曾 玥，李龍國(guó)，李一晗，譚 霄，譚 博

（1水力學(xué)與山區(qū)河流開發(fā)保護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065；2四川大學(xué)水利水電學(xué)院，成都 610065）

0 引言

水稻是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，而稻瘟病是影響水稻產(chǎn)量最嚴(yán)重的病害之一[1]。稻瘟病能引起氧化脅迫，導(dǎo)致大量的活性氧積累，從而降低植物的活力、影響植物的生長(zhǎng)過程，最終導(dǎo)致產(chǎn)量的降低甚至顆粒無收[2-3]。選擇種植抗病品種是一種抗稻瘟病和減少農(nóng)藥使用污染最有效的方法[4-5]。但由于稻瘟病真菌的高度變異性，抗病品種會(huì)喪失抗性[4-5]；化學(xué)防治會(huì)造成環(huán)境污染[7-8]。所以選擇一種環(huán)境友好的提高水稻稻瘟病抗性的方法有重要的意義。

研究表明，施用外源Si可以有效降低水稻染病程度，改善水稻的生長(zhǎng)狀況從而提高水稻產(chǎn)量。Si可以通過物理和生理的方式提高植物的抗病性，水稻吸收的Si素沉積在葉片中，與表皮細(xì)胞形成硅化細(xì)胞，構(gòu)成一道限制真菌吸器形成和防止菌絲定殖的物理屏障[9-10]。防御相關(guān)酶活性對(duì)增強(qiáng)水稻抗病能力具有重要的作用，Si能夠通過提高抗氧化酶活性，如SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（過氧化氫酶）和POD（過氧化物酶）等，降低活性氧的積累，從而緩解病菌侵染引起的氧化脅迫[2,11]。除此之外，Si還能夠通過誘導(dǎo)產(chǎn)生次生抗病害物質(zhì)如木質(zhì)素、酚類物質(zhì)和提高相關(guān)抗病基因的表達(dá)來提高寄主抗病性[12-13]。因此，Si被證明是一種緩解脅迫的環(huán)境友好的方法，但由于水稻抗逆機(jī)制復(fù)雜，目前針對(duì)外源Si緩解生物脅迫的認(rèn)識(shí)不足，特別是施加Si肥后植物的生長(zhǎng)及代謝反饋等。因此，本研究在人工接種稻瘟病菌的條件下，通過向水稻根際土壤添加硅酸鈉作為Si肥，研究外源Si對(duì)水稻生長(zhǎng)狀況以及防御性相關(guān)蛋白酶活性的影響，旨在揭示水稻應(yīng)激防御系統(tǒng)對(duì)外源Si的響應(yīng)機(jī)制，為Si肥的研發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻幼苗(Oryza sativa)為‘蓉18B’品種。供試土壤采集于中國(guó)四川省邛崍市的水稻田（北緯30°25′，東經(jīng)103°27′），采樣深度為0～20 cm。經(jīng)自然風(fēng)干后用木錘敲碎，經(jīng)研缽研磨后，過2 mm篩。土壤有機(jī)質(zhì)47.75mg/g，有效Si68.82mg/kg；pH6.46；Eh123.47mV；總氮16 mg/kg。供試外源Si為偏硅酸鈉（Na2SiO3·9H2O，分析純）。試驗(yàn)于2020年6—9月進(jìn)行。

1.2 稻瘟菌的培養(yǎng)和分生孢子懸液的制備

稻瘟菌株(Magnaporthe griseae)為Zhong10-8-14菌株。采用燕麥瓊脂培養(yǎng)基，在28℃的生長(zhǎng)箱中光照培養(yǎng)1周。用軟毛刷蘸含有1%明膠的無菌水將分生孢子沖洗下來。經(jīng)雙層紗布過濾后得到分生孢子懸液，分生孢子濃度為1×105/mL。為了研究Si對(duì)稻瘟病侵染水稻的發(fā)育情況和產(chǎn)量的影響，在抽穗階段對(duì)所有稻穗均勻地噴灑制得的分生孢子懸浮液[14]。

1.3 盆栽試驗(yàn)

選擇相同大小的水稻幼苗，從稻田移植到裝有5 kg土壤的11 L塑料花盆（直徑27.5 cm，高31 cm）中，每盆種植1株水稻幼苗。試驗(yàn)設(shè)置8個(gè)處理：（1）接種條件為接種或不接種稻瘟病菌；（2）每種接種條件下，都設(shè)置 4個(gè) Si濃度梯度，即每盆 0、10、50、100 mg/kg SiO2。每個(gè)處理重復(fù)3次。未接種稻瘟病菌的處理記為-M，接種稻瘟病菌的處理記為+M。

