許朋俐，劉田田

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 2.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046； 3.河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是慢性纖維化性間質(zhì)性肺炎的一種特殊類型[1]，中醫(yī)將其歸于“肺痹”“肺痿”的病癥范疇[2]。李建生教授將其病機(jī)概括為“正虛絡(luò)痹積損”[3]，并據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)擬定了金水緩纖方(ZL.201610877761.4)[4]。課題組在金水緩纖方的基礎(chǔ)上，通過(guò)系統(tǒng)藥理學(xué)結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選出成分清楚、與原方療效相當(dāng)?shù)慕鹚徖w組分方Ⅰ(ZL.201811415482.1)，并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)配比優(yōu)化篩選出了療效明顯、組分明確的金水緩纖組分方Ⅱ(effective-component compatibility of Jinshui Huanxian formula Ⅱ，ECC-JHF Ⅱ)，即淫羊藿苷、川陳皮素、貝母素甲、芍藥苷、異甘草素(比例為10026.256.258)[5]。

特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是其發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制之一[6]。課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明，金水緩纖方及其組分方能有效改善肺纖維化，緩解上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7-8]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子1(snail family zinc finger 1,Snai1)作為EMT的“主轉(zhuǎn)錄因子”，能通過(guò)抑制E-鈣粘蛋白(E-cadherin)等上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)，激活N-鈣粘蛋白(N-cadherin)等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生[9]。組蛋白賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶SET結(jié)構(gòu)域分支型1(SET domain，bifurcated 1，SETDB1)，也稱為ESET或KMT1E，是一種對(duì)組蛋白H3第9位賴氨酸甲基化修飾的特異性甲基轉(zhuǎn)移酶，參與常染色質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄沉默。在一項(xiàng)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SETDB1通過(guò)對(duì)組蛋白的甲基化修飾，打破組蛋白甲基化和乙?；钠胶?，抑制Snail1基因表達(dá)[10]?；诖?，本研究在細(xì)胞水平探討金水緩纖組分方Ⅱ調(diào)控SETDB1及Snai1對(duì)EMT的表觀抑制作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549，細(xì)胞目錄號(hào)：TCHu150)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑川陳皮素(nobiletin，NBN)、異甘草素(isoliquiritigenin，ISO)、芍藥苷(paeoniflorin，Paeo)、淫羊藿苷(icariin，ICA)和貝母素甲(verticine，PEI)(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-16070901、MUST-17012503、MUST-16041901、MUST-17051810、MUST-16031101)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1，美國(guó)PeproTech公司，貨號(hào)：100-21C-10)；吡非尼酮(pirfenidone，PFD，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：P2116)；羅斯威爾公園紀(jì)念研究所(roswell park memorial institute,RPMI)-1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)-胰蛋白酶消化液、特級(jí)胎牛血清(以色列Biological Industries公司，貨號(hào)：01-100-1ACS、02-024-1ACS、03-050-1ACS、04-001-1ACS)；青霉素-鏈霉素溶液(武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)：PB1801220)；Lipofectamine 3000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、BCA蛋白定量試劑盒(賽默飛世爾公司，貨號(hào)：L3000015、A53225)；聚丙烯酰胺凝膠電脈(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司，貨號(hào)：PG112)；抗GAPDH、纖維連接蛋白(fibronection,FN1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、N-cadherin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：60004-1-IG、15613-1-AP、14395-1-AP、22018-1-AP)；抗E-cadherin抗體(美國(guó)GeneTex公司，貨號(hào)：GTX100443)；抗波形蛋白(Vimentin)抗體(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab92547)；抗SETDB1、組蛋白H3第9位點(diǎn)賴氨酸三甲基化(histone He lysine 9 trimethylation,H3K9me3)抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：93212S、13969S)；抗Snai1抗體(美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)：19099-1-AP)；重組蛋白A(美國(guó)Millipore公司，貨號(hào)：IP05)；靶向setdb1的小干擾RNA(siRNA-setdb1，基因序列：F：5′-GAUCUAUCGAGGCUCUACA-3′；R：5′-UGUAGAGCGAUGUC-3′)委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.3 儀器TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；3131型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；1658001型基礎(chǔ)電泳儀電源、1703930型小垂直板電泳槽、1645050型小型轉(zhuǎn)印槽、ChemiDoc MP型全能型成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，將其置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，每?jī)商爝M(jìn)行一次換液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)皿底面積的90%左右時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代處理，以保證細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)。

2.2 藥物制備及給藥按比例稱量NBN、ISO、Paeo、ICA和PEI并溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液，配成濃度為61.25 g·L-1的母液，過(guò)濾除菌后放-20 ℃冰箱備用；用含5% BSA的PBS將TGF-β1溶解至10 mg·L-1，放-80 ℃?zhèn)溆?；PFD用DMSO配成0.4 g·L-1的溶液，放 -80 ℃ 備用。使用時(shí)用RPMI-1640完全培養(yǎng)基將以上藥物稀釋至工作濃度，加至細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

2.3 A549細(xì)胞活力的檢測(cè)將生長(zhǎng)狀態(tài)較好的A549細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。放入37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待其生長(zhǎng)密度約為70%時(shí)，加入不同濃度(0 mg·L-1、3.83 mg·L-1、7.66 mg·L-1、15.31 mg·L-1、30.63 mg·L-1、61.25 mg·L-1、122.50 mg·L-1)的ECC-JHF Ⅱ培養(yǎng)48 h；每孔加10 μL CCK8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡，以防影響酶標(biāo)儀讀數(shù))，于 37 ℃ 恒溫箱孵育1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值。

2.4 Western Blot檢測(cè)A549細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平將生長(zhǎng)狀態(tài)較好的A549細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，放入37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待其生長(zhǎng)密度約為70%時(shí)，將細(xì)胞分為空白組、TGF-β1組、ECC-JHF Ⅱ組和PFD組，空白組和TGF-β1組加入2 mL含2 μL DMSO的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，ECC-JHF Ⅱ和PFD組分別加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基，作用12 h后，除空白組外，各組加入5 μg·L-1TGF-β1誘導(dǎo)12 h、24 h或36 h后，用RIPA蛋白裂解液提取蛋白，在冰上裂解30 min后，12 000×g、4 ℃離心15 min。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液，將其調(diào)整至相同蛋白濃度，100 ℃煮沸5 min。凝膠電泳將其分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，孵育一抗(E-cadherin、N-cadherin、GAPDH稀釋比例為15 000；FN1、α-SMA稀釋比例為 12 000；Vimentin稀釋比例為12 500；Snai1稀釋比例為1500；SETDB1、H3K9me3稀釋比例為11 000)，4 ℃過(guò)夜。次日取出蛋白條帶，TBST洗4次，每次10 min，室溫孵育二抗(稀釋比例為15 000)2 h。經(jīng)過(guò)化學(xué)發(fā)光法顯影，用Image J軟件測(cè)量灰度值后分析各組差異性。

2.5 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)將狀態(tài)較好的A549細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度達(dá)到60%后分別轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和siRNA-setdb1，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和siRNA-setdb1的細(xì)胞分別培養(yǎng)6 h后加入ECC-JHF Ⅱ預(yù)處理12 h，TGF-β1誘導(dǎo)24 h后記為Nc+ECC-JHF Ⅱ組和si-setdb1+ECC-JHF Ⅱ組。未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別記為NