多杰卓瑪 黃燕烽 梅之南 周生軍 彭逸 陳維武**(.西藏奇正藏藥股份有限公司，西藏 拉薩 85000；.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，浙江 杭州 005；.中南民族大學(xué)，湖北 武漢 40074)

細顆粒物(fine particulate mate,PM2.5)是大氣污染中危害人體健康的重要危險因素，因其粒徑小、活性強，故其表面可以富集大量的有毒有害物質(zhì)，并可通過呼吸系統(tǒng)直接透過肺泡進入血液損害人體健康[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明，PM2.5顆粒污染與支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病、血栓等心血管疾病以及肥胖和2型糖尿病的發(fā)生率密切相關(guān)[3-4]。過量的PM2.5顆粒暴露能夠增加機體的氧化應(yīng)激水平和脂肪組織以及肺部乃至全身的慢性炎癥水平，促進支氣管哮喘、阻塞性肺氣腫的急性發(fā)作，嚴(yán)重者可誘發(fā)心肌梗塞、心力衰竭等重大心血管疾病[5-6]。因此，免疫系統(tǒng)是機體對PM2.5反應(yīng)的主要系統(tǒng)之一，尤其巨噬細胞對細顆粒物的吞噬是機體清除PM2.5重要途徑之一。此外，有研究表明空氣污染物尤其是PM2.5能夠損害腸道細菌，影響腸道的微環(huán)境健康等[7]，并且經(jīng)腸道排除PM2.5也是機體清除PM2.5的重要途徑。目前針對PM2.5的藥物研究較少，臨床上也并無靶向PM2.5清除的有效藥物。

二十五味珍珠片是始載于藏族醫(yī)名著《四部醫(yī)典》中的經(jīng)典名方，其主要成分有珍珠、肉豆蔻、石灰華、草果、丁香、降香、豆蔻、訶子、檀香、螃蟹、牛黃、人工麝香等二十五味藥材，具有安神開竅、舒筋活絡(luò)之功效，目前臨床上主要用于治療中風(fēng)、腦血栓后遺癥等神經(jīng)性疾病、心腦血管疾病和精神障礙性疾病[8-10]。較多的研究表明二十五味珍珠片能夠改善機體微循環(huán)，從而緩解改善心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[11-13]。本研究擬在探討斑馬魚模型中二十五味珍珠片是否能夠改善體循環(huán)促進PM2.5類似物納米活性炭顆粒的外排從而產(chǎn)生抗PM2.5的作用。我們發(fā)現(xiàn)二十五味珍珠片能夠增加機體兩種納米活性炭顆粒的外排途徑，即增加巨噬細胞的吞噬作用和改善腸道功能、促進腸道蠕動外排，從而增加納米活性炭顆粒的外排，為臨床上靶向PM2.5的藥物選擇提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 SMZ645解剖顯微鏡、AZ100電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(Nikon公司)；CP214精密電子天平(奧豪斯公司)；IM-300顯微注射儀、PC10拉針儀(Narishige公司)。

1.2試藥 二十五味珍珠片，奇正(北京)傳統(tǒng)藏醫(yī)藥外治研究院有限公司提供，批號：Z20130023，按濃度水溶后給藥；甲基纖維素、吲哚美辛，阿拉丁試劑有限公司；中性紅、脂多糖、尼羅紅，Sigma公司；納米活性炭顆粒，西安齊岳生物科技有限公司。

1.3實驗動物 黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚、轉(zhuǎn)基因中性粒細胞熒光斑馬魚，購自國家水生生物種質(zhì)資源庫國家斑馬魚資源中心，以上斑馬魚均飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中，以自然成對交配方式進行繁殖，實驗動物使用許可證號為：SYXK(浙)2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認證的要求。

2 方法

2.1對斑馬魚最大耐受濃度(MTC)測定 隨機選取330尾受精后2 d(受精后天數(shù)，days post fertilization,dpf)黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，分別水溶給予二十五味珍珠片62.5、125、250、500和1000 μg·mL-1濃度，同時設(shè)置正常對照組(即養(yǎng)魚用水處理斑馬魚)，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚，每孔容量為3 mL。連續(xù)觀察記錄5 dpf至7 dpf，并觀察記錄斑馬魚的反應(yīng)和死亡情況并移除死亡的斑馬魚。統(tǒng)計各實驗組的斑馬魚死亡數(shù)量和毒性情況，確定二十五味珍珠片對斑馬魚的最大耐受濃度(MTC)。

2.2對斑馬魚巨噬細胞吞噬納米活性炭的影響 選取120尾黑色素等位基因突變型 Albino品系斑馬魚進行靜脈注射納米活性炭后隨機分為對照組和實驗組，實驗組給予不同濃度二十五味珍珠片水溶液(27.8、83.3、250 μg·mL-1)，對照組給予溶劑對照，處理2 d后，加入中性紅溶液對斑馬魚進行活體染色，統(tǒng)計吞噬了納米活性炭的巨噬細胞的數(shù)量(N)，并根據(jù)巨噬細胞吞噬促進率來評價二十五味珍珠片對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能的影響。巨噬細胞吞噬促進作用(%)= [N(實驗組)/N(模型組)-1]×100%。

