周 珂，劉乃新，于清濤,2

(1.黑龍江大學現(xiàn)代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080； 2.哈爾濱市農業(yè)科學院，哈爾濱 150000)

1 引言

植物的發(fā)育是一個非常復雜的過程。在這個過程中，DNA和蛋白質起著重要的作用。通過它們之間的相互作用，實現(xiàn)對基因表達的調控。眾所周知，基因表達的調控主要發(fā)生在轉錄水平上，而在轉錄水平上與DNA相互作用的蛋白質分子中最多樣化的是轉錄因子(TF)。轉錄因子通過激活許多與植物生長和發(fā)育有關的功能基因而發(fā)揮重要作用。通過與DNA結合或調節(jié)DNA結構，TF可以調節(jié)與逆境脅迫有關的基因的表達，從而控制植物的生物過程[1]。

NAC基因家族主要存在于植物中，它的名字來自于三個基因的縮寫(矮牽牛的NAM，擬南芥的ATAF和CUC2)。無根尖分生組織(NAM)是在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)的第一個特征化的NAC蛋白[2]，而擬南芥轉錄激活因子(ATAF)和杯狀子葉(CUC)是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的。NAC蛋白在N端有一個高度保守的NAC結構域[3]。NAC結構域由幾個螺旋體組成，環(huán)繞著一個反向平行的B-折疊，它可以結合DNA和其他蛋白[4]，轉錄因子的C端是轉錄激活功能區(qū)，其序列和功能具有多樣性[5]。

目前，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)110多個NAC成員，在水稻中發(fā)現(xiàn)140多個NAC成員。以前的研究表明，NAC基因家族參與了植物發(fā)育和形態(tài)發(fā)生的各種過程，包括芽尖分生組織的形成[6]胚胎發(fā)育[7]花器官的形態(tài)發(fā)生[8]，側根的形成[9]葉衰老[10]和脅迫條件下的花器官誘導。NAC基因家族的成員還參與了細胞周期控制、激素信號轉導等。[11]激素信號轉導[12]和谷物營養(yǎng)物質的轉運[13]。

此外，NAC基因家族還與植物抗性有關，如干旱[14]，高鹽[15]、低溫[16]、機械損傷[17]和病毒感染[18]。

甜菜(Betavulgaris)是一種兩年生草本植物，原產于歐洲西部和南部沿海地區(qū)，是甘蔗以外的主要糖源。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織(FAO)的數(shù)據(jù)，全世界每年有30%的糖產量來自甜菜，它也是生物乙醇的重要來源。[19]天然色素[20]蔬菜[21]和動物飼料的重要來源。[22]近年來，越來越多的瑞士甜菜[23]栽培品種(紅莖葉甜菜、紅葉甜菜)作為觀賞植物被廣泛用于景觀配置。

甜菜在生長發(fā)育過程中，容易受到各種生物和非生物脅迫的影響，嚴重影響甜菜的產量和觀賞價值。本研究以甜菜全基因組為基礎，鑒定了NAC家族的成員，并分析了其基因結構、染色體定位、亞細胞定位、蛋白質保守結構域和系統(tǒng)發(fā)育關系，為分析NAC轉錄因子的功能和構建抗逆調控網(wǎng)絡奠定了基礎。

2 材料和方法

2.1 甜菜 NAC 轉錄因子的挖掘與篩選

甜菜基因組和注釋文件數(shù)據(jù)下載自NCBI(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=beta+vulgaris)。NAC基因家族保守結構包含有PF01849、PF02365(數(shù)據(jù)來自Pfam數(shù)據(jù)庫)，利用 HMMER3.0 軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)搜索甜菜蛋白序列，鑒定甜菜的PF01849、PF02365的 NAC 候選基因。候選基因再利用保守結構域預測網(wǎng)站Pfam (http://pfam.xfam.org/)和CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)進行檢測，保留完整的結構域的作為NAC基因。利用 ProtParam (http://web.expasy.org/protp-aram/)分析NAC基因的氨基酸長度、分子質量、理論等電點進行分析。

2.2 甜菜 NAC 轉錄因子的進化分析

引入擬南芥 NAC 基因家族對甜菜NAC基因進行亞組分類，擬南芥 NAC 蛋白序列下載于arabidopsis網(wǎng)站 (http://www.arabidopsis.org/)。將篩選得到的甜菜 NAC 蛋白序列進行進化樹分析，利用 Clustalx2.0 軟件進行多序列比對，再通過進化樹分析軟件 MEGA5.2根據(jù)NJ方法構建系統(tǒng)進化樹(參數(shù)設置: P-distance, pairwise deletion, bootstrap (1 000 次重復))

2.3 甜菜 NAC 轉錄因子保守結構域分析

使用MEME程序(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)對甜菜的motif進行識別。主要參數(shù)Motif的最大數(shù)量是15。

2.4 甜菜 NAC 轉錄因子內含子、外顯子及染色體定位分析

甜菜 NAC 基因的內含子、外顯子和基因組定位信息均下載于NCBI數(shù)據(jù)庫甜菜注釋文件。利用在線軟件 GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 對 NAC 的內含子和外顯子結構進行分析和整理；利用R包chromPlot對NAC基因進行染色體定位。利用軟件MCscanX對 NAC 基因進行片段復制和串聯(lián)復制分析。

