朱旭超,竇長松,張 鈺,秦 川,張 玲

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類動物模型三級實驗室,北京 100021)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直等運動功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病,主要病理機制是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性丟失、紋狀體多巴胺水平顯著降低,以殘存神經(jīng)元胞體中出現(xiàn)的LBs 為特征性標志物,目前無有效治療手段。如何清除形成LBs 的錯誤折疊α-syn 是PD 的重要研究方向[1]。分子伴侶介導的細胞自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA) 是降解α-syn 的重要途徑[2]。LAMP2A 是CMA 的限速步驟,在PD 病人黑質(zhì)致密部和杏仁核中的表達水平降低導致CMA 水平下降[3-4]。α-syn 因清除能力不足而出現(xiàn)異常聚積和錯誤折疊,形成具有神經(jīng)毒性作用的α-syn 寡聚體[5],導致多巴胺能神經(jīng)元變性壞死。PD 大鼠模型中已經(jīng)證實過表達LAMP2A 可以改善α-syn 病理和運動能力[6]。為進一步探究LAMP2A 上調(diào)對PD是否有潛在的治療價值,本研究利用恒河猴構(gòu)建PD模型[7],給予腺相關病毒載體過表達LAMP2A[8-9]。通過行為學方法對接受LAMP2A 過表達干預的PD恒河猴模型進行精細運動能力檢測,為進一步研究PD 的發(fā)病機制和治療提供了參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級4～5 歲雄性恒河猴7 只,體重(5.28±0.6)kg,均購自于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所北方中心[SCXK(京)2021-0004],并飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所北方中心[SYXK(京)2017-0027]。普通環(huán)境條件為12 h/12 h 晝夜周期,溫度(23±2)℃,濕度45%～60%。每天飼喂特制猴飼料3 次,中間1 次給予適量水果。在本研究中所涉及的動物實驗均經(jīng)過中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所動物實驗倫理委員會審核批準(IACUC-QC19025),并遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

人α 突觸核蛋白ELISA 試劑盒(生工,D71156-0096)；Human p-α-SYN ELISA Kit (茁 彩,ZC-54871)。主要的手術裝置有大動物腦立體定位注射儀(瑞沃德,中國)；高周波X 射線機(Mikasa,日本)；山和谷階梯實驗裝置、平板取食實驗裝置自制。

1.3 實驗方法

1.3.1 帕金森病恒河猴模型的制備與分組

利用大動物立體定位注射儀并參考Yu 等[10]的方法。以前連合為三維坐標系原點,紋狀體坐標為:前后值(antero-posterior,AP)=-4 mm,距中縫值(media-lateral,ML)=± 14 mm,平面值(dorsoventral,DV)=-3 mm；黑質(zhì)區(qū)坐標為AP=-7 mm,ML=±3 mm,DV=-4 mm[7,11]。向所有7 只恒河猴的右腦紋狀體區(qū)注射帕金森病患者死后腦組織的LBs 提取物(100 μL,3 μL/min),而在左腦紋狀體注射非帕金森病人死后的腦組織提取物(100 μL,3 μL/min),以此作為自身對照來構(gòu)建帕金森病模型(圖1A)。LAMP2A 過表達組在其黑質(zhì)區(qū)雙側(cè)注射了過表達LAMP2A 的腺相關病毒載體(10 μL 每側(cè),1 μL/min)；對照組在其雙側(cè)黑質(zhì)區(qū)注射對照病毒載體(10 μL 每側(cè),3 μL/min)(圖1B)。人腦組織樣本來自荷蘭腦庫,腦組織提取物和病毒載體均來自法國波爾多大學Erwan Bezard 教授實驗室[7]。

圖1 本研究中實驗猴造模及分組示意圖Note.A,Construction of rhesus monkey models of Parkinson’s disease.B,Target brain area and injection in control group and LAMP2A overexpression group.Figure 1 Experimental monkey modeling and grouping schematic diagram in this study