2.3對腸道功能改善的影響 如上選取120尾同系斑馬魚進行肌內(nèi)注射給予納米活性炭后隨機分為對照組和實驗組，給予不同濃度的二十五味珍珠片水溶液或者溶劑對照，5 d后，統(tǒng)計腸道內(nèi)有納米活性炭的斑馬魚數(shù)量(Z)，以評價二十五味珍珠片對納米活性炭分泌功能的影響。分泌發(fā)生率(%)=Z(納米顆粒分泌入腸道)/ Z(總數(shù))×100%。

2.4對腸道蠕動功能的影響 隨機選取120尾野生型AB品系斑馬魚，給予尼羅紅16 h后隨機分為對照組和實驗組。給予不同濃度的二十五味珍珠片水溶液處理6 h后，每組隨機取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚腸腔中熒光染料信號強度、拍照后進行圖像分析，計算斑馬魚腸腔中熒光染料的信號強度(S)，以評價二十五味珍珠片促進腸道蠕動功能。腸蠕動促進率(%)= [1-S(實驗組)/S(模型組)]×100%。

2.5對斑馬魚炎癥消退的影響 隨機選取120尾轉(zhuǎn)基因中性粒細胞熒光斑馬魚，分別給予不同濃度的二十五味珍珠片水溶液和陽性對照藥吲哚美辛(60 μM)，處理 1 h 后，卵黃囊注射脂多糖后再分別同樣藥物干預(yù)2 h后，統(tǒng)計斑馬魚卵黃囊內(nèi)中性粒細胞個數(shù)(N)。炎癥消退作用百分比(%)= [(N(模型組)-N(實驗組)/ N(模型組)]×100%。

2.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。數(shù)據(jù)前后對比采用配對t檢驗，組間對比采用單因素方差分析，P<0.05為有差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1對斑馬魚最大耐受濃度(MTC)測定 二十五味珍珠片62.5、125和250 μg·mL-1濃度組斑馬魚均未出現(xiàn)死亡，上述三組均未發(fā)現(xiàn)任何異常表型，500和1000 μg·mL-1濃度組斑馬魚全部死亡。因此斑馬魚對二十五味珍珠片的最大耐受濃度為250 μg·mL-1。見表1。

表1 二十五味珍珠片“濃度-死亡率”(n=30)

3.2對斑馬魚巨噬細胞吞噬納米活性炭的影響 確定模型建立成功后，與模型組(16個)相比，二十五味珍珠片濃度為27.8、83.3和250 μg·mL-1時，斑馬魚體內(nèi)吞噬了納米活性炭的巨噬細胞數(shù)量分別為37、35和36個(P<0.001)，巨噬細胞吞噬促進率分別為131.3%、118.8%和125.0%，提示二十五味珍珠片在27.8、83.3和250 μg·mL-1濃度時對斑馬魚巨噬細胞吞噬功能都有明顯的促進作用。(見圖1和表2)。

黑色區(qū)域為斑馬魚腦部巨噬細胞統(tǒng)計區(qū)域，其中黃色箭頭所指為吞噬了納米活性炭的巨噬細胞，由于其吞噬了納米活性炭，顏色比正常的巨噬細胞要深。

表2 對巨噬細胞吞噬功能的促進作用

3.3對斑馬魚腸蠕動的促進作用 二十五味珍珠片濃度為27.8、83.3和250 μg·mL-1時，納米活性炭分泌發(fā)生率分別為16.7%、36.7%和36.7%，與模型組(23.3%)相比，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，提示二十五味珍珠片對斑馬魚納米活性炭分泌進入腸道沒有促進作用(見表3)。我們進一步檢測了各組斑馬魚的腸蠕動功能，二十五味珍珠片在濃度為27.8、83.3和250 μg·mL-1時，斑馬魚腸腔熒光強度分別為578095、511274和223950像素，其腸蠕動促進率分別為25.5%、34.1%和71.2%，與模型組(776340像素)比較，三組給藥組均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)，提示二十五味珍珠片能夠促進斑馬魚腸蠕動，從而促進納米活性炭的外排(見表4)。

表3 對斑馬魚體內(nèi)納米活性炭分泌的影響(n=30)

表4 對斑馬魚腸蠕動促進率的影響(n=10)

3.4二十五味珍珠片對于脂多糖誘導(dǎo)的中性粒細胞的影響 二十五味珍珠片濃度為27.8、83.3和250 μg·mL-1時，斑馬魚卵黃囊內(nèi)中性粒細胞數(shù)量分別為21.4、21.6和18.6個，與模型組(21.7個，P> 0.05)無統(tǒng)計學(xué)差異；其對斑馬魚炎癥消退率分別為1.4%、0.5%和14.3%，提示二十五味珍珠片對LPS誘發(fā)的炎癥沒有改善作用(見表5)。

