王明喜，張麗霞，王長平，朱前勇

1.安陽市中醫(yī)院，河南 安陽 455000； 2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，我國每年有14萬的新增宮頸癌患者，發(fā)病率僅次于乳腺癌，這可能與我國婦女人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染率上升有一定關(guān)系[1-2]。目前，宮頸癌的主要治療方法為手術(shù)治療和放療，但不良反應(yīng)較大，且對年輕患者生育功能的保留以及對復(fù)發(fā)或晚期宮頸癌的治療造成諸多問題，因此尋找新的宮頸癌治療方法尤為重要[3-4]。

近年來，中草藥以有效、低毒的優(yōu)勢日益受到人們的重視，并作為治療腫瘤的補充和替代療法。掌葉半夏為植物掌葉半夏的塊莖，性辛、味平、入肝經(jīng)，具有祛風(fēng)定驚、燥濕化痰、消腫散結(jié)的功效[5-6]?，F(xiàn)代研究表明，掌葉半夏水提物(pinellia extract，PE)可通過誘導(dǎo)CD+T細(xì)胞向Th1型分化，改善調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T lymphocyte,Treg)和輔助性T淋巴細(xì)胞17(T helper lymphocyte 17,Th17)的比例發(fā)揮抗腫瘤免疫作用；還可通過阻斷細(xì)胞外調(diào)解蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的磷酸化、促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白質(zhì)(B-cell lymphoma-2-associated X，Bax)的基因表達(dá)水平抑制CaSki和HeLa宮頸癌細(xì)胞株的增殖[7]。進(jìn)一步的動物實驗研究證明，PE能改善順鉑引起的裸鼠體質(zhì)量下降及肝酶升高，同時能夠抑制CaSki裸小鼠皮下移植瘤的生長[8-9]，但對其具體機制未做深入研究。本研究通過細(xì)胞實驗探討PE對人類宮頸癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響，并擬建立人宮頸癌HeLa細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型，基于小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(circular RNA sponge for microRNA-7,ciRS-7)/microRNA-7(miR-7)/著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)信號通路探討PE改善宮頸癌的作用機制，為臨床宮頸癌的治療提供新途徑。

1 材料

1.1 動物與細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞(HeLa，中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，細(xì)胞目錄號：TChu187)；SPF級BALB/c-nu雌性裸小鼠18只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，(7±1)周齡，體質(zhì)量(20±2)g，動物合格證號：201711179，動物許可證號：SCXK(京)2017-1-003，所有小鼠均籠養(yǎng)在相同條件下，室溫控制在(24±1) ℃，自由攝食、飲水，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。動物實驗由安陽市中醫(yī)院動物倫理委員會審批通過(HNN02019-0129)。

1.2 藥物與試劑PE(上海禾午生物科技，貨號：S24752)；胎牛血清(北方智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，貨號：10099141C)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ML2766)；FAK抗體(上海撫生實業(yè)有限公司，貨號：A097939)；p-FAK山羊抗兔單克隆抗體(美國Abcam公司，貨號：ab81298)；IgG辣根過氧化酶(horseradish reroxidase,HRP)標(biāo)記二抗多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-40295G-HRP)；GAPDH單克隆抗體、TRIzol 試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：SY0635、BTN71201)；Go ScriptTM 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(普洛麥格生物技術(shù)有限公司，貨號：A2800)；實時熒光定量PCR試劑盒(上海谷研實業(yè)有限公司，貨號：GOY-0606P)；DMEM培養(yǎng)基(上海戶實醫(yī)藥科技有限公司，貨號：12800-017)；牛胎兒血清(美國 Invitrogen 公司，貨號：A3161001C)；青霉素(湖北威德利化學(xué)科技有限公司，規(guī)格：5 kg/瓶，貨號：HBW-M9)；鏈霉素(湖北廣奧生物科技有限公司，規(guī)格：25 kg/桶，貨號：GA3807)；羅斯威爾公園紀(jì)念研究所(roswell park memorial institute,RPMI) 1640培養(yǎng)基(上海華雅思創(chuàng)生物科技有限公司，貨號：10-040-CV)；引物序列委托上海生物工程技術(shù)公司合成。

1.3 儀器DM500型光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、VORTEX 3型漩渦混勻器、DC300F型生物顯微鏡(德國LEICA公司)；JY04S-3C型凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海創(chuàng)賽科技有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將HeLa細(xì)胞復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)移至DMEM培養(yǎng)基中(含10%熱滅活的牛胎兒血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)，在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，用0.5%胰蛋白酶消化傳代，傳2至3代后備用。