1.3.2 階梯實驗

術后第14 月,在實驗人員能夠通過食物引誘與實驗猴進行互動時,對動物進行行為學測試,將1 cm3蘋果塊作為食物獎勵,每次正式實驗開始前對實驗猴禁食1 餐。

分為山階梯實驗和谷階梯實驗,根據(jù)先前的研究[12-13]設計制作而來(圖2A、2D)。在動物適應階段(正式實驗前1 周,每天1 次)訓練動物穿過擋板從階梯模具上獲得食物獎勵,隨后開始正式實驗。實驗前在每層的階梯模具上放置食物,攝像機記錄動物伸手穿越孔洞、取到食物后縮回孔洞的時間,連續(xù)測試10 d。對動物每側(cè)肢體每次抓取食物的時間進行統(tǒng)計分析,用錯誤上肢取食的時間將不被記錄。裝置中透明擋板的孔道直徑為8 cm；階梯模具每個階梯長8 cm,寬3 cm,高4 cm；山階梯中兩模具距離2 cm,谷階梯中兩模具距離12.5 cm,模具距擋板前方10 cm。

1.3.3 平板取食實驗

分為兩端平板取食和中央平板取食實驗,依據(jù)文獻[14]由亞克力板制作改進而來(圖3A、3D)。學習適應階段和正式實驗階段類似于階梯實驗。使用兩個2×4 排列的圓形孔槽亞克力板供實驗猴取食,實驗時長和統(tǒng)計指標同階梯實驗。每個平板模具長20 cm,寬10 cm,厚2 cm,上有8 個直徑3 cm,深0.5 cm 的孔槽,相鄰兩孔槽之間的距離為2 cm；中央平板取食實驗中兩模具并齊,兩端平板取食實驗中兩模具距離15 cm,模具距擋板前方10 cm。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附測定

在手術前和手術后的第4、8、12 月,分別采集動物血清和腦脊液。以10 mg/kg 劑量的鹽酸氯胺酮肌肉注射麻醉動物后[15],局部去毛暴露下肢皮下靜脈,酒精棉球消毒,使用5 mL 含肝素鈉采血管取血。血液在采血管內(nèi)室溫靜置30 min 后隨即以3000 r/min 的轉(zhuǎn)速4℃離心15 min,取上清。恒河猴麻醉后取立位坐姿,利用腰穿穿刺針在L5 與L6 椎間隙穿刺。有落空感時停止,旋轉(zhuǎn)針頭,引出腦脊液,從第2 滴開始收集,每只動物每次取1～1.5 mL[16]。按照試劑盒內(nèi)提供的操作手冊分別對猴血清和猴腦脊液進行總α-syn 水平和磷酸化α-syn 水平的測定并進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析和繪圖,以平均數(shù)±標準差()表示,多組間比較采用雙因素方差分析,兩兩比較應用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LAMP2A 過表達改善PD 恒河猴模型垂直方向精細運動能力

本實驗中帕金森病恒河猴模型采取右側(cè)紋狀體區(qū)LBs 注射的方式,因此研究中重點檢測術后第12 月實驗猴注射腦區(qū)對側(cè)[17],即左側(cè)上肢抓取食物的精細運動能力。將對照組和LAMP2A 過表達組的左右上肢取食時間分別統(tǒng)計分析,為了消除個體差異,研究中采用該動物左手取食時間和其右手取食時間的比值作為衡量指標。由于山階梯實驗(圖2A)中一側(cè)上肢抓取同側(cè)目標的運動路徑較短,因此山階梯測試中沒有顯示出兩組比值上的差異(圖2B)。為進一步探究LAMP2A 對過表達組動物抓取運動的影響,研究發(fā)現(xiàn)在山階梯中LAMP2A過表達組動物的兩側(cè)肢體運動沒有明顯的變化(圖2C)；但谷階梯(圖2D)中對照組恒河猴的差異表明對照組動物自身左手取食時間高于右手,P＜0.01(圖2E),同時說明對照組左手精細運動的差異是由注射物LBs 引起而非注射本身的機械損傷。在相對困難的谷階梯實驗中也明顯提高了LAMP2A過表達組實驗猴左手抓取的成績,抓取時間縮短P＜0.05(圖2F),左手的取食效率提升。階梯實驗提示術后第12 月的PD 恒河猴模型,肉眼沒有觀察到明顯的肢體運動障礙,但精細運動能力下降；同時黑質(zhì)區(qū)LAMP2A 的過表達可以改善其精細運動表現(xiàn)。

圖2 階梯實驗裝置及結(jié)果()Note.A,Hill staircase task equipment.B,Ratio of time spent on the left hand to the right hand in hill staircase task.C,Time to get food from left and right hands in hill staircase task.D,Valley staircase task equipment.E,Ratio of time spent on the left hand to the right hand in valley staircase task.F,Time to get food from left and right hands in valley staircase task.Compared to the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 2 Staircase task equipment and results

