成 瑜，劉 京，高英明，3，周家喜，芶劍渝，管景強(qiáng)，鄒 曉*，

1. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所，貴陽(yáng)市花溪區(qū)甲秀南路515 號(hào) 550025

2. 貴州省煙草公司遵義市公司，貴州省遵義市匯川區(qū)人民路341 號(hào) 563000

3. 貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴陽(yáng)市花溪區(qū)甲秀南路515 號(hào) 550025

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，從新鮮煙葉到成品卷煙，采收后的煙草需經(jīng)過(guò)初烤、復(fù)烤和儲(chǔ)存陳化等一系列加工過(guò)程［1-2］。其中初烤和復(fù)烤是決定煙葉品質(zhì)和產(chǎn)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)有重要影響［3-4］。初烤過(guò)程包括低溫高濕的變黃階段、高溫中濕的定色階段和高溫低濕的干筋階段［5］，復(fù)烤過(guò)程包括真空回潮、潤(rùn)葉、打葉和復(fù)烤等加工環(huán)節(jié)［4］。

陳乾麗［3］研究發(fā)現(xiàn)初烤和復(fù)烤過(guò)程中煙葉所處的自然和加工環(huán)境會(huì)提高霉菌污染的概率，增加煙葉霉變的風(fēng)險(xiǎn)。煙葉霉變可影響煙葉的外觀和品質(zhì)，降低煙葉的使用價(jià)值，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［6-7］。Welty 等［8］研究表明曲霉和青霉等真菌是引起煙葉霉變的主要微生物。目前關(guān)于霉變煙葉真菌群落組成的研究已有大量報(bào)道。趙文姬［9］采用稀釋平板法分離出云南霉變煙葉真菌38株，經(jīng)鑒定分別屬于曲霉屬、青霉屬、根霉屬、毛霉屬和木霉屬。陳乾麗等［10］通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)貴州興義地區(qū)烤后霉變煙葉中的優(yōu)勢(shì)屬是曲霉屬、青霉屬和鏈格孢屬等。Zhou 等［11］對(duì)吉林、貴州和上海3 地霉變陳化煙葉的研究發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群為曲霉屬、耐干霉菌屬和節(jié)擔(dān)菌屬。然而，目前大多數(shù)研究主要集中在引起煙葉霉變真菌的種類(lèi)和數(shù)量，而這些真菌具體于哪個(gè)加工階段在煙葉上富集的相關(guān)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)貴州湄潭、平壩和惠水3地4個(gè)加工階段（初烤前、初烤后、復(fù)烤前和復(fù)烤后）的煙葉真菌群落進(jìn)行檢測(cè)，旨在進(jìn)一步探究在煙葉加工過(guò)程中霉菌富集的主要階段和變化過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019 年7 月至12 月在貴州省遵義市湄潭縣、安順市平壩縣和黔南州惠水縣3地的煙田、烤房和復(fù)烤廠采集了初烤前（新鮮煙葉）、初烤后、復(fù)烤前和復(fù)烤后4個(gè)加工階段的煙葉樣品。初烤前煙葉：在煙葉成熟期，采用五點(diǎn)取樣法，從田間（20 m×20 m）隨機(jī)采收15片煙葉［12］。初烤后煙葉：從烤房的上層、中層和下層隨機(jī)各選擇5片煙葉并混合。復(fù)烤前煙葉：在煙葉真空回潮前的煙堆中隨機(jī)抽取15片煙葉并混合。復(fù)烤后煙葉：在復(fù)烤結(jié)束時(shí)隨機(jī)收集500 g煙葉。共采集到12 個(gè)樣品，樣品均為中部葉，品種為云煙87。將樣品置于無(wú)菌袋儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中。