表5 二十五味珍珠片對LPS誘發(fā)的炎癥實驗結(jié)果(n=10)

4 討論

經(jīng)濟的不均衡發(fā)展不可避免地導(dǎo)致大氣污染日益嚴(yán)重，大氣中的主要污染物PM2.5濃度隨之增大。PM2.5具有粒徑小，面積大，活性強、易附帶有毒有害物質(zhì)且在大氣中的停留時間長、輸送距離遠等特點，對人體健康影響巨大[1]。大量研究表明，長期暴露于PM2.5與更高的肥胖風(fēng)險、心血管疾病、2型糖尿病和肺癌等疾病風(fēng)險有關(guān)。目前，臨床上靶向干預(yù)PM2.5藥物的研發(fā)仍處于起步階段[4-5]。

二十五味珍珠片是藏藥中的經(jīng)典名方，其主要有珍珠、肉豆蔻、石灰華、草果、丁香、降香、豆蔻、訶子、檀香、螃蟹、牛黃、人工麝香等二十五味藥，具有安神開竅、舒筋活絡(luò)之功效，目前臨床上主要用于治療中風(fēng)、腦血栓后遺癥等神經(jīng)性疾病、心腦血管疾病和精神障礙性疾病[9]。有研究表明二十五味珍珠片能夠改善大腦局部微循環(huán)，從而改善腦血栓后遺癥以及缺血性腦卒中等；并且二十五味珍珠片可以擴張冠狀動脈、改善心電圖表現(xiàn)和降低血液黏度等，有助于緩解冠心病心絞痛等[10]。此外，也有研究表明二十五味珍珠片具有緩解血管內(nèi)皮損傷并促進血管內(nèi)皮再生等功效。因此，二十五味珍珠片是否能夠改善體循環(huán)和免疫應(yīng)答等功能促進PM2.5的外排從而產(chǎn)生抗PM2.5的作用非常值得研究。

免疫系統(tǒng)對PM2.5的反應(yīng)有兩面性:一方面是免疫系統(tǒng)尤其是免疫細胞能夠吞噬PM2.5，將其通過消化系統(tǒng)等排出體外；另一方面免疫系統(tǒng)的反應(yīng)也是機體受損的原因之一[14-17]。PM2.5其本身能夠刺激免疫細胞產(chǎn)生的大量的促炎性細胞因子，從而導(dǎo)致機體的炎癥反應(yīng)，此外，PM2.5刺激機體產(chǎn)生特異性的IgE，促進白三烯、組胺等過敏反應(yīng)相關(guān)因子的分泌，從而導(dǎo)致哮喘等過敏性疾病[18-19]。尤其在肺部慢性疾病的發(fā)病過程中，PM2.5的亞慢性暴露可以造成機體的持續(xù)性炎癥損傷，并導(dǎo)致巨噬細胞的吞噬功能下降[20-21]。因此我們的研究重點觀察了二十五味珍珠片對巨噬細胞吞噬PM2.5類似物納米活性炭顆粒的作用，以及二十五味珍珠片對PM2.5類似物納米活性炭顆粒的外排促進作用。結(jié)果表明靜脈注射PM2.5類似物納米活性炭顆粒時，二十五味珍珠片能夠顯著增加斑馬魚巨噬細胞對PM2.5類似物納米活性炭顆粒的吞噬；我們的研究還發(fā)現(xiàn)二十五味珍珠片能夠促進PM2.5的另一條外排途徑即腸道分泌和外排，雖然給藥后PM2.5類似物的腸道分泌情況并沒有顯著改善，但是二十五味珍珠片顯著促進了斑馬魚腸道的蠕動，進而促進PM2.5的外排，進一步提示二十五味珍珠片可以加速機體代謝PM2.5。進一步，我們希望觀察二十五味珍珠片能否改善PM2.5類似物引起的免疫系統(tǒng)炎癥，并進一步檢測其對炎癥信號如NF-κB等有無作用，因此我們觀察了二十五味珍珠片對LPS誘導(dǎo)的炎癥的作用，然而，結(jié)果表明二十五味珍珠片對LPS引起的炎癥并無較大的改善作用。

綜上，二十五味珍珠片能夠增加巨噬細胞的吞噬作用，促進腸道蠕動，增加PM2.5類似物納米活性炭顆粒的外排，聯(lián)合應(yīng)用促進PM2.5類似物納米活性炭顆粒的腸道分泌和抗炎藥物有助于進一步應(yīng)用于防治PM2.5引起的相關(guān)疾病。本實驗中二十五味珍珠片的藥效學(xué)評價主要在斑馬魚模型上完成，還需在哺乳動物模型和臨床試驗中做進一步驗證。