馬麗英， 白振忠， 馬春蘭

(1.青海衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系外科教研室， 青海 西寧 810099 2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心， 青海 西寧 810008 3.青海省婦女兒童醫(yī)院綜合科， 青海 西寧 810006)

胰腺癌是高度惡性腫瘤，在全球癌癥相關(guān)死亡中排名第四[1]。近年來，由于缺乏早期疾病特異癥狀，大多數(shù)胰腺癌患者確診較晚，僅有20%的患者可通過手術(shù)切除，且預(yù)后較差[2]。其發(fā)病率和死亡率在全球呈上升趨勢，5年生存率較低。為有效地診斷、預(yù)防和治療胰腺癌，需進(jìn)一步研究胰腺癌的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，天然藥物提取物具有抗腫瘤作用。大黃素是一種天然蒽醌衍生物，具有抗菌、防止免疫抑制和抗癌等作用[3]。大黃素可抑制胰腺癌血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖[4]，發(fā)揮抗胰腺癌作用，但其作用機(jī)制尚未闡明。miR-1301是一種微小RNA(miRNA)，在骨肉瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)下調(diào)與患者惡性臨床癥狀和總生存率低顯著相關(guān)，miR-1301通過靶向BCL9減弱骨肉瘤細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移。但miR-1301在胰腺癌中的作用以及大黃素是否通過調(diào)控miR-1301表達(dá)發(fā)揮抗癌作用仍需進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1材料:人胰腺正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE6和胰腺癌細(xì)胞Panc-1、SW1990獲自美國種質(zhì)保藏中心；大黃素和MTT試劑盒購自美國Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；qRT-PCR、反轉(zhuǎn)錄、Trizol試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Transwell小室購于美國密理博公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；miR-NC、miR-1301、anti-miR-NC、anti-miR-1301購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21一抗以及山羊抗兔IgG二抗購于上海艾博抗公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組:取對數(shù)生長期SW1990細(xì)胞接種于6孔板(3×104個(gè)/孔)，用含不同濃度大黃素(10、20、40μmoL/L)的培養(yǎng)液孵育72h，分別記作低劑量大黃素組(10μmoL/L)、中劑量大黃素組(20μmoL/L)、高劑量大黃素組(40μmoL/L)。將miR-NC、miR-1301分別轉(zhuǎn)染至SW1990細(xì)胞中，記為miR-NC組、miR-1301組；將anti-miR-NC、anti-miR-1301分別轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞中，40μmoL/L大黃素培養(yǎng)液孵育72h，記為高劑量大黃素+anti-miR-NC組、高劑量大黃素+anti-miR-1301組。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR):提取SW1990細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6為內(nèi)參，以2-△△Ct法計(jì)算miR-1301的相對表達(dá)量，檢測各組miR-1301水平以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。上海生工生物工程公司合成的miR-1301上游引物序列：5'-ACACTCCAGCTGGGTTGCAGCTGCCTGGGAGTGA-3'，下游引物序列：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。

1.4MTT檢測細(xì)胞活力:將100μL 2.5×104個(gè)/mL的SW1990細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)48h后，加入20μL/孔MTT溶液，持續(xù)4h，以DMSO震蕩孵育5min使沉淀溶解，酶標(biāo)儀檢測450nm處的OD值。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移與侵襲:遷移：SW1990細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于Transwell小室上室，加600μL培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)于下室，在37℃下孵育24h后，用棉簽擦去未穿膜細(xì)胞。多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染液染色，以顯微鏡下觀測3個(gè)代表性視野進(jìn)行遷移計(jì)數(shù)；侵襲：用培養(yǎng)液以1∶8比例稀釋Matrigel后，鋪于Transwell小室上室，其余步驟同上。

1.6Western blot法檢測蛋白表達(dá):獲得SW1990細(xì)胞總蛋白，二辛可寧酸法測量其濃度。取60μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)PVDF膜，膜封閉后分別在4℃加入CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9和GAPDH(內(nèi)參)一抗，持續(xù)12h。山羊抗兔二抗室溫孵育2h，化學(xué)發(fā)光液顯影，上述蛋白條帶灰度值的分析通過ImageJ軟件進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1miR-1301在胰腺癌SW1990細(xì)胞中的表達(dá):HPDE6、SW1990、Panc-1細(xì)胞中miR-1301表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HPDE6細(xì)胞比較，胰腺癌SW1990、Panc-1細(xì)胞中miR-1301表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 miR-1301在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2大黃素對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響:對照組、低、中、高劑量大黃素組四組SW1990細(xì)胞活力、遷移、侵襲數(shù)目、蛋白(CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，中、高劑量大黃素組SW1990細(xì)胞活力、遷移、侵襲數(shù)目及CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平降低，p21水平升高(P<0.05)，而低劑量大黃素組各檢測指標(biāo)均無顯著變化(P>0.05)。見圖1、表2、表3。

