾后得到分生孢子懸液，分生孢子濃度為1×105/mL。為了研究Si對稻瘟病侵染水稻的發(fā)育情況和產量的影響，在抽穗階段對所有稻穗均勻地噴灑制得的分生孢子懸浮液[14]。

1.3 盆栽試驗

選擇相同大小的水稻幼苗，從稻田移植到裝有5 kg土壤的11 L塑料花盆（直徑27.5 cm，高31 cm）中，每盆種植1株水稻幼苗。試驗設置8個處理：（1）接種條件為接種或不接種稻瘟病菌；（2）每種接種條件下，都設置 4個 Si濃度梯度，即每盆 0、10、50、100 mg/kg SiO2。每個處理重復3次。未接種稻瘟病菌的處理記為-M，接種稻瘟病菌的處理記為+M。

1.4 測定方法

按中華人民共和國國家標準GB/T 15970—1995(2009)的方法測定病穗數(shù)量、產量損失和病情指數(shù)。發(fā)病率、病情指數(shù)和損失率計算見式(1)～(3)。

式(1)中，I為發(fā)病率，P為發(fā)病穗數(shù)，Z為被調查總穗數(shù)；式(2)中，R為病情指數(shù)，Pi為各級發(fā)病數(shù)，D為各級代表值，P為被調查植物總穗數(shù)，DM為最高級代表值；式(3)中，C為損失率，Pi為各級病穗數(shù)，S為各級損失率，P為所調查的總穗數(shù)，SM為最高級損失率。

在移栽后10、25、30、50天時，采集各盆栽土壤樣品；樣品經風干后過2 mm篩，并在分析前保存在密封袋中。采用pH儀（IQ 150，北京奧作生態(tài)儀器）測定土壤pH（土壤與水比為1:2.5）。土壤氧化還原電位(Eh)在土壤表面以下3～4 cm處用Eh計（IQ 150，北京奧作生態(tài)儀器）測定。

在水稻成熟期采集新鮮稻穗樣品，裝于塑封袋中保存在-20℃的冰箱中。水稻收獲后，用剪刀去除根部，將水稻放置在60℃的烘箱中烘干至恒重，進行稱重。采用常規(guī)方法對每株水稻株高、穗數(shù)、穗長和千粒重進行測算。MDA（丙二醛）、CAT和SOD的測定參照薛高峰等[2]的方法；POD和PPO（多酚氧化酶）參照孫萬春等[2]的方法。

采用Excel對試驗數(shù)據進行整理并繪圖。采用SPSS 18.0(IBM，New York，USA)進行統(tǒng)計分析，并用單因素ANOVA檢驗各指標平均值間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 Si對水稻病穗率及病情指數(shù)的影響

外源Si濃度與稻瘟病病情指數(shù)和病穗率的相關關系如圖1所示。病情指數(shù)與病穗率與Si濃度呈負相關關系。最低的病情指數(shù)和病穗率都在Si 100 mg/L組出現(xiàn)，分別比對照組降低了44.47%和41.98%。隨著外源Si濃度逐漸增加，水稻受稻瘟病感染程度和病穗率逐漸降低，表明施Si能夠顯著增強寄主對稻瘟病菌的抗性[16]。

圖1 外源Si濃度與稻瘟病病情指數(shù)和病穗率的相關性

2.2 外源Si對水稻生長狀況的影響

如圖2所示，不同外源Si濃度對水稻株高的影響十分顯著(P＜0.05)。無論水稻是否被稻瘟病菌侵染，水稻株高隨外源Si濃度增加而升高。最高株高出現(xiàn)在Si 100 mg/L組，為(104.17±2.47)cm(-M)和(103.17±2.02 cm)(+M)，分別高于對照10.04%和12.5%。試驗觀測發(fā)現(xiàn)，施Si后水稻植株整體葉片更加挺立。這一結果與高臣[17]研究結果一致，施Si處理水稻的葉傾角比未施Si處理水稻的葉傾角減少了4.8°。因為感病水稻經施Si后葉片不披散，有效地降低了水稻葉傾角，使水稻更加挺直從而獲得了更高的株高。植株挺立，有利于通風且降低了整體濕度，從而形成不利于病菌形成和擴散的環(huán)境[18]。因此，施Si能夠通過改善水稻結構和形態(tài)來抵御稻瘟病菌的發(fā)生、傳播和侵染。