1.2 真菌總DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

采 用E.Z.N.A.?soil DNA kit 試 劑 盒（美 國(guó)Omega 公司）提取煙葉表面和內(nèi)部微生物總DNA，提取后采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其品質(zhì)，使用NanoDrop2000 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司）檢測(cè)DNA濃度。使用正向引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和 反向 引物ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）擴(kuò)增真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1）區(qū)域。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μL）：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mM/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μM/L）0.8 μL，下游引物（5 μM/L）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，從變性到延伸共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延 伸10 min，4 ℃保 存。PCR 產(chǎn) 物 使 用AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒（美國(guó)Axygen Biosciences公司）進(jìn)行純化，并使用QuantiFluor?-ST微型熒光計(jì)（美國(guó)Promega公司）進(jìn)行定量。經(jīng)處理的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成Illumina MiSeq測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 序列處理及OTUs注釋

根據(jù)Overlap關(guān)系將Miseq測(cè)序得到PE reads進(jìn)行拼接，對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，根據(jù)序列首尾兩端的Barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，校正序列方向獲得優(yōu)化序列。

通過(guò)UPARSE 7.0.1090軟件［13］（http：//drive5.com/uparse/）對(duì) 序 列 進(jìn) 行OTUs（Operational Taxonomic Unit，操作分類(lèi)單元）聚類(lèi)，聚類(lèi)相似度水平為97%。選擇OTUs 的代表性序列通過(guò)RDP Classifier 2.2 軟件［14］（http：//rdp.cme.msu.edu/）與Unite Release 8.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//unite.ut.ee/index.php）進(jìn)行物種分類(lèi)注釋。使用Mothur 軟件（https：//www.mothur.org/wiki/Download_mothur）計(jì)算各組樣本的α多樣性指數(shù)，包括香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、辛普森指數(shù)（Simpson）、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Sobs指數(shù)及覆蓋度指數(shù)。

1.3.2 真菌群落動(dòng)態(tài)變化分析

根據(jù)物種注釋和豐度信息，分析不同加工階段優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群，其中相對(duì)豐度小于0.01%的物種歸為“其他”。在屬水平上選擇了總豐度排名前35 個(gè)類(lèi)群，利用熱圖分析不同加工階段樣品中優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群的變化。利用韋恩圖分析OTUs 在不同加工階段的數(shù)量差異。利用LEfSe系統(tǒng)分析不同加工階段樣品間存在顯著差異的物種（LDA=2）。利用FUNGuild 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.stbates.org/guilds/app.php）解析不同加工階段煙葉真菌的營(yíng)養(yǎng)方式（Trophic mode）和對(duì)環(huán)境資源的吸收利用方式（Guild）。使用SPSS 20.0 軟件對(duì)α多樣性指數(shù)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果

如圖1 所示，隨著樣品序列數(shù)的增加，Shannon-Winner 指數(shù)曲線越趨向平坦，表明本試驗(yàn)中測(cè)序的數(shù)據(jù)深度可較全面地反映測(cè)序樣品中微生物信息。

圖1 Shannon-Winner指數(shù)曲線Fig.1 Shannon-Winner index curves

經(jīng)優(yōu)化處理，12 個(gè)樣本共檢測(cè)到834 184 條有效序列，189 990 454 個(gè)堿基，平均每個(gè)樣本60 441～74 962條序列，序列長(zhǎng)度為140～531 bp。本次檢測(cè)中共鑒定出4個(gè)門(mén)、23個(gè)綱、71個(gè)目、196個(gè)科、445個(gè)屬和1 171 個(gè)OTUs。由表1 可知，反映物種多樣性的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)值分別在1.80～2.43 和0.25～0.34之間，反映真菌豐富度的Chao指數(shù)和ACE指數(shù)分別在353.30～423.82和275.58～429.52之間，Sobs指數(shù)在298.00～384.67之間。4個(gè)加工階段樣品覆蓋度指數(shù)均達(dá)0.98以上，表明本次測(cè)序數(shù)據(jù)合理。

表1 不同加工階段煙葉真菌α多樣性指數(shù)①Tab.1 Alpha diversity index of tobacco leaf fungi of different processing stages

2.2 真菌群落組成

在門(mén)水平上，擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）和子囊菌門(mén)（Ascomycota）為4個(gè)加工階段共有優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；其次是毛霉門(mén)（Mucoromycota）（圖2）。擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度下降幅度較大（從初烤前的73.56%降至復(fù)烤后的52.1%），而子囊菌門(mén)相對(duì)豐度上升幅度較大（從初烤前的26.21%上升至復(fù)烤后的47.26%）。