1.4 測(cè)定方法

按中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15970—1995(2009)的方法測(cè)定病穗數(shù)量、產(chǎn)量損失和病情指數(shù)。發(fā)病率、病情指數(shù)和損失率計(jì)算見式(1)～(3)。

式(1)中，I為發(fā)病率，P為發(fā)病穗數(shù)，Z為被調(diào)查總穗數(shù)；式(2)中，R為病情指數(shù)，Pi為各級(jí)發(fā)病數(shù)，D為各級(jí)代表值，P為被調(diào)查植物總穗數(shù)，DM為最高級(jí)代表值；式(3)中，C為損失率，Pi為各級(jí)病穗數(shù)，S為各級(jí)損失率，P為所調(diào)查的總穗數(shù)，SM為最高級(jí)損失率。

在移栽后10、25、30、50天時(shí)，采集各盆栽土壤樣品；樣品經(jīng)風(fēng)干后過2 mm篩，并在分析前保存在密封袋中。采用pH儀（IQ 150，北京奧作生態(tài)儀器）測(cè)定土壤pH（土壤與水比為1:2.5）。土壤氧化還原電位(Eh)在土壤表面以下3～4 cm處用Eh計(jì)（IQ 150，北京奧作生態(tài)儀器）測(cè)定。

在水稻成熟期采集新鮮稻穗樣品，裝于塑封袋中保存在-20℃的冰箱中。水稻收獲后，用剪刀去除根部，將水稻放置在60℃的烘箱中烘干至恒重，進(jìn)行稱重。采用常規(guī)方法對(duì)每株水稻株高、穗數(shù)、穗長(zhǎng)和千粒重進(jìn)行測(cè)算。MDA（丙二醛）、CAT和SOD的測(cè)定參照薛高峰等[2]的方法；POD和PPO（多酚氧化酶）參照孫萬春等[2]的方法。

采用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并繪圖。采用SPSS 18.0(IBM，New York，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用單因素ANOVA檢驗(yàn)各指標(biāo)平均值間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Si對(duì)水稻病穗率及病情指數(shù)的影響

外源Si濃度與稻瘟病病情指數(shù)和病穗率的相關(guān)關(guān)系如圖1所示。病情指數(shù)與病穗率與Si濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。最低的病情指數(shù)和病穗率都在Si 100 mg/L組出現(xiàn)，分別比對(duì)照組降低了44.47%和41.98%。隨著外源Si濃度逐漸增加，水稻受稻瘟病感染程度和病穗率逐漸降低，表明施Si能夠顯著增強(qiáng)寄主對(duì)稻瘟病菌的抗性[16]。

圖1 外源Si濃度與稻瘟病病情指數(shù)和病穗率的相關(guān)性

2.2 外源Si對(duì)水稻生長(zhǎng)狀況的影響

如圖2所示，不同外源Si濃度對(duì)水稻株高的影響十分顯著(P＜0.05)。無論水稻是否被稻瘟病菌侵染，水稻株高隨外源Si濃度增加而升高。最高株高出現(xiàn)在Si 100 mg/L組，為(104.17±2.47)cm(-M)和(103.17±2.02 cm)(+M)，分別高于對(duì)照10.04%和12.5%。試驗(yàn)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，施Si后水稻植株整體葉片更加挺立。這一結(jié)果與高臣[17]研究結(jié)果一致，施Si處理水稻的葉傾角比未施Si處理水稻的葉傾角減少了4.8°。因?yàn)楦胁∷窘?jīng)施Si后葉片不披散，有效地降低了水稻葉傾角，使水稻更加挺直從而獲得了更高的株高。植株挺立，有利于通風(fēng)且降低了整體濕度，從而形成不利于病菌形成和擴(kuò)散的環(huán)境[18]。因此，施Si能夠通過改善水稻結(jié)構(gòu)和形態(tài)來抵御稻瘟病菌的發(fā)生、傳播和侵染。