圖2 施加外源Si與稻瘟病侵染影響下水稻株高的變化特征

不同外源Si濃度也顯著地影響了水稻抽穗數(shù)(P＜0.05)。如圖3a所示，外源Si對稻穗數(shù)的影響呈現(xiàn)為隨外源Si濃度的增加而增加的趨勢。與-M組相比，+M組的稻穗數(shù)在每個Si濃度水平上都低于-M處理。最多的稻穗數(shù)出現(xiàn)在不接種處理Si 100 mg/L組中，比對照處理高了60%。如圖3b所示，不同外源Si濃度對水稻稻穗長度的影響與抽穗數(shù)所呈現(xiàn)的趨勢相同。無論是否接種稻瘟病菌，水稻穗長都隨著外源Si濃度的增加而增加。但是-M組水稻的穗長分別比+M組水稻的穗長增加了31.4%、38.9%、28.9%和32.8%。最長的穗長出現(xiàn)在-M組的Si 100 mg/L中，為27.97 cm。水稻吸收更多的Si后，會使導管剛性增強，促進植株的通氣性，從而使分蘗增加和增強水稻抗逆性[18]。張國良等[11]通過研究發(fā)現(xiàn)，施Si可以促進莖蘗成穗，與對照組相比，施Si提高了10%的成穗率。在本試驗中，Si能夠顯著增加水稻的穗數(shù)和穗長，這一結果與Kollalu Sandhya等[11]一致，與對照處理相比，施Si使穗長增加了33.6%～86.4%，這與本研究結果一致。而且水稻在抽穗期對Si的吸收速率會迅速提高，施Si會提高葉片同化能力，促進器官的形成和提早抽穗，使穗數(shù)和穗長增加[21-23]。

圖3 施加外源Si與稻瘟病侵染影響下水稻的抽穗數(shù)及稻穗長度變化特征

2.3 Si對稻瘟病侵染水稻產量的影響

如圖4a所示，不同濃度外源Si對水稻千粒重的影響具有顯著性(P＜0.05)。在不同接種條件下，千粒重都隨外源Si濃度的增加而增加。-M組千粒重比對照組增加了21.91%～48.9%；+M組千粒重比對照組增加了39%～61.2%。與-M組相比，+M組千粒重在每個Si濃度水平上都更高，且在Si 50 mg/L和Si 100 mg/L組呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)。如圖4b所示，外源Si對水稻地上部生物量的影響也呈現(xiàn)出與千粒重相同的趨勢。無論是否接種稻瘟病菌，地上部生物量都隨外源Si濃度的增加而呈現(xiàn)線性增加趨勢，最高的地上部生物量都在Si 100 mg/L組出現(xiàn)，比對照組分別高了38.65%(-M)和43.29%(+M)。-M組地上部生物量在每個Si濃度水平上都顯著高于+M組(P＜0.01)，差異達到25.48%～34.68%。

圖4 施加外源Si與稻瘟病侵染影響下水稻的千粒重及地上部生物量變化特征

由于施Si增強了宿主抗性，降低了感病程度，緩解了被抑制的光合作用[24]，產生了較少枯黃或枯死的葉片，使施Si處理地上部生物量顯著高于未施Si處理[15]。在本試驗中，施Si能夠明顯增加水稻地上部生物量。這可能是由于Si能沉積在葉片、莖稈等表皮細胞中，生成Si化細胞，導致細胞壁增厚，從而形成一道物理屏障抵御病菌的侵染[25-26]。除此之外，施Si能夠彌補稻瘟病對水稻造成的損傷，保證植物能夠正常地進行光合作用，促進有機物的合成和地上部干物質的積累[27-28]。有研究表明，稻瘟病菌絲會穿透穎殼導致雌蕊發(fā)育受阻，影響稻穗的正常發(fā)育生長，導致空殼率的增加[28]。而施Si能夠有效提高穗數(shù)、結實率和千粒重，提高產量[29]。