圖2 不同加工階段煙葉真菌群落組成（門(mén)水平）Fig.2 Tobacco leaf fungal community composition at phylum level of different processing stages

物種相對(duì)豐度柱狀圖（圖3）表明，在屬水平上，初烤前優(yōu)勢(shì)屬為 Sampaiozyma、枝孢菌屬（Cladosporium）和Symmetrospora 等。初烤后優(yōu)勢(shì)屬為Sampaiozyma、鏈格孢屬（Alternaria）、未分類(lèi)的亞隔孢殼科（Didymellaceae）真菌和枝孢菌屬（Cladosporium）等。 復(fù)烤前優(yōu)勢(shì)屬為曲霉屬（Aspergillus）、Sampaiozyma 和根霉屬（Rhizopus）等。復(fù)烤后優(yōu)勢(shì)屬為Sampaiozyma 和曲霉屬（Aspergillus）等。Sampaiozyma 是4 個(gè)加工階段共有優(yōu)勢(shì)屬，在各階段其相對(duì)豐度分別為44.27%、37.87%、24.12%和46.12%。曲霉屬（Aspergillus）在初烤前的相對(duì)豐度僅為0.05%，在初烤后、復(fù)烤前和復(fù)烤后相對(duì)豐度分別 為2.86% 、60.82% 和25.78% 。 鏈 格 孢 屬（Alternaria）在初烤前的相對(duì)豐度為0.5%，初烤后其相對(duì)豐度達(dá)到18.42%，復(fù)烤后降至1.3%。未分類(lèi)的亞隔孢殼科（Didymellaceae）真菌和枝孢菌屬（Cladosporium）的相對(duì)豐度也呈現(xiàn)初烤后上升和復(fù)烤后下降的趨勢(shì)。而初烤前相對(duì)豐度較高的Symmetrospora在后3個(gè)加工階段中持續(xù)降低。

圖3 不同加工階段煙葉真菌群落組成（屬水平）Fig.3 Tobacco fungal community composition at genus level of different processing stages

層次聚類(lèi)熱圖（圖4）表明，初烤前和復(fù)烤后的群落結(jié)構(gòu)較相似，故先聚為一類(lèi)，再與初烤后真菌群落聚類(lèi)，最后與復(fù)烤前真菌群落聚類(lèi)。結(jié)果表明初烤后和復(fù)烤后的真菌群落差異較小，復(fù)烤前的真菌群落與初烤后和復(fù)烤后的真菌群落差異較大，這意味著初烤后的真菌群落在復(fù)烤前產(chǎn)生了變化，在復(fù)烤后又發(fā)生了變化。整個(gè)群落變化規(guī)律為初烤前煙葉中微球黑粉菌綱的Sampaiozyma 和囊擔(dān)子菌綱的Symmetrospora 占優(yōu)勢(shì)；初烤后煙葉中微球黑粉菌綱的 Sampaiozyma 和座囊菌綱的枝孢菌屬（Cladosporium）和鏈格孢屬（Alternaria）占優(yōu)勢(shì)；復(fù)烤前煙葉中散囊菌綱的曲霉屬（Aspergillus）、微球黑粉菌綱的Sampaiozyma、座囊菌綱的鏈格孢屬（Alternaria）和節(jié)擔(dān)菌綱的節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）占優(yōu)勢(shì)；復(fù)烤后微球黑粉菌綱的Sampaiozyma和散囊菌綱的曲霉屬（Aspergillus）占優(yōu)勢(shì)。

圖4 不同加工階段煙葉真菌的聚類(lèi)熱圖（屬水平）Fig.4 Clustering heatmap of fungi at genus level of different processing stages

