孫桂好 劉建民 孫友祿 陳正紅 鄭利敏

262100 安丘市人民醫(yī)院神經(jīng)外科1，山東 安丘

250000 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2，山東 濟(jì)南

257300 廣饒縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科3，山東 東營(yíng)

276499 臨沂市中心醫(yī)院心電圖室4，山東 臨沂

271000 泰安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科5，山東 泰安

癲癇持續(xù)狀態(tài)被氯化鋰-毛果蕓香堿誘發(fā)后會(huì)引發(fā)幾個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元的嚴(yán)重病變，其中最為顯著的為海馬區(qū)損傷[1]。本研究探討癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中海馬神經(jīng)元損傷情況和可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

購買山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的12 只健康雄性Wistar 大鼠，體重200～240 g，飼養(yǎng)溫度23～25℃，讓其自由飲食、進(jìn)水。

方法：①試劑與儀器：購買美國(guó)Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)的氯化鋰，瑞士Roche 公司生產(chǎn)的In Situ Cell Death Detection Kit(POD)原位凋亡檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，上海博生物試劑公司生產(chǎn)的蛋白酶抑制劑混合物，美國(guó)Santa Cruz 公司生產(chǎn)的Normal rabbit IgG+Protein A/G plus agarose。②動(dòng)物分組與大鼠模型制備：隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組對(duì)癲癇發(fā)作進(jìn)行誘導(dǎo)途徑為給予Wistar 大鼠腹腔注射氯化鋰127mg/kg，18～24h后給予其腹腔注射毛果蕓香堿30mg/kg，注射毛果蕓香堿前30 min給予大鼠腹腔注射硫酸安托品1 mg/kg，出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)后1～1.5 h給予大鼠腹腔注射地西泮10 mg/kg將抽搐解除。依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)癇性發(fā)作行為學(xué)，正常行為狀態(tài)評(píng)定為0級(jí)；面部肌肉在立須、眨眼、咀嚼等情況下抽搐，顫動(dòng)呈“濕狗樣”評(píng)定為1級(jí)；頸部肌肉抽搐，主要表現(xiàn)為點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)評(píng)定為2級(jí)；前肢抽搐、陣攣評(píng)定為3級(jí)；雙側(cè)前肢伸直伴身體立起評(píng)定為4級(jí)；跌倒并全身驚厥評(píng)定為5級(jí)[2]。復(fù)雜部分發(fā)作：1級(jí)+2級(jí)+3級(jí)；全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作：4級(jí)+5級(jí)，指成功誘發(fā)。對(duì)照組：給予Wistar大鼠腹腔注射等劑量氯化鋰+生理鹽水。③灌注取材：分批處死兩組大鼠，然后用水合氯醛100 mg/L對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后進(jìn)行心臟灌流、固定、脫水、透明、石蠟包埋，用石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，厚度為5 μm。對(duì)海馬CA1、CA3區(qū)形態(tài)學(xué)變化、凋亡情況進(jìn)行觀察，途徑為TUNEL染色、Nissl染色。

觀察指標(biāo)：①海馬形態(tài)學(xué)變化。②海馬神經(jīng)元凋亡情況。③不同時(shí)間點(diǎn)Glu R2蛋白表達(dá)。

研究方法：①觀察海馬形態(tài)學(xué)變化。石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，孵育10 min，位置為在37℃水浴箱中，然后分化到背景無色，在此過程中分別將乙醇950 mL/L、硫堇5 mL/L充分利用起來，常規(guī)脫水、透明、封片。將1個(gè)切片從每隔5張中取出來，共將3張取出來Nissl 染色。在顯微鏡(×400)下對(duì)CA1、CA3 區(qū)100 μm×100 μm 區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)[3]。②海馬神經(jīng)元凋亡情況。TUNEL 染色，應(yīng)用原位凋亡檢測(cè)試劑盒，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，將內(nèi)源性過氧化物酶浸洗去除，在此過程中將過氧化氫(H2O2)30 mL/L充分利用起來。室溫濕盒中對(duì)其進(jìn)行通透，在此過程中將蛋白酶K 充分利用起來。在37℃的溫度下對(duì)TUNEL 1 號(hào)、2 號(hào)混合液進(jìn)行反應(yīng)1 h，用PBS 代替1號(hào)液作為陰性對(duì)照組。PBS 清洗后將TUNEL 3 號(hào)液50 μL 加入，孵育30 min，位置為在37℃濕盒中。PBS清洗后將DAB加入顯色，復(fù)染過程中將蘇木精充分利用起來。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。將鄰近Nissl 染色的腦片利用起來，陽性細(xì)胞指有棕黃色顆粒出現(xiàn)在胞核中。光鏡下對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行分析，每組將陽性細(xì)胞最明顯的3 個(gè)×400 高倍視野從CA1、CA3區(qū)選取出來，將每個(gè)高倍視野下的陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)算出來[4]。③不同時(shí)間點(diǎn)Glu R2 蛋白表達(dá)。Western blot 測(cè)定，冰上以較快的速度將海馬取出來，用上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的RIPA 細(xì)胞組織快速裂解液將總蛋白提取出來，對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。每組用十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺對(duì)蛋白20 μg左右進(jìn)行凝膠電泳，向聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)入，TBST室溫下封閉脫脂奶粉(50 g/L)70 min，將北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的1∶500 小鼠β-action 抗體、美國(guó)Chemicon 公司生產(chǎn)的1∶800 兔Glu R2 抗體加入，室溫下孵育30 min，在4℃的溫度下過夜，室溫下孵育辣根過氧化物酶耦聯(lián)第二抗體70 min。采用美國(guó)LI-COR 公司生產(chǎn)的C-DiGit 化學(xué)發(fā)光掃描儀顯影，運(yùn)用電化學(xué)發(fā)光法對(duì)灰度值進(jìn)行測(cè)定。將內(nèi)參設(shè)定為β-action，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白/內(nèi)參蛋白灰度值[5]。④癲癇持續(xù)3 d 后Glu R2/GAPDH 耦合現(xiàn)象。免疫共沉淀、Western blot 技術(shù)檢測(cè)，冰上以較快的速度將海馬取出來，100∶1 混合蛋白酶抑制劑混合物和Western blot 及免疫沉淀細(xì)胞裂解液蛋白進(jìn)行裂解，對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定時(shí)運(yùn)用BCA 法。采用Normal rabbit IgG+Protein A/G plus agarose 將非特異結(jié)合蛋白去除。在Normal rabbit IgG、兔Glu R2 抗體中分別加入蛋白500～600 μg，在4℃的溫度下孵育過夜。在4℃的溫度下孵育Protein A/G plus agarose 1 h，離心30 s，速率為10 000 r/min，將上清棄去。將1×SDS 上樣緩沖液30 μL加入沉淀中，煮沸變性，進(jìn)行Western blot步驟，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中GAPDH 和Glu R2 灰度值，將GAPDH/Glu R2的耦合變化獲取過來[6]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用(±s)表示，比較采用F檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量的計(jì)量資料進(jìn)行方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