2.2 Transwell小室法檢測HeLa細(xì)胞侵襲、遷移能力Transwell小室用孔徑6.5 mm微孔膜分隔為上室和下室。收集2.1項下所得的宮頸癌HeLa細(xì)胞，分為HeLa細(xì)胞對照組和HeLa細(xì)胞PE干預(yù)組(0.15 g·L-1)。于4 ℃、3 000 r·min-1下將兩組HeLa細(xì)胞離心10 min，棄上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌，反復(fù)進(jìn)行3次，取200 μL HeLa懸液置于Transwell上室，并加600 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液到Transwell下室，培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室用預(yù)冷PBS沖洗2次，輕輕擦去上室細(xì)胞，甲醇固定膜及膜上細(xì)胞15 min，結(jié)晶紫染色30 min，33%醋酸溶液洗脫，顯微鏡下觀察拍照，計算細(xì)胞計數(shù)[10]。上述操作重復(fù)3次取均值。

2.3 動物分組、移植瘤模型制備及藥物干預(yù)將18只BALB/c-nu雌性裸小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成正常對照組、皮下移植瘤模型組和PE干預(yù)組，每組6只。取2.1項下對數(shù)生長期的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107mL-1，除正常對照組外，其余組裸小鼠頸背部皮下注射接種人宮頸癌HeLa細(xì)胞0.2 mL建立移植瘤模型。接種13天后，瘤體直徑大約5 mm，此時PE干預(yù)組裸小鼠以10 mg·kg-1劑量腹腔注射0.2 mL PE，每天1次，連續(xù)3周，其余組給予同等體積的生理鹽水。

2.4 荷瘤小鼠腫瘤體積及抑瘤率的計算用藥3周后，分別測量移植瘤的長徑、短徑，計算腫瘤體積V=長徑×短徑2/2，評估3組小鼠移植瘤的大小。小鼠脫臼處死，取腫瘤并稱其質(zhì)量，計算抑瘤率。

抑瘤率=(對照組平均瘤質(zhì)量-干預(yù)組平均瘤質(zhì)量)/對照組平均瘤質(zhì)量×100%

2.5 RT-qPCR法檢測各組小鼠腫瘤組織中ciRS-7mRNA及miR-7mRNA的表達(dá)水平取0.1 g小鼠腫瘤組織，放入研缽中，在液氮中將其充分研磨后，倒入1.5 mL EP管中，加入1 mL TRIzol溶液，振蕩混勻。室溫孵育10 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上層清液，根據(jù)1 mL TRIzol加入 200 μL 氯仿比例，加入專用氯仿，振蕩15 s，冰浴靜置20 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，加入450 μL異丙醇，混勻，-20 ℃孵育40 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min，棄去上清液，加入1 mL冰浴的75%乙醇洗滌沉淀，使沉淀懸浮，4 ℃，7 500 r·min-1離心10 min，棄去上清液。PCR擴增：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min(共35個循環(huán))，72 ℃總延伸6 min。隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析目的基因和參比基因GAPDH的條帶灰度值[11]。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 Western Blot法檢測各組小鼠腫瘤組織中FAK蛋白的表達(dá)水平取腫瘤組織100 mg，研碎后，加入總蛋白提取液，冰浴后于4 ℃下10 000 r·min-1離心10 min，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度至5 mg·L-1，取20 μL，水浴加熱變性后上樣，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同相對分子質(zhì)量蛋白分離，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，將膜洗滌后在5%牛血清蛋白溶液中室溫封閉60 min，TBST洗滌后4 ℃孵育一抗(FAK、p-FAK GAPDH一抗稀釋比例為1500)，過夜后孵育HRP標(biāo)記的鼠抗兔二抗(12 000)，室溫下振蕩孵育2 h，清洗后用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，顯色后，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，Image- QuaNT軟件測光密度，以GAPDH為內(nèi)參，計算相對光密度值[12]。

3 結(jié)果

3.1 PE對HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell小室法檢測 HeLa細(xì)胞侵襲能力的變化發(fā)現(xiàn)，與HeLa細(xì)胞對照組比較，HeLa細(xì)胞PE干預(yù)組細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.01)，提示PE可抑制HeLa細(xì)胞的侵襲能力。見圖1，表2。

注：A：HeLa細(xì)胞對照組；B：HeLa細(xì)胞PE干預(yù)組

表2 PE對HeLa細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

3.2 PE對HeLa細(xì)胞遷移能力的影響Transwell小室法檢測 HeLa細(xì)胞遷移能力的變化發(fā)現(xiàn)，與HeLa細(xì)胞對照組比較，HeLa細(xì)胞PE干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)目顯著降低(P<0.01)，提示PE可抑制HeLa細(xì)胞的遷移能力。見圖2，表2。