2.3 不同加工階段煙葉OTUs數(shù)量變化

由圖5 可知，4 個(gè)加工階段的真菌種類(lèi)存在差異。初烤前、初烤后、復(fù)烤前和復(fù)烤后煙葉的共有OTUs 數(shù)量為228 個(gè)（占所有OTUs 數(shù)量的19.47%）。較初烤前，初烤后、復(fù)烤前和復(fù)烤后OTUs 數(shù)量分別下降了18.45%、22.67%和15.21%。初烤前、初烤后、復(fù)烤前和復(fù)烤后煙葉的特有OTUs 數(shù)量分別為201、102、89 和128 個(gè)，分別占所有OTUs 數(shù)量的17.16%、8.7%、7.6%和10.93%，其中初烤前特有OTUs數(shù)量最多。初烤前煙葉的OTUs 數(shù)量和特有OTUs 數(shù)量均高于另外3個(gè)加工階段。

2.4 LEfSe物種差異分析

不同加工階段LEfSe物種差異分析結(jié)果見(jiàn)圖6，LDA值表示每個(gè)組分（物種）相對(duì)豐度對(duì)差異效果影響的大小。結(jié)果表明，在能夠檢測(cè)到的屬水平上（排除Norank 和Unclassified 的類(lèi)群）各樣本之間LDA值＞2.0 的真菌類(lèi)群有6 個(gè)，分別是初烤前的Bannoa屬和赭霉屬（Ochroconis），復(fù)烤前的曲霉屬（Aspergillus）和 節(jié) 擔(dān) 菌 屬（Wallemia），復(fù) 烤 后 的Cutaneotrichosporon和青霉屬（Penicillium）。

圖6 不同加工階段煙葉LEfSe物種差異分析圖Fig.6 Analysis of tobacco leaf LEfSe species differences at different processing stages

2.5 FUNGuild功能類(lèi)群預(yù)測(cè)

利用FUNGuild對(duì)煙葉真菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示4個(gè)加工階段共鑒定出1 171個(gè)OTUs，被劃分為8個(gè)真菌功能類(lèi)群，即腐生菌群（Saprotroph）、共生菌群（Symbiotroph）、病理菌群（Pathotroph）、腐生-共生過(guò)渡型（Saprotroph-Symbiotroph）、病原菌-腐生-共生菌群（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph）、病理寄生-腐生菌群（Pathotroph-Saprotroph）、病理寄生-共生菌群（Pathotroph-Symbiotroph）和病原-腐生-共生菌群（Pathogen-Saprotroph-Symbiotroph）。其中復(fù)烤前后的腐生菌群（Saprotroph）相對(duì)豐度均高于初烤前后，復(fù)烤前最高。

根據(jù)對(duì)環(huán)境資源的吸收利用方式，4 個(gè)加工階段煙葉真菌可分為65 個(gè)共位群，其中在初烤前煙葉中動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-植物病原菌-木腐菌（Animal Pathogen-Endophyte-Plant Pathogen-Wood Saprotroph）和動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-木腐菌（Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Wood Saprotroph）的相對(duì)豐度較高；初烤后和復(fù)烤后煙葉中均是植物病原菌-內(nèi)生菌-植物病原菌-木腐菌（Animal Pathogen-Endophyte-PlantPathogen-WoodSaprotroph）的相對(duì)豐度較高；而復(fù)烤前煙葉中未定義腐生菌（Undefined Saprotroph）的相對(duì)豐度較高（圖7）。

圖7 基于OTUs水平注釋表的真菌功能群相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundances of fungal functional groups based on OTUs annotation table