2.2 LAMP2A 過表達改善PD 恒河猴模型水平方向精細運動能力

和階梯實驗類似,平板取食實驗旨在測試實驗猴水平方向上的精細運動能力。中央平板取食實驗(圖3A)因其運動路徑短,相對簡單,兩組動物上肢抓取時間的比值沒有出現(xiàn)明顯變化(圖3B),LAMP2A 過表達組上肢抓取時間的縮短也并不明顯(圖3C)；在相對困難的兩端平板取食實驗(圖3D)中,對照組動物上肢抓取時間的比值出現(xiàn)差異,P＜0.05(圖3E),LAMP2A 過表達組動物左手抓取的效率明顯提高,抓取時間下降,P＜0.05(圖3F)。

圖3 平板取食實驗裝置及結(jié)果()Note.A,Middle plate pick up test equipment.B,Ratio of time spent on the left hand to the right hand in middle plate pick up test.C,Time to get food from left and right hands in middle plate pick up test.D,Outside plate pick up test equipment.E,Ratio of time spent on the left hand to the right hand in outside plate pick up test.F,Time to get food from left and right hands in outside plate pick up test.Compared to the control group,*P＜0.05.Figure 3 Pick-up test equipment and results

2.3 LAMP2A 過表達組PD 恒河猴模型磷酸化αsyn 水平降低

為了探究LAMP2A 改善實驗猴精細運動能力的機制,我們對對照組和過表達組的猴血清、腦脊液的總α-syn 以及磷酸化α-syn 水平進行檢測。結(jié)果表明,對照組恒河猴腦脊液的總α-syn 水平在術后第12 月顯著增高(P＜0.001)(圖4A)；LAMP2A過表達組恒河猴腦脊液總α-syn 水平在各時間點相對平穩(wěn),但術后第4 月的血清總α-syn 濃度與術前相比出現(xiàn)上升(P＜0.05),而后隨時間趨于平穩(wěn),在術后第12 月低于同期對照組(圖4B)；LAMP2A 過表達組腦脊液磷酸化α-syn 濃度在術后第4 月顯著增加(P＜0.001),而在術后第8 月出現(xiàn)下降并于第12 月恢復至術前水平,表明LAMP2A 在第8 月作用凸顯(圖4C)；對照組恒河猴血清磷酸化α-syn 水平在術后第4 月開始,也均高于同期的過表達組(圖4D)。ELISA 結(jié)果說明LAMP2A 降低了過表達組恒河猴血清、腦脊液的總α-syn 和磷酸化α-syn 水平,同時生物學證據(jù)也支撐了LAMP2A 過表達組恒河猴的較好的行為學表現(xiàn),提示LAMP2A 在帕金森病病理進程中潛在的治療作用。

圖4 實驗猴腦脊液和血清總α-syn 水平和磷酸化α-syn 水平比較()Note.A,Total α-syn level of experimental monkey cerebrospinal fluid.B,Total α-syn level of experimental monkey serum.C,Phosphorylated α-syn level of experimental monkey cerebrospinal fluid.D,Phosphorylated α-syn level of experimental monkey serum.Compared with the control group in the same period,*P＜0.05,***P＜0.01.Compared to the control group at 0 months,##P＜0.01,###P＜0.001.Compared to the LAMP2A overexpression group at 0 months,%P＜0.05,%%%P＜0.001.Figure 4 Comparison of total α-syn levels and phosphorylated α-syn levels in the cerebrospinal fluid and serum of experimental monkeys

3 討論

本研究行為學實驗表明,過表達LAMP2A 可以改善PD 恒河猴模型的精細運動能力,避免潛在的肢體運動障礙。我們在研究中并沒有加入野生型恒河猴和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導的PD 恒河猴模型進行比較分析。但Recasens等[7]在研究中證實單側(cè)紋狀體注射LBs 構(gòu)建的PD恒河猴模型具備α-syn 病理和黑質(zhì)紋狀體變性表現(xiàn),術后第9 月開始出現(xiàn)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元減少,并發(fā)現(xiàn)同側(cè)顳葉皮層的中央前回、額葉上回和內(nèi)嗅皮層的α-syn 免疫組化信號增加。這可能是由于紋狀體在解剖上的高度聯(lián)接性導致LBs 在同側(cè)腦區(qū)的擴散,在PD 恒河猴模型和PD 小鼠模型中尚未有LBs 單側(cè)注射向?qū)?cè)擴散的報告。因此,本研究中對照組實驗猴左手抓取效率的下降是由于其右側(cè)紋狀體LBs 的注射引起。