圖2 施加外源Si與稻瘟病侵染影響下水稻株高的變化特征

不同外源Si濃度也顯著地影響了水稻抽穗數(shù)(P＜0.05)。如圖3a所示，外源Si對(duì)稻穗數(shù)的影響呈現(xiàn)為隨外源Si濃度的增加而增加的趨勢(shì)。與-M組相比，+M組的稻穗數(shù)在每個(gè)Si濃度水平上都低于-M處理。最多的稻穗數(shù)出現(xiàn)在不接種處理Si 100 mg/L組中，比對(duì)照處理高了60%。如圖3b所示，不同外源Si濃度對(duì)水稻稻穗長(zhǎng)度的影響與抽穗數(shù)所呈現(xiàn)的趨勢(shì)相同。無論是否接種稻瘟病菌，水稻穗長(zhǎng)都隨著外源Si濃度的增加而增加。但是-M組水稻的穗長(zhǎng)分別比+M組水稻的穗長(zhǎng)增加了31.4%、38.9%、28.9%和32.8%。最長(zhǎng)的穗長(zhǎng)出現(xiàn)在-M組的Si 100 mg/L中，為27.97 cm。水稻吸收更多的Si后，會(huì)使導(dǎo)管剛性增強(qiáng)，促進(jìn)植株的通氣性，從而使分蘗增加和增強(qiáng)水稻抗逆性[18]。張國(guó)良等[11]通過研究發(fā)現(xiàn)，施Si可以促進(jìn)莖蘗成穗，與對(duì)照組相比，施Si提高了10%的成穗率。在本試驗(yàn)中，Si能夠顯著增加水稻的穗數(shù)和穗長(zhǎng)，這一結(jié)果與Kollalu Sandhya等[11]一致，與對(duì)照處理相比，施Si使穗長(zhǎng)增加了33.6%～86.4%，這與本研究結(jié)果一致。而且水稻在抽穗期對(duì)Si的吸收速率會(huì)迅速提高，施Si會(huì)提高葉片同化能力，促進(jìn)器官的形成和提早抽穗，使穗數(shù)和穗長(zhǎng)增加[21-23]。

圖3 施加外源Si與稻瘟病侵染影響下水稻的抽穗數(shù)及稻穗長(zhǎng)度變化特征

2.3 Si對(duì)稻瘟病侵染水稻產(chǎn)量的影響

如圖4a所示，不同濃度外源Si對(duì)水稻千粒重的影響具有顯著性(P＜0.05)。在不同接種條件下，千粒重都隨外源Si濃度的增加而增加。-M組千粒重比對(duì)照組增加了21.91%～48.9%；+M組千粒重比對(duì)照組增加了39%～61.2%。與-M組相比，+M組千粒重在每個(gè)Si濃度水平上都更高，且在Si 50 mg/L和Si 100 mg/L組呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)。如圖4b所示，外源Si對(duì)水稻地上部生物量的影響也呈現(xiàn)出與千粒重相同的趨勢(shì)。無論是否接種稻瘟病菌，地上部生物量都隨外源Si濃度的增加而呈現(xiàn)線性增加趨勢(shì)，最高的地上部生物量都在Si 100 mg/L組出現(xiàn)，比對(duì)照組分別高了38.65%(-M)和43.29%(+M)。-M組地上部生物量在每個(gè)Si濃度水平上都顯著高于+M組(P＜0.01)，差異達(dá)到25.48%～34.68%。

圖4 施加外源Si與稻瘟病侵染影響下水稻的千粒重及地上部生物量變化特征

由于施Si增強(qiáng)了宿主抗性，降低了感病程度，緩解了被抑制的光合作用[24]，產(chǎn)生了較少枯黃或枯死的葉片，使施Si處理地上部生物量顯著高于未施Si處理[15]。在本試驗(yàn)中，施Si能夠明顯增加水稻地上部生物量。這可能是由于Si能沉積在葉片、莖稈等表皮細(xì)胞中，生成Si化細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞壁增厚，從而形成一道物理屏障抵御病菌的侵染[25-26]。除此之外，施Si能夠彌補(bǔ)稻瘟病對(duì)水稻造成的損傷，保證植物能夠正常地進(jìn)行光合作用，促進(jìn)有機(jī)物的合成和地上部干物質(zhì)的積累[27-28]。有研究表明，稻瘟病菌絲會(huì)穿透穎殼導(dǎo)致雌蕊發(fā)育受阻，影響稻穗的正常發(fā)育生長(zhǎng)，導(dǎo)致空殼率的增加[28]。而施Si能夠有效提高穗數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重，提高產(chǎn)量[29]。

2.4 Si對(duì)稻瘟病侵染水稻MDA及防御性相關(guān)蛋白酶活性的影響

如圖5所示，受到稻瘟病侵染水稻的MDA含量在Si 10 mg/L和Si 100 mg/L組中顯著增加(P＜0.05)，且在Si 0 mg/L和Si 50 mg/L組中極顯著增加(P＜0.01)。與-M組相比，+M組的MDA含量在每個(gè)Si濃度水平上都更高。MDA含量隨Si濃度的增加而降低，與對(duì)照組相比，-M和+M組中最低的MDA含量都在Si 100 mg/L組中出現(xiàn)，分別比對(duì)照組低了20.52%和26.79%。與-M處理相比，+M處理中的PPO、SOD和CAT活性都更高，分別提高了7.91%～16.10%、4.54%～22.02%和3.03%～25.00%。在+M處理中，PPO、SOD和CAT的活性與Si濃度呈正相關(guān)關(guān)系。與對(duì)照相比，Si 100 mg/L處理中PPO、SOD和CAT的活性分別提高了52.38%、31%和43.34%。與-M處理相比，+M處理中的POD活性在Si 0 mg/L和Si 10 mg/L組中顯著提高。然而，隨著Si含量的增加，在Si 50 mg/L和Si 100 mg/L中POD的活性顯著降低。

圖5 施加外源Si與稻瘟病侵染影響下水稻的MDA含量及抗氧化酶活性的變化特征

植物被病害侵染時(shí)會(huì)迅速發(fā)生氧化應(yīng)激，引起大量活性氧的積累，發(fā)生膜脂過氧化，引起細(xì)胞膜電導(dǎo)率下降和細(xì)胞膜通透性的增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[30]。本試驗(yàn)中，接種稻瘟病菌的植株MDA含量顯著高于未接種植株，說明+M處理的植物出現(xiàn)了膜脂過氧化的現(xiàn)象。但隨著Si濃度的增加，MDA的含量減少，說明施Si有效地緩解了稻瘟病菌侵染引起的氧化脅迫。有研究表明，植物在受到脅迫時(shí)會(huì)啟動(dòng)體內(nèi)的防御機(jī)制，這一機(jī)制與上述酶活性的變化密切相關(guān)[30]，這些抗氧化酶是清除植物體內(nèi)活性氧的關(guān)鍵物質(zhì)。本試驗(yàn)中，施Si處理明顯提高了SOD、PPO和CAT的活性。劉紅芳等[32]研究表明，Si有效地提高了水稻葉片中SOD和CAT的活性，降低水稻葉片中MDA的含量和活性氧，增強(qiáng)水稻對(duì)白枯病的抗性，研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。閆國(guó)超等[33]研究認(rèn)為，外源Si能夠通過提高CAT、POD和SOD的活性來緩解鹽脅迫引起的MDA積累和光合作用的損傷。本試驗(yàn)中，施Si能夠顯著提高PPO、SOD和CAT的活性，然而在Si 50 mg/L和Si 100 mg/L中POD的活性顯著低于其他組，這一結(jié)果與孫萬春[15]一致，而與Cai[34]的結(jié)果不一致。這可能是由于施Si明顯降低了水稻感病情況，稻穗受損害較輕，這也表明酶活性與植物抗性有著密切的聯(lián)系。Si不僅是通過建立物理屏障來抵御稻瘟病菌的侵染，同時(shí)也在與防御相關(guān)的代謝生理過程中起著積極的作用，提高寄主抗性，抵御病菌的侵害。

3 結(jié)論

本研究通過盆栽試驗(yàn)，對(duì)水稻人工接種稻瘟病菌并增施Si肥（10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L的SiO2，Na2SiO3·9H2O分析純）。結(jié)果表明，施Si顯著降低了水稻病穗率及病情指數(shù)，最高達(dá)44.47%和41.98%；與對(duì)照組相比，未接種處理和接種處理的株高分別高于對(duì)照組10.04%和12.5%。在接種處理中，施Si有效緩解了稻瘟病對(duì)植株造成的損傷，改善了水稻的生長(zhǎng)狀況，使千粒重和地上部生物量分別提高了39%～61.2%和28.66%～34.68%。施Si強(qiáng)化了水稻的防御系統(tǒng)，提高了PPO、CAT和SOD，而POD的活性在Si 50和Si 100組中明顯降低，可能是由于施Si降低了水稻感病情況，稻穗受損害較輕。施Si能夠有效減輕水稻稻瘟病，增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。Si使水稻更加挺直，形成不易于稻瘟病菌繁殖、傳播和侵染的環(huán)境。除此之外，Si能夠提高水稻在稻瘟病侵染條件下的莖蘗成穗率，有效提高穗數(shù)和穗長(zhǎng)，增加了干物質(zhì)量積累和千粒重。施Si能夠通過增強(qiáng)抗氧化酶的活性，降低MDA的積累及活性氧對(duì)植株的損害，減輕氧化損害，提高了寄主的抗性，最終提高產(chǎn)量。綜上所述，施Si不只是單一地作為物理屏障來抵御稻瘟病菌的侵害，還會(huì)提高相關(guān)酶活性，有著至關(guān)重要的生理生化抗病害作用。然而偏硅酸鈉易溶于水，隨著時(shí)間的流逝，易溶于水的Si肥和土壤中的可溶性Si會(huì)向土壤下層淋溶，如何及時(shí)有效地補(bǔ)充土壤Si素、提高Si肥利用效率仍需要進(jìn)一步的研究。除此之外，植物抗病害的生理代謝過程十分復(fù)雜，尚需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。