2.4 Si對稻瘟病侵染水稻MDA及防御性相關蛋白酶活性的影響

如圖5所示，受到稻瘟病侵染水稻的MDA含量在Si 10 mg/L和Si 100 mg/L組中顯著增加(P＜0.05)，且在Si 0 mg/L和Si 50 mg/L組中極顯著增加(P＜0.01)。與-M組相比，+M組的MDA含量在每個Si濃度水平上都更高。MDA含量隨Si濃度的增加而降低，與對照組相比，-M和+M組中最低的MDA含量都在Si 100 mg/L組中出現(xiàn)，分別比對照組低了20.52%和26.79%。與-M處理相比，+M處理中的PPO、SOD和CAT活性都更高，分別提高了7.91%～16.10%、4.54%～22.02%和3.03%～25.00%。在+M處理中，PPO、SOD和CAT的活性與Si濃度呈正相關關系。與對照相比，Si 100 mg/L處理中PPO、SOD和CAT的活性分別提高了52.38%、31%和43.34%。與-M處理相比，+M處理中的POD活性在Si 0 mg/L和Si 10 mg/L組中顯著提高。然而，隨著Si含量的增加，在Si 50 mg/L和Si 100 mg/L中POD的活性顯著降低。

圖5 施加外源Si與稻瘟病侵染影響下水稻的MDA含量及抗氧化酶活性的變化特征

植物被病害侵染時會迅速發(fā)生氧化應激，引起大量活性氧的積累，發(fā)生膜脂過氧化，引起細胞膜電導率下降和細胞膜通透性的增加，最終導致細胞死亡[30]。本試驗中，接種稻瘟病菌的植株MDA含量顯著高于未接種植株，說明+M處理的植物出現(xiàn)了膜脂過氧化的現(xiàn)象。但隨著Si濃度的增加，MDA的含量減少，說明施Si有效地緩解了稻瘟病菌侵染引起的氧化脅迫。有研究表明，植物在受到脅迫時會啟動體內的防御機制，這一機制與上述酶活性的變化密切相關[30]，這些抗氧化酶是清除植物體內活性氧的關鍵物質。本試驗中，施Si處理明顯提高了SOD、PPO和CAT的活性。劉紅芳等[32]研究表明，Si有效地提高了水稻葉片中SOD和CAT的活性，降低水稻葉片中MDA的含量和活性氧，增強水稻對白枯病的抗性，研究結果與本研究結果一致。閆國超等[33]研究認為，外源Si能夠通過提高CAT、POD和SOD的活性來緩解鹽脅迫引起的MDA積累和光合作用的損傷。本試驗中，施Si能夠顯著提高PPO、SOD和CAT的活性，然而在Si 50 mg/L和Si 100 mg/L中POD的活性顯著低于其他組，這一結果與孫萬春[15]一致，而與Cai[34]的結果不一致。這可能是由于施Si明顯降低了水稻感病情況，稻穗受損害較輕，這也表明酶活性與植物抗性有著密切的聯(lián)系。Si不僅是通過建立物理屏障來抵御稻瘟病菌的侵染，同時也在與防御相關的代謝生理過程中起著積極的作用，提高寄主抗性，抵御病菌的侵害。

3 結論

本研究通過盆栽試驗，對水稻人工接種稻瘟病菌并增施Si肥（10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L的SiO2，Na2SiO3·9H2O分析純）。結果表明，施Si顯著降低了水稻病穗率及病情指數(shù)，最高達44.47%和41.98%；與對照組相比，未接種處理和接種處理的株高分別高于對照組10.04%和12.5%。在接種處理中，施Si有效緩解了稻瘟病對植株造成的損傷，改善了水稻的生長狀況，使千粒重和地上部生物量分別提高了39%～61.2%和28.66%～34.68%。施Si強化了水稻的防御系統(tǒng)，提高了PPO、CAT和SOD，而POD的活性在Si 50和Si 100組中明顯降低，可能是由于施Si降低了水稻感病情況，稻穗受損害較輕。施Si能夠有效減輕水稻稻瘟病，增強水稻對稻瘟病菌的抗性。Si使水稻更加挺直，形成不易于稻瘟病菌繁殖、傳播和侵染的環(huán)境。除此之外，Si能夠提高水稻在稻瘟病侵染條件下的莖蘗成穗率，有效提高穗數(shù)和穗長，增加了干物質量積累和千粒重。施Si能夠通過增強抗氧化酶的活性，降低MDA的積累及活性氧對植株的損害，減輕氧化損害，提高了寄主的抗性，最終提高產量。綜上所述，施Si不只是單一地作為物理屏障來抵御稻瘟病菌的侵害，還會提高相關酶活性，有著至關重要的生理生化抗病害作用。然而偏硅酸鈉易溶于水，隨著時間的流逝，易溶于水的Si肥和土壤中的可溶性Si會向土壤下層淋溶，如何及時有效地補充土壤Si素、提高Si肥利用效率仍需要進一步的研究。除此之外，植物抗病害的生理代謝過程十分復雜，尚需要進一步的研究和驗證。