楊 波， 楊 濤， 楊東霞， 張歆萍， 孫海寧, 李佳欣

(1河北省承德市中心醫(yī)院， 河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學(xué)院病理教研室， 河北 承德 067000)

胃癌是我國(guó)常見消化道的惡性腫瘤之一，根據(jù)最新的癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，我國(guó)胃癌發(fā)病率及死亡率均排在第三名[1]，嚴(yán)重威脅人類的健康。盡管胃癌的治療逐漸系統(tǒng)化，但臨床中晚期胃癌患者依舊多見，治療難度大大增加，五年生存率不到35%[2]。胃癌發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)，正常的細(xì)胞凋亡對(duì)穩(wěn)定胃部?jī)?nèi)環(huán)境起到至關(guān)重要的作用，一旦癌細(xì)胞不受控制發(fā)生增殖或是凋亡受到抑制，就會(huì)逐步發(fā)展為胃癌，因此細(xì)胞凋亡成為探究胃癌發(fā)病機(jī)制中的研究熱點(diǎn)。NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其異常表達(dá)對(duì)腫瘤進(jìn)程、細(xì)胞凋亡發(fā)揮調(diào)控作用，Apaf-1作為抗凋亡因子，在胃癌中活化可抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)功能。但目前關(guān)于二者在胃癌中相關(guān)性研究少有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法技術(shù)檢測(cè)NF-κB、Apaf-1在胃癌組織中蛋白的表達(dá)變化，分析二者相關(guān)性。有助于闡釋說明胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，為胃癌的診斷及治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2020年1月到2021年1月承德市中心醫(yī)院、承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的50例胃癌患者手術(shù)切除后的組織標(biāo)本，所有患者經(jīng)臨床病理診斷確診為胃腺癌，手術(shù)前均未進(jìn)行放、化療治療。其中女性18例，男性患者32例；年齡35～74歲，年齡>60歲35例、≤60歲15例；高-中分化20例，低分化30例；有淋巴轉(zhuǎn)移者26例，無淋巴轉(zhuǎn)移者24例；Ⅰ+Ⅱ期27例，Ⅲ+Ⅳ期23例；<深肌層15例，≥深肌層35例。取這50例胃癌患者的癌旁正常組織標(biāo)本(距離胃癌組織邊緣>5cm)作為本次研究的對(duì)照。

1.2主要試劑:NF-κB兔抗人多克隆抗體(美國(guó)Affinity公司)、Apaf-1兔抗人多克隆抗體(美國(guó)Cell Signal公司)、免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.3免疫組化SP法

1.3.1染色方法:標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、包埋，4μm厚切片，根據(jù)免疫組化試劑盒說明書步驟進(jìn)行規(guī)范操作，NF-κB(濃度為1∶100)、Apaf-1(濃度為1∶50)，PBS做空白對(duì)照。

1.3.2判定標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)低倍及高倍光學(xué)顯微鏡觀察，NF-κB、Apaf-1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不同高倍視野(×400)，染色強(qiáng)度評(píng)分：無色陰性為0分,淡黃色弱陽(yáng)性為1分,中等黃色陽(yáng)性為2分,棕黃色或棕褐色強(qiáng)陽(yáng)性為3分；陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)所占比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，≥50%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分的乘積綜合判定陽(yáng)性結(jié)果：0～1分為陰性(-),2～3分為弱陽(yáng)性(+),4～6分為中等陽(yáng)性(++),>6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)[3]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)使用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較采用配對(duì)四格表卡方檢驗(yàn)；利用Spearman等級(jí)相關(guān)分析蛋白表達(dá)的相關(guān)性，以P<0.05為差異或相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NF-κB、Apaf-1蛋白在胃癌及癌旁正常組織中表達(dá)情況:胃癌組織中NF-κB、Apaf-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為84.0%(42/50)、36.0%(18/50)，癌旁正常組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別是34.0%(17/50)、70%(35/50)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2，表1。

圖1 NF-κB 蛋白的表達(dá)(SP法，×400)

表1 NF-κB Apaf-1蛋白在胃癌和癌旁正常組織中表達(dá)情況

2.2NF-κB、Apaf-1在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌臨床及病理參數(shù)的關(guān)系：NF-κB、Apaf-1的表達(dá)與患者的性別差異、年齡大小均不相關(guān) ( P>0.05)，與胃癌分化程度的高低、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM臨床分期情況、浸潤(rùn)深度的不同均有關(guān)( P<0.05)。見表2。

表2 NF-κB Apaf-1表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖2 Apaf-1 蛋白的表達(dá)(SP法，×400)

2.3NF-κB、Apaf-1在胃癌組織中表達(dá)相關(guān)性：通過spearman相關(guān)性分析，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，NF-κB、Apaf-1蛋白在胃癌組織中表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(rs=-0.36，P<0.05)。見表3。

表3 NF-κB Apaf-1在胃癌組織中表達(dá)相關(guān)性

3 討 論

胃癌是一種發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤，多數(shù)患者早期無不適癥狀和體征，十分容易漏診或誤診，因此胃癌的早期診斷就顯得尤為重要。惡性腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)是腫瘤細(xì)胞無限增殖和凋亡減少。NF-κB是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子[4]，通常與抑制物IKB激酶(IKB Kinase,IKB)相結(jié)合被禁錮在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)接受相關(guān)刺激信號(hào)后，IkB發(fā)生磷酸化，激活NF-κB進(jìn)入到細(xì)胞核中，尋找靶基因啟動(dòng)子位點(diǎn)發(fā)生特異結(jié)合，轉(zhuǎn)錄作用增強(qiáng)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[5]。有研究顯示在肺癌組織中高表達(dá)的NF-κB與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期均存在關(guān)聯(lián)[6]。在乳腺癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，抑制I-kBα降解，從而降低NF-κB活性，可明顯減少乳腺癌細(xì)胞的遷移能力[7]。Apaf-1廣泛存在于人體正常組織中，作為細(xì)胞凋亡的激活劑，促進(jìn)凋亡小體形成，介導(dǎo)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)Apaf-1乳腺腺癌、肺癌等腫瘤組織中處于低表達(dá)狀態(tài)[8]。

本研究顯示，NF-κB在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，Apaf-1在胃癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織，提示我們二者在胃癌中處于異常表達(dá)狀態(tài)，通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，二者與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤(rùn)深度均有關(guān)，表明NF-κB高表達(dá)、Apaf-1低表達(dá)可能對(duì)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮積極作用。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析顯示，NF-κB和Apaf-1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示兩者可能以負(fù)反饋形式促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，具體機(jī)制尚有待體外細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

綜上所述，NF-κB的高表達(dá)和Apaf-1的低表達(dá)共同促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展，聯(lián)合檢測(cè)NF-κB和Apaf-1在臨床上對(duì)胃癌的早期診斷和評(píng)估預(yù)后具有重要意義，同時(shí)本研究為胃癌治療新靶點(diǎn)的選擇提供了理論依據(jù)。