兩組大鼠的海馬形態(tài)學(xué)變化比較：實(shí)驗(yàn)組大鼠持續(xù)6 h、1 d、3 d、7 d的海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，持續(xù)6 h、1 d、3 d的海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)均逐漸減少(P＜0.05)，但持續(xù)6 h和7 d的海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠的海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)比較(±s，個(gè)/HP)

表1 兩組大鼠的海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)比較(±s，個(gè)/HP)

組別 n 持續(xù)時(shí)間 CA1區(qū) CA3區(qū)實(shí)驗(yàn)組 6 6 h 31.00±2.00 38.32±3.05 1 d 24.00±1.72 34.66±3.50 3 d 13.66±2.03 25.66±2.07 7 d 32.32±3.50 34.66±3.50對(duì)照組 6 44.32±5.12 52.32±4.50 F 4.541 4.303 P＜0.05 ＜0.05

兩組大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡情況比較：實(shí)驗(yàn)組大鼠持續(xù)6 h、1 d、3 d、7 d 的海馬CA1、CA3 區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)均多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，持續(xù)6 h、1 d、7 d、3 d 的海馬CA1、CA3 區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)均逐漸增多(P＜0.05)，但持續(xù)1 d 和7 d 的海馬CA1、CA3 區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠的海馬CA1、CA3區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)比較(±s，個(gè)/HP)

表2 兩組大鼠的海馬CA1、CA3區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)比較(±s，個(gè)/HP)

組別 n 持續(xù)時(shí)間 CA1區(qū) CA3區(qū)實(shí)驗(yàn)組 6 6 h 6.32±1.51 12.00±2.00 1 d 20.00±3.60 17.32±1.52 3 d 44.00±4.57 36.66±4.50 7 d 20.66±3.20 18.66±2.07對(duì)照組 6 2.00±0.06 5.66±1.52 F 6.965 3.365 P＜0.05 ＜0.05

兩組大鼠的海馬Glu R2 蛋白表達(dá)比較：實(shí)驗(yàn)組大鼠持續(xù)1 d、7 d 的海馬Glu R2蛋白表達(dá)均多于持續(xù)3 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，持續(xù)1 h、6 h的海馬Glu R2蛋白表達(dá)和對(duì)照組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，持續(xù)1 d、3 d、7 d的海馬Glu R2蛋白表達(dá)均少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)Glu R2 蛋白表達(dá)

兩組大鼠的癲癇持續(xù)3 d 后海馬Glu R2/GAPDH耦合現(xiàn)象比較：實(shí)驗(yàn)組大鼠持續(xù)3 d 的海馬Glu R2/GAPDH 蛋白復(fù)合物耦合程度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 大鼠海馬裂解液中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶

討 論

本研究結(jié)果和相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致[7-8]，說明癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型中的神經(jīng)元損傷為谷氨酸具有較多的釋放，通過Glu R2/GAPDH 耦合在AMPAR 上作用，進(jìn)而引發(fā)興奮性神經(jīng)毒性，可能和腦缺血模型中的神經(jīng)元變化類似。

綜上所述，癲癇持續(xù)狀態(tài)會(huì)損傷海馬神經(jīng)元，可能機(jī)制為Glu R2 表達(dá)下降、Glu R2/GAPDH 蛋白復(fù)合物耦合增加。