2.5 甜菜NAC轉錄因子的表達分析

從NCBI下載甜菜逆境的轉錄組數(shù)據(jù)， ID PRJNA254489。使用軟件solexQA 對下載的數(shù)據(jù)進行質量控制，使用軟件Tophat2進行比對并使用Cufflink計算表達量, 使用R包pheatmap進行候選基因的可視化。

2.6 甜菜 NAC 轉錄因子miR164 靶序列的定位

前人研究報道，NAC基因可能受miR164調控。根據(jù) miR164 靶序列(TGCACGTGCCCTGCTTCTCCA) ，在篩選得到的 52 個候選甜菜 NAC 轉錄因子相應的核苷酸序列中使用 BLAST在線聯(lián)配工具，預測潛在的miR164的靶標。

3 結果

3.1 甜菜 NAC 轉錄因子序列的鑒定

通過 NCBI數(shù)據(jù)庫下載甜菜基因組及蛋白序列，根據(jù) NAC 保守域序列號 PF01849、PF02365(Pfam數(shù)據(jù)庫)，利用 HMMER3.0 軟件檢索甜菜的氨基酸序列。再利用保守結構域預測網(wǎng)站 Pfam和 CDD對候選序列進行篩選鑒定。通過以上篩選獲得 87個NAC候選基因，5個含有NAC結構域，82個為NAM結構域。去除掉可變剪切和位于scaffold上的NAC基因，一共獲得52個甜菜NAC基因。利用 ExPASy 提供的在線軟件 ProtParam (http://web.expasy.org/protp-aram/)對候選成員氨基酸序列進行一級結構預測結果見表1。

表1 β硫化物中NAC基因的數(shù)量和特性

續(xù)表1

3.2 甜菜 NAC 轉錄因子的進化樹分析

引入已知類型的擬南芥 NAC 蛋白序列，構建 BvNAC的進化樹。通過已知擬南芥 NAC 蛋白的類型指導 BvNAC 蛋白的分組。進化樹結果顯示，BvNAC 蛋白序列可分為 18 個亞族(圖 2)。各亞族成員數(shù)量分布差異很大，其中Ⅻ亞族的Bv NAC 轉錄因子成員最多為 28 個，而Ⅸ和Ⅹ亞族成員均只有一個。其中的Ⅻ亞族與擬南芥并沒有相聚成簇。

圖1 Beta vulgaris和擬南芥的NAC基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 甜菜 NAC 轉錄因子保守結構域分析

利用在線MEME軟件對甜菜 NAC 的 NAC 結構域進行分析，結果發(fā)現(xiàn)甜菜 NAC 轉錄因子的 NAC 保守結構域是高度保守的(圖2)。NAC 保守結構域中包含 15個亞結構域，其中 A、C、D 亞結構域保守性高，B 和 E 保守性低。由于亞族Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ的成員較少無法使用 Web Logo 軟件構建該組的全序列標簽，所以沒有列出。甜菜 NAC 轉錄因子Ⅰ、Ⅴ、Ⅺ亞族成員的保守性最高，而Ⅻ亞族成員保守性最低(圖2)。

圖2 甜菜NAC 轉錄因子motif結構分布

3.4 甜菜 NAC 轉錄因子內含子及外顯子分析

甜菜 NAC 基因的內含子、外顯子和基因組定位信息均下載于 NCBI數(shù)據(jù)庫。利用在線軟件 GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對 NAC 的內含子和外顯子結構進行分析和整理(圖3)。甜菜 NAC 轉錄因子家族成員主要由 1～7 個外顯子組成，其中Ⅻ亞族大多數(shù)成員只含有一個外顯子，這可能與其是甜菜特有的一類 NAC 轉錄因子有關。

圖3 甜菜 NAC 轉錄因子家族染色體定位和數(shù)量分布

3.5 甜菜 NAC 轉錄因子染色體定位分析

利用R包chromPlot制作 NAC 的染色體定位分布圖，并對 NAC 基因進行片段復制和串聯(lián)復制分析。本實驗篩選出的 52 個甜菜 NAC 基因不均勻的分布于 9 條染色體上，6 號染色體上分布最多，為11 個；其次是 1 號染色體，為 10 個；7 號染色體分布最少，只有 1 個(圖5B)。同時，對甜菜 NAC 轉錄因子基因進行片段復制和串聯(lián)復制檢測。多個甜菜 NAC 轉錄因子基因處于甜菜基因組復制事件區(qū)域，其中沒有基因經(jīng)歷了片段復制， 6個基因經(jīng)歷了串聯(lián)復制，占基因總數(shù)的 11.5%(圖5A)?？梢?，甜菜 NAC 基因家族以串聯(lián)復制0為主要擴增方式。

3.6 甜菜 NAC 轉錄因子 mi R164 靶序列定位

根據(jù) miR164靶序列(TGCACGTGCCCTGCTTCTCCA)與篩選得到的 52 個候選甜菜 NAC 轉錄因子相應的核苷酸序列，利用 BLAST工具對 miR164 靶序列的定位分析，選取e-value小于 0.009的序列。結果表明，在 52 個甜菜 NAC 轉錄因子中有1 個 NAC 轉錄因子成員(BvNAC30)的核苷酸序列具有 miR164 靶序列識別位點。

4 結論

本研究通過生物信息學方法篩選出了52條甜菜NAC轉錄因子，并對其構建了進化樹、 分析了蛋白質保守結構域、染色體上進行了定位和 mi R164 靶序列定位，這些研究結果將為以后 利用基因工程技術創(chuàng)制甜菜新種質提供優(yōu)異基因資源做準備。