亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        柱前衍生化HPLC法測定藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸含量

        2022-05-30 16:43:28李運張國強高鵬李紅玉景明魏鋒

        李運 張國強 高鵬 李紅玉 景明 魏鋒

        【摘要】目的:建立柱前衍生化HPLC法測定藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸的含量。方法:供試品在一定量6 moL·L-1鹽酸中110 ℃水解6 h,與異硫氰酸苯酯進行衍生化反應。采用CAPCELL PAK-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,以80%乙腈溶液(A)-0.056 moL·L-1乙酸鈉緩沖液(B)為流動相,梯度洗脫(0~15 min,5%A;15~20 min,5%A→20%A;20~35 min,20%A→36%A;35~45 min,36%A→70%A;45~50 min,70%→90%A;50~55 min,90%A;55~56 min,90%A→5%A;56~60 min,5%A),流速為1.0 mL·min-1,檢測波長254 nm,色譜柱溫度40 ℃。結果:15種氨基酸衍生物能夠達到基線分離,在0.96~58.56 μg·mL-1范圍內線性關系良好,r≥0.9991,精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗的RSD值分別小于2.73%、2.85%、2.89%,加樣回收率介于95.2%~104.4%之間,RSD值均小于2.46%。經(jīng)測定,3 批熏倒牛種子中氨基酸總含量分別為1.64%、1.55%和1.08%。結論:此法簡便易行,可用于藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸的含量測定。

        【關鍵詞】藏藥;熏倒牛;種子;氨基酸含量;高效液相色譜法

        【中圖分類號】R284【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517(2022)04-0048-05

        Determination of 15 amino acids in Biebersteinia heterostemon Maxim seeds by precolumn derivation HPLC

        LI Yun1,2ZHANG Guoqiang3GAO Peng1LI Hongyu2JING Ming3WEI Feng4

        1.Lanzhou Institute for Food and Drug Control /Gansu Engineering Research Center for Monitoring

        Exogenous Harmful Residues in Traditional Chinese Medicines, Lanzhou 730030, China;

        2.Pharmacy College of Lanzhou University,Lanzhou 730000, China;

        3.Pharmacy Collage of Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000, China;

        4.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China

        Abstract:Objective To establish a precolumn derivation HPLC method for the determination of 15 amino acids in Biebersteinia heterostemon Maxim seeds. Methods The sample was hydrolyzed in 6 moL·L-1 hydrochloric acid at 110 ℃ for 6 hours,and derivatized with phenyl isothiocyanate (PITC).The analysis was carried out on a CAPCELL PAK-C18 chromatographic column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with 80% acetonitrile(A)- 0.056 mol·L-1 sodium acetate buffer (B) as mobile phase by gradient elution(0~15 min,5%A;15~20 min,5%A→20%A;20~35 min,20%A→36%A;35~45min,36%A→70%A;45~50 min,70%→90%A;50~55 min,90%A;55~56 min,90%A→5%A;56~60 min,5%A),at a flow rate of 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was 254 nm, the column temperature was set at 40 ℃. Results The 15 amino acids were able to achieve baseline separation in a good linear range of 0.96~58.56 μg·mL-1(r≥0.9991).The RSD values of precision, repeatability and stability tests were respectively less than 2.73%、2.85%、2.89%, and the recoveries of the 15 amino acids (n=6,RSD<2.46%) were between 95.2% and 104.4%. The total contents of the amino acids in three batches of Biebersteinia heterostemon Maxim seeds were 1.64%、1.55%和1.08%.Conclusion This method is simple and easy to operate. It can be used for the determination of 15 amino acids in Tibetan medicine Biebersteinia heterostemon Maxim seeds.