注：A：HeLa細(xì)胞對照組；B：HeLa細(xì)胞PE干預(yù)組

3.3 PE對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響與皮下移植瘤模型組比較，PE干預(yù)組荷瘤裸鼠腫瘤體積明顯變小(P<0.01)，腫瘤質(zhì)量明顯降低(P<0.01)，提示PE對宮頸癌小鼠具有顯著的抑瘤作用。見圖3，表3。

表3 PE對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

注：A：皮下移植瘤模型組小鼠；B：PE干預(yù)組小鼠；C：皮下移植瘤模型組與PE干預(yù)組小鼠腫瘤大小

3.4 PE對荷瘤小鼠腫瘤組織中FAK蛋白表達(dá)水平的影響與正常對照組比較，皮下移植瘤模型組小鼠FAK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，p-FAK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；而PE干預(yù)組FAK蛋白及p-FAK蛋白的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。與皮下移植瘤模型組比較，PE干預(yù)組FAK蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，p-FAK蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明，PE促進(jìn)FAK蛋白的磷酸化。見圖4。

注：A：正常對照組；B：皮下移植瘤模型組；C：PE干預(yù)組；與正常對照組比較，*P<0.05；與皮下移植瘤模型組比較，#P<0.05

3.5 PE對荷瘤小鼠腫瘤組織中ciRS-7mRNA、miR-7mRNA表達(dá)的影響與正常對照組比較，皮下移植瘤模型組ciRS-7mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-7mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；PE干預(yù)組ciRS-7mRNA、miR-7mRNA的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)。與皮下移植瘤模型組比較，PE干預(yù)組ciRS-7mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-7mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 PE對荷瘤小鼠腫瘤組織ciRS-7 mRNA、miR-7 mRNA表達(dá)的影響

4 討論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，宮頸癌診療水平大幅提高，但發(fā)病率仍居高不下，給女性的生命健康造成了嚴(yán)重威脅[13]。宮頸癌的臨床治療主要是以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，然而，由于藥物的毒性作用以及腫瘤細(xì)胞的耐藥性導(dǎo)致治療效果產(chǎn)生了極大限制[14-15]，因此，需要探尋新的藥物治療手段。

掌葉半夏又名虎掌南星，具有定驚祛風(fēng)、化痰散結(jié)的功效。研究表明，掌葉半夏浸出液可使HeLa宮頸癌細(xì)胞凝縮成團塊，失去正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)；還可導(dǎo)致部分細(xì)胞脫落，對宮頸癌有明顯的抑制作用[16-17]；由掌葉半夏等中藥制成的薄膜對宮頸癌前病變同樣具有一定的阻斷作用[18]。PE可以通過抑制ERK磷酸化及B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)及病毒癌基因E6的表達(dá)，上調(diào)抑癌基因P53的表達(dá)等抑制宮頸癌細(xì)胞株Cski和HeLa的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19-20]。本研究顯示，PE的干預(yù)可顯著降低HeLa細(xì)胞侵襲及遷移數(shù)目，與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果相符。

研究顯示，抑癌因子miR-7在人宮頸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常宮頸組織[21]；ciRS-7具有miR-7的海綿樣吸附作用，可抑制miR-7 的功能，在人宮頸癌組織中的表達(dá)高于正常宮頸組織[22-23]。ciRS-7/miR-7軸不僅具有重要的生物學(xué)作用，同時參與機體多種疾病的發(fā)生發(fā)展。FAK是一種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白酪氨酸激酶，參與胞內(nèi)多條信號通路的傳導(dǎo)[24]。有關(guān)研究顯示，ciRS-7包含了miR-7，ciRS-7能提高miR-7靶基因表達(dá)，miR-7通過靶定FAK來抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移[25]。FAK在多種類型的腫瘤細(xì)胞中都出現(xiàn)表達(dá)量和活性上調(diào)現(xiàn)象，通過激酶依賴和非激酶依賴機制參與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、生長和抗凋亡等多個過程[26-27]。YUAN等[28]通過分析人乳腺癌的病例，發(fā)現(xiàn)FAK表達(dá)隨乳腺癌惡性程度增高而增加。在本研究結(jié)果中，PE提高FAK蛋白的磷酸化，而降低FAK蛋白的表達(dá)，可能是因為PE抑制miR-7mRNA的表達(dá)水平，增加ciRS-7mRNA的表達(dá)，從而降低了下游FAK蛋白的表達(dá)量。推測，PE可能通過調(diào)節(jié)ciRS-7/miR-7/FAK通路抑制宮頸癌荷瘤小鼠腫瘤組織的生長。

綜上所述，PE可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲和遷移，抑制腫瘤細(xì)胞的生長，其作用機制可能與調(diào)控ciRS-7/miR-7/FAK信號通路有關(guān)。