表2 大黃素對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖遷移和侵襲的影響

圖1 大黃素對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

表3 大黃素對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖遷移和侵襲相關(guān)蛋白的影響

2.3大黃素對胰腺癌SW1990細(xì)胞中miR-1301表達(dá)的影響:對照組、低、中、高劑量大黃素組四組SW1990細(xì)胞中miR-1301表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，中、高劑量大黃素組miR-327表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而低劑量大黃素組miR-327表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)。見表4。

表4 大黃素對胰腺癌SW1990細(xì)胞中miR-1301表達(dá)的影響

2.4過表達(dá)miR-1301對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響:miR-1301組miR-1301表達(dá)水平顯著高于miR-NC組(P<0.05)，表示miR-1301轉(zhuǎn)染成功；與miR-NC組比較，miR-1301組SW1990細(xì)胞活力、遷移、侵襲數(shù)目以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平降低，并提高p21水平(P<0.05)。見圖2、表5、表6。

圖2 過表達(dá)miR-1301對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

表5 過表達(dá)miR-1301表達(dá)對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖遷移和侵襲的影響

表6 過表達(dá)miR-1301表達(dá)對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖遷移和侵襲的影響

2.5下調(diào)miR-1301逆轉(zhuǎn)了大黃素對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響:高劑量大黃素+anti-miR-1301組miR-1301表達(dá)水平顯著低于高劑量大黃素+anti-miR-NC組(P<0.05)，表示anti-miR-1301轉(zhuǎn)染成功；與高劑量大黃素+anti-miR-NC組比較，高劑量大黃素+anti-miR-1301組SW1990細(xì)胞的活力、遷移、侵襲數(shù)目以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平升高，p21水平降低(P<0.05)。見圖3、表7、表8。

表7 下調(diào)miR-1301逆轉(zhuǎn)了大黃素對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖遷移和侵襲的影響

表8 下調(diào)miR-1301逆轉(zhuǎn)了大黃素對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖遷移和侵襲相關(guān)蛋白的影響

圖3 下調(diào)miR-1301逆轉(zhuǎn)了大黃素對胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

胰腺癌治療缺乏有效的藥物，尋找治療胰腺癌的藥物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題。中藥或其活性成分具有作用靶點(diǎn)多、副作用小、療效強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為抗腫瘤藥物研究的重點(diǎn)對象。作為中藥大黃的主要活性成分，大黃素對多種腫瘤具有抑制作用。研究顯示，大黃素可抑制乳腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干細(xì)胞形成，是阻止乳腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的一種新且有效的藥物[5]；大黃素可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，阻礙胃癌發(fā)展進(jìn)程[6]；大黃素可通過抑制黑色素瘤細(xì)胞遷移和侵襲阻礙黑色素瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[7]；大黃素可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗宮頸癌作用[8]。結(jié)果顯示大黃素可抑制胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)其可調(diào)控細(xì)胞中CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，這也可能是其發(fā)揮抗胰腺癌作用的原因之一。

miRNA是真核生物中廣泛存在的小分子非編碼RNA，其可靶向靶基因的表達(dá)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性行為，可作為腫瘤治療的分子靶點(diǎn)。作為一種miRNA，miR-1301是結(jié)腸癌、食管癌、胃癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)的miRNA，上調(diào)miR-1301抑制這些腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲或遷移性，miR-1301發(fā)揮抗腫瘤作用[9,10]。這些研究結(jié)果與本研究中胰腺癌細(xì)胞中miR-1301表達(dá)降低，過表達(dá)miR-1301顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的結(jié)果一致，說明miR-1301也發(fā)揮抑癌基因作用阻礙胰腺癌的發(fā)展進(jìn)程，提示miR-1301也可作為胰腺癌治療的分子靶點(diǎn)。既往研究顯示，大黃素可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。例如，大黃素可通過促進(jìn)miR-34a抑制肝癌發(fā)生[11]，可通過促進(jìn)miR-199a表達(dá)降低卵巢癌細(xì)胞的增殖和集落形成能力，還可通過上調(diào)miR-1271抑制胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲[12]。本研究結(jié)果顯示，大黃素可上調(diào)胰腺癌細(xì)胞中miR-1301表達(dá)，而下調(diào)miR-1301逆轉(zhuǎn)了大黃素對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，這提示大黃素可能通過上調(diào)miR-1301發(fā)揮抗胰腺癌作用。

總之，大黃素可能通過上調(diào)胰腺癌SW1990細(xì)胞中miR-1301的表達(dá)，發(fā)揮抗增殖、抗遷移和抗侵襲作用，這豐富了中藥化合物與miRNA之間的調(diào)控關(guān)系，為大黃素用于胰腺癌治療提供了新思路。