3 討論

真菌群落分析表明，擔(dān)子菌門(mén)和子囊菌門(mén)在4個(gè)加工階段均為優(yōu)勢(shì)門(mén)，這與Welty 等［15］和陳善義等［16］的研究結(jié)果一致。然而，本研究中，擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度下降幅度較大（從初烤前的73.56%降至復(fù)烤后的52.1%），而子囊菌門(mén)相對(duì)豐度上升幅度較大（從初烤前的26.21%上升至復(fù)烤后的47.26%），這與Chen等［17］研究發(fā)現(xiàn)烘烤過(guò)程中子囊菌門(mén)相對(duì)豐度下降幅度較大，而擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度變化不明顯的研究結(jié)果不一致，造成此差異的原因可能是本研究中樣品煙葉生長(zhǎng)的地理環(huán)境和樣品處理方式與Chen等［17］的研究不同。此外，本研究中在屬水平上Sampaiozyma、曲 霉 屬（Aspergillus）和 鏈 格 孢 屬（Alternaria）是優(yōu)勢(shì)菌屬；這與陳乾麗等［10］發(fā)現(xiàn)曲霉屬和鏈格孢屬是初烤后煙葉中的優(yōu)勢(shì)屬和Zhou等［18］發(fā)現(xiàn)在陳化初期煙葉中Sampaiozyma 是優(yōu)勢(shì)菌屬的結(jié)論基本一致。相比初烤和復(fù)烤前后的細(xì)菌群落［4，18-20］，真菌群落的變化較小，相對(duì)穩(wěn)定，這與Hu等［21］研究結(jié)果相似。Welty等［8，22］把收獲前侵入到煙草中的真菌定義為“田間真菌”，在收獲后侵入的真菌稱(chēng)為“儲(chǔ)藏真菌”，且田間真菌很少感染煙草，而儲(chǔ)藏真菌（主要是曲霉菌和青霉菌）在收獲后侵入煙草。Christensen 等［23］和Tuite 等［24］的研究也證實(shí)，曲霉和青霉等會(huì)在收獲后侵入，導(dǎo)致谷物變質(zhì)。在本研 究 中，曲 霉 屬（Aspergillus）、帚 枝 霉 屬（Sarocladium）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、枝頂孢霉屬（Acremonium）和根霉屬（Rhizopus）等致霉真菌是初烤后在煙葉上顯著富集的菌群，而青霉屬（Penicillium）主要是在復(fù)烤階段顯著富集。本研究中功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，煙葉在初烤后腐生菌群相對(duì)豐度升高，復(fù)烤前相對(duì)豐度最高。曲霉屬和青霉屬為常見(jiàn)腐生真菌［15，25］，后期腐生菌群的增加可能是由曲霉和青霉的富集引起。上述研究結(jié)果均表明曲霉和青霉等致霉真菌是在收獲后侵入煙草，這與Welty等［22］的結(jié)論一致，尤其是初烤后至復(fù)烤前，復(fù)雜的環(huán)境增加了致霉真菌侵入的可能性，未來(lái)可加強(qiáng)此期間的霉變防治。然而，曲霉和青霉等作為常見(jiàn)致霉真菌，其致霉機(jī)制還鮮見(jiàn)報(bào)道，未來(lái)可深入研究。此外，本研究中擔(dān)子菌門(mén)微球黑粉菌綱的Sampaiozyma優(yōu)勢(shì)地位明顯。有研究［26-28］證明其為土壤及湖泊的沉積物中的野生酵母，能產(chǎn)生脂肪酶和果膠酶等胞外酶，但其在煙葉中的功能和特性鮮見(jiàn)報(bào)道，可進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了4個(gè)加工階段（初烤前、初烤后、復(fù)烤前和復(fù)烤后）煙葉樣品的真菌群落，分析結(jié)果表明4個(gè)加工階段煙葉的真菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異：初烤前主要菌屬為Symmetrospora、Sampaiozyma、枝孢菌屬（Cladosporium）和布勒擲孢酵母屬（Bullera），初烤后主要菌屬為未分類(lèi)亞隔孢殼科（Didymellaceae）真菌、Sampaiozyma、鏈格孢屬（Alternaria）和尾孢菌屬（Cercospora）；復(fù)烤前主要菌屬為曲霉屬（Aspergillus）、Sampaiozyma 和根霉屬（Rhizopus），復(fù)烤后主要菌屬為曲霉屬（Aspergillus）、Sampaiozyma 和未分類(lèi)亞隔孢殼科（Didymellaceae）真菌。其中Sampaiozyma是共有優(yōu)勢(shì)菌屬，在4個(gè)加工階段的相對(duì)豐度分別為44.27%、37.87%、24.12%和46.12%。曲霉屬（Aspergillus）是復(fù)烤階段優(yōu)勢(shì)屬，其相對(duì)豐度初烤前為0.05%，而復(fù)烤前和復(fù)烤后的相對(duì)豐度分別為60.82%和25.78%。