Shimozawa 等[18]將人工合成的α-syn 原纖維注射入野生型狨猴紋狀體3 月后便能夠檢測到磷酸化α-syn 免疫反應陽性,但沒有觀察到明顯的行為障礙。本研究也未發(fā)現(xiàn)恒河猴明顯的肢體運動障礙,這與先前的研究一致。人類黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量減少50%以上、紋狀體多巴胺含量降低80%以上才會出現(xiàn)明顯的PD 運動障礙癥狀[19]。本研究中術后第14 月出現(xiàn)精細運動能力下降的實驗猴在病理階段可能已經(jīng)達到多巴胺能神經(jīng)元損傷并出現(xiàn)行為異常的閾值[20]。不同于MPTP 注射誘導的急性PD 恒河猴模型,早期即出現(xiàn)明顯肢體運動障礙[21],本文中PD 恒河猴模型模擬慢性病理進程[22],早期肢體運動障礙不明顯,故對照組實驗猴肢體精細運動能力的下降是α-syn 病理進程的反映。

LAMP2A 是CMA 的限速步驟,前期的PD 大鼠模型中已經(jīng)證實,LAMP2A 可以顯著提高CMA 活性,減少了黑質(zhì)區(qū)酪氨酸酶陽性神經(jīng)元的丟失,總α-syn 也接近于對照組水平[6]。我們分析恒河猴精細運動能力下降是因為α-syn 寡聚體可以抑制核心蛋白復合體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor,SNARE)的組成,抑制囊泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[23],造成紋狀體多巴胺含量的降低,引起運動癥狀。此外,α-syn 寡聚體可以損傷線粒體復合體Ⅰ,造成線粒體脂質(zhì)過氧化,導致多巴胺能神經(jīng)元死亡[24]。因此,當α-syn 的產(chǎn)生和清除之間的平衡被打破時,α-syn 單體便會錯誤折疊成α-syn 寡聚體,引發(fā)神經(jīng)毒性[25]。而α-syn 被熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)識別后,LAMP2A 能夠?qū)ⅵ?syn—HSP70 復合物募集到溶酶體表面,隨后進入溶酶體降解[23-24],因此LAMP2A過表達通過直接增加溶酶體膜表面的LAMP2A 受體,提高了CMA 清除α-syn 的效率。更為重要的是,磷酸化α-syn 可以阻止高爾基體或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成自噬體膜,以減少自噬溶酶體途徑對自身的降解[26]。但磷酸化α-syn 是否也抑制了溶酶體膜的形成,尚未有更多的報道。而且,LAMP2A 過表達可以激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)[27],同時PKC 可以誘導轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)入核激活,促進溶酶體的產(chǎn)生[28]。因此,LAMP2A 不僅可以直接提高CMA 活性增加α-syn的清除,可能同時也促進了溶酶體的產(chǎn)生。

最近的一項研究顯示,研究人員靶向小鼠神經(jīng)元線粒體,小鼠初期表現(xiàn)出精細運動能力障礙[29],這與我們的研究結(jié)論不謀而合。但小鼠的研究中沒有進行α-syn 病理分析,因此本研究也尚需進一步的病理探究。另外,一項前瞻性研究表明確診帕金森病10 年后28%的患者出現(xiàn)癡呆,確診17 年后有78%進展為帕金森病癡呆[30]。而本研究中動物接受手術時間較短,實驗猴在由透明擋板和模具構(gòu)成的立體空間中沒有表現(xiàn)出視覺空間認知[31]的差異,因此有必要對其進行長期的觀察研究以確定LAMP2A 對認知功能的影響。

綜上所述,本研究在帕金森病恒河猴模型上初次驗證了過表達LAMP2A 可能通過增加α-syn 的CMA 途徑清除、促進溶酶體的產(chǎn)生和減少磷酸化αsyn 對溶酶體膜形成的抑制改善了PD 恒河猴模型的精細運動能力,為進一步研究其中的機制以及為PD 的治療提供了實驗依據(jù)。