        Keywords:Tibetan Medicine; Biebersteinia heterostemon Maxim;Seeds; Amino Acid Contents; HPLC

        藏藥熏倒牛(Biebersteinia heterostemon Maxim.)為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物,是藏藥“明見賽?!钡脑参飦碓粗?[1]。具有清熱解毒、散腫止痛、清血熱、祛風毒的功效,用于治療各種炎癥、結核癥、丹毒、瘧疾、咽喉腫痛、胃痛、全身水腫、中風等疾病[2]。目前,國內外學者主要側重于熏倒牛中主要化學成分的分離鑒定及初步的藥理活性研究,發(fā)現(xiàn)其主要含有黃酮、生物堿、苯丙素、香豆素、甾醇、糖類、揮發(fā)油和萜類等化合物[3-6],并具有抗氧化[7]、降血糖[8]等活性,民間用于治療小兒驚厥、抽搐、感冒發(fā)熱等。在藏區(qū)的走訪調研中發(fā)現(xiàn),熏倒牛種子可用于治療各種炎癥類、膽囊類疾病及喉蛾、疔瘡等。民族藥用于疾病的治療,藥效的發(fā)揮往往基于多成分多靶點的共同作用,對于熏倒牛種子的研究,僅見于對其籽油中脂肪酸成分的分析[9],從其中鑒定出11種脂肪酸類化合物,主要為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等成分,不飽和脂肪酸為74.23%,其中亞油酸含量為73.04%。

        氨基酸類成分是重要的生命物質,是組成蛋白質和酶的基本單元,能夠增強機體免疫力、調節(jié)新陳代謝等[10]。對于熏倒牛種子中氨基酸的相關研究,未見報道。本文采用柱前衍生化法,利用氨基酸在偏堿性環(huán)境下,與異硫氰酸苯酯反應生成硫脲,經(jīng)分子內環(huán)化,生成乙內酰苯硫脲類化合物,可用高效液相色譜儀進行定量分析。通過掌握熏倒牛種子中的氨基酸含量,以期為進一步研究藏藥熏倒牛藥材中的化學成分,深入挖掘其用藥潛力和價值提供參考。

        1儀器與材料

        1.1儀器Waters e2695高效液相色譜儀(包括四元泵、Waters 2998 PDA 檢測器、自動進樣器及 Empower工作站,美國Waters公司);MS205DU型十萬分之一分析天平(瑞士Mettle Toledo公司);Milli-Q IQ 7000超純水系統(tǒng)(德國默克密理博公司);SBL-10DT超聲波恒溫清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);微量移液器(德國eppendorf股份公司)。

        1.2材料谷氨酸(批號:140690-201604,含量99.9%)、甘氨酸(批號:140689-201605,含量100%)、精氨酸(批號:140685-201707,含量99.9%)、蘇氨酸(批號:140682-201302,含量99.9%)、丙氨酸(批號:140680-201604,含量100%)、酪氨酸(批號:140609-201513,含量99.8%)、纈氨酸(批號:140681-201703,含量99.5%)、異亮氨酸(批號:140683-201302,含量99.9%)、亮氨酸(批號:140687-201804,含量99.9%)、苯丙氨酸(批號:140676-201706,含量100%)、鹽酸賴氨酸(批號:140673-201509,含量99.9%),均由中國食品藥品檢定研究院提供;L-絲氨酸(批號:B21932,含量98.0%)、L-脯氨酸(批號:B21914,含量99.0%)、L-蛋氨酸(批號:B21913,含量98.0%)、L-色氨酸(批號:B21930,含量98.0%),均由上海源葉生物科技有限公司提供;乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

        實驗所用熏倒牛種子,分別采自于甘肅省合作市(樣品編號S1、S2)、甘肅省定西市安定區(qū)(樣品編號S3),并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院景明教授鑒定為牻牛兒苗科熏倒牛屬植物Biebersteinia heterostemon Maxim.的干燥成熟種子。

        2方法與結果

        2.1色譜條件采用色譜柱:CAPCELL PAK-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為80%乙腈溶液(A)-0.056 mol·L-1乙酸鈉緩沖液(B);流速為1 mL·min-1;檢測波長254 nm;色譜柱溫度40 ℃;進樣體積:10 μL。梯度洗脫程序:0~15 min,5%A;15~20 min,5%A→20%A;20~35 min,20%A→36%A;35~45 min,36%A→70%A;45~50 min,70%→90%A;50~55 min,90%A;55~56 min,90%A→5%A;56~60 min,5%A。

        2.2溶液的制備

        2.2.1乙酸鈉緩沖溶液取三水合乙酸鈉7.587 g,加水850 mL,冰醋酸調節(jié)PH=6.5(約2滴),加水75 mL,乙腈70 mL,配制成濃度為0.056 moL·L-1的乙酸鈉緩沖液。

        2.2.20.1moL·L-1的異硫氰酸苯酯(PITC)精密移取 PITC 0.30 mL,加入乙腈定容至25 mL,搖勻即得。

        2.2.31.0moL·L-1三乙胺溶液移取三乙胺3.475 mL,加入乙腈定容至 25 mL,搖勻即得。

        2.2.4對照品溶液衍生化溶液的配制分別精密稱取15種氨基酸對照品適量,用0.1 moL·L-1鹽酸定容于10 mL容量瓶,配制成一定濃度的對照品溶液,分別取各濃度氨基酸對照品溶液適量,配制成每1毫升含有谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鹽酸賴氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸分別為58.56 μg、11.38 μg、20.56 μg、18.88 μg、10.36 μg、21.04 μg、21.92 μg、10.02 μg、9.62 μg、10.72 μg、10.1 μg、19.48 μg、10.04 μg、10.04 μg、19.68 μg的混合標準溶液,取上述溶液1 mL,加入0.1 moL·L-1的PITC及1moL·L-1三乙胺乙腈溶液各0.5 mL。

        2.2.5供試品衍生化溶液的制備取藏藥熏倒牛種子粗粉約0.2 g,置于10 mL玻璃頂空瓶中,加6 moL·L-1鹽酸溶液5 mL,充氮氣后壓蓋密封,于110 ℃烘箱中水解6 h,取出后放冷,揮干溶劑,殘渣加0.1 moL·L-1鹽酸溶液定容至10 mL容量瓶中;取其1 mL分別加入0.1 moL·L-1的PITC乙腈溶液、1 mol·L-1三乙胺乙腈溶液各0.5 mL,充分混勻,放置1 h,加入2 mL正己烷,混勻,靜置10 min,取2 mL定容于5 mL容量瓶中,即得。

        2.2.6空白衍生化溶液的制備用0.1 moL·L-1鹽酸溶液代替樣品,同“2.2.5”項下方法制備,即得。

        2.3方法學考察

        2.3.1系統(tǒng)適用性實驗精密吸取“2.2.4”項下制備的對照品溶液和“2.2.5”項下制備的供試品溶液各10 μL,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。結果表明,供試品中各氨基酸色譜峰保留時間與對照品溶液各色譜峰保留時間一致,目標峰與相鄰色譜峰的分離度均>1.5,理論塔板數(shù)以谷氨酸峰計大于9000,色譜圖如圖1所示。

        2.3.2線性關系考察分別精密吸取“2.2.4”項下制備的對照品溶液適量,按照供試品溶液中各氨基酸的實際含量,配制系列濃度的對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL,測定色譜峰面積。以對照品溶液中各標準品的質量濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標,對照品溶液中各標準品的峰面積(Y)為縱坐標,繪制標準曲線。結果表明,谷氨酸等15種氨基酸在各自的線性范圍內與色譜峰面積的積分值呈良好線性關系,回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍見表1。

        2.3.3精密度試驗取“2.2.5”項下供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖,計算峰面積。結果顯示,各氨基酸質量濃度的RSD值均小于2.73%,表明儀器精密度良好。

        2.3.4重復性試驗取“2.2.5”項下供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖,計算峰面積。結果顯示,各氨基酸的平均含量和RSD值分別為1.947 mg·g-1、0.592 mg·g-1、1.783 mg·g-1、0.975 mg·g-1、0.556 mg·g-1、0.349 mg·g-1、1.264 mg·g-1、0.379 mg·g-1、0.440 mg·g-1、0.814 mg·g-1、0.331 mg·g-1、0.713 mg·g-1、0.407 mg·g-1、0.445 mg·g-1、0.864 mg·g-1和2.85%、1.67%、2.13%、1.97%、2.60%、1.67%、2.55%、0.91%、1.32%、0.62%、2.40%、2.12%、1.60%、0.79%、2.57 %。

        2.3.5穩(wěn)定性試驗取“2.2.5”項下供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件,分別在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h測定,記錄各組分色譜峰,計算峰面積。測得各氨基酸成分的色譜峰面積的RSD值分別為1.43%、2.89%、2.65%、2.19%、1.97%、1.87%、1.11%、0.92%、2.58%、0.98%、2.44%、0.63%、1.92%、2.04%、2.60%,表明樣品在8 h內的穩(wěn)定性良好。

        2.3.6加樣回收率試驗精密稱取編號S1的藏藥熏倒牛樣品0.1 g,共6份,加入各標準品溶液適量,按照“2.2.5”項下制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣,記錄色譜圖,計算回收率,結果見表1,加樣回收率試驗中15種氨基酸的平均回收率及RSD值分別為95.16%、101.99%、104.02%、102.03%、96.99%、100.70%、95.35%、101.82%、95.59%、99.56%、104.37%、101.64%、99.86%、99.57%、102.62%和2.01%、1.96%、2.67%、2.46%、1.46%、2.29%、2.22%、2.33%、1.22%、1.78%、0.98%、2.24%、1.61%、1.17%、1.21%。

        2.3.7樣品含量測定結果精密稱取編號S1-S3的藏藥熏倒牛樣品各3份,每份0.2 g,加入各標準品溶液適量,按照“2.2.5”項下制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣,進樣體積10 μL,測定樣品中各氨基酸的平均含量。結果見表2。

        3討論

        對于氨基酸的分析,常采用柱前、柱上及柱后衍生化3種方式。采用柱前衍生化,利用HPLC進行測定,具有方法穩(wěn)定、普適性強等優(yōu)點。本研究選用柱前衍生化法,首先對樣品的水解方式進行優(yōu)化,結合文獻[11-12],選擇以6 moL·L-1鹽酸為水解試劑,設置不同時間(1、6、12、24 h)進行水解,以樣品中各氨基酸含量為標準,優(yōu)選最佳的水解方法,最終選擇以水解溫度110 ℃,水解6 h為樣品水解方法,本方法下,樣品中各氨基酸能夠充分水解,且無焦化現(xiàn)象。其次,通過預實驗,遴選了最佳衍生化試劑。常見的衍生化試劑主要有鄰苯二甲醛、PITC、二硝基氟苯、9-氯甲酸芴甲酯和丹磺酰氯等[13]。其中用PITC乙腈溶液進行衍生化處理具有產(chǎn)物單一、穩(wěn)定等特征[14-15],通過優(yōu)化實驗方法,最終選擇以0.1 moL·L-1的異硫氰酸苯酯(PITC)乙腈溶液及1 moL·L-1三乙胺乙腈溶液,時間為1 h進行衍生化處理。

        本研究結果提示,藏藥熏倒牛種子中含有豐富的人體必需氨基酸,約占樣品中氨基酸總量的37.4%~38.6%。同時谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、L-絲氨酸等氨基酸含量較高,3批熏倒牛樣品中,五種氨基酸的平均含量分別介于2.363~4.060 mg·g-1、1.403~1.982 mg·g-1、1.155~1.641 mg·g-1、0.830~1.314 mg·g-1、0.679~1.070 mg·g-1之間。

        本文通過建立柱前衍生化HPLC法同時測定藏藥熏倒牛種子中15種氨基酸的含量,具有操作簡單,準確度高等特點,能夠為藏藥熏倒牛種子的藥材質量評價、深入開發(fā)等提供基礎。

        參考文獻[1]

        中國科學院西北高原生物研究所.藏藥志[M].西寧:青海人民出版社,1991:263-264.

        [2]王維恩,張曉峰,沈建偉,等.藏藥熏倒?;瘜W成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2009, 21(2): 199-202.

        [3]吳海峰,張曉峰,鄧燁,等.藏藥薰倒牛的化學成分研究[J].中國中藥雜志, 2007, 32(20): 2141-2143.

        [4]張曉峰,周炳南. 藏藥薰倒牛的活性物質研究[J].藥學學報,1995,30(3): 211-214.

        [5] MENG J C, LU H, LI H, et al. A new antibacterial sesquiterpene glycoside and other bioactive compounds from Biebersteinia Heterostemon [J]. Spectroscopy Lett, 1999, 32(6): 1005-1012.

        [6]張亞梅,張普照,陳斌,等.熏倒??浦参锘瘜W成分與藥理作用研究進展[J].中藥材,2015,38(11):2435-2438.

        [7] 王淵龍,侯建平,郭依心,等.薰倒牛提取成分的抗氧化活性研究[J].食品工業(yè),2014(6):169-171.

        [8] 王維恩,趙維元.熏倒牛生物堿有效部位對鏈脲霉素致糖尿病小鼠血糖的影響[J].中成藥,2011,33(9):1584-1586.

        [9] 王發(fā)春,陳志,邱丹,等.藏藥熏倒牛籽油中脂肪酸成分分析[J]. 青海師范大學學報(自然科學版),2013(3):38-39.

        [10] HANNELORE K, KATJA D, WOLFRAM G, et al. Advances in amino acid analysis[J]. Anal and Bioanal Chem, 2009, 393(2): 445-452.

        [11]江東龍,陳芳,熊丹丹,等.柱前衍生化HPLC法同時測定龜甲膠中14種水解氨基酸含量[J].藥物分析雜志,2015,35(10):1790-1795.

        [12] LI H S,HUANG Z L,LI H L,et al.The hydrolyzed and processed method of the sample for amino acid analysis[J].Tianjin Pharm,1998,11(3):54.

        [13]赫欣睿,武中庸,葉永麗,等.高效液相色譜法測定氨基酸的研究進展[J].分析測試學報,2016,35(7):922-928.

        [14]HEINRIKSON R L,MEREDITH S C.Amino acid analysis by reverse-phase high-performance liquid chromatography:Precolumn derivatization with phenylisothiocyanate [J]. Anal Biochem,1984,136(1):65-74.

        [15]陽利龍,祝文君,何周康.柱前衍生反相高效液相色譜法測定人血清中游離氨基酸[J].兒科藥學雜志,2010(16):25-27.

        (收稿日期:2021-07-02編輯:陶希睿)

        基金項目:甘肅省藥品監(jiān)督管理局2020年度藥品科研項目(項目編號:2020GSMPA034);國家藥品標準物質協(xié)作研究與標定(項目編號:2020-W0204001)。

        作者簡介:李運(1985-),男,漢族,碩士,高級工程師,研究方向為中藥質量控制。E-mail:lyun04@163.com

        通信作者:景明(1963-),男,漢族,教授,研究方向為中藏藥產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail:jm@gszy.edu.cn

        男女爱爱好爽视频免费看| 日本三区在线观看视频| 午夜av内射一区二区三区红桃视| 免费女同毛片在线不卡| 一区二区三区在线少妇| 亚洲色偷偷综合亚洲avyp| 亚洲精品一品区二品区三品区| 欧美丰满大乳高跟鞋| 不卡a v无码在线| 国产精品夜色视频久久| 中文字幕精品一区久久| 私人毛片免费高清影视院| 中文字幕第1页中文字幕在| 国产蜜臀精品一区二区三区| 久久午夜av一区二区| 亚洲av无一区二区三区久久| 国产精品美女久久久久 | www插插插无码免费视频网站 | 精品亚洲一区二区三区四区五区| 亚洲av无码精品色午夜在线观看| 伊人色综合视频一区二区三区 | 国产精品久久久在线看| 男女猛烈无遮挡免费视频| 无遮挡边吃摸边吃奶边做| 亚洲 美腿 欧美 偷拍| 亚洲一区免费视频看看| 亚洲国产精品成人精品无码区在线 | 国产午夜精品理论片| av大片在线无码永久免费网址| 国内精品国产三级国产| 亚洲加勒比久久88色综合| 91精品福利一区二区| 国语憿情少妇无码av| 久久久免费精品国产色夜| 亚洲自偷自拍另类第1页| a级特黄的片子| 91视频免费国产成人| 精品自拍偷拍一区二区三区 | 蜜桃传媒免费观看视频| 国产免费无遮挡吸奶头视频| 一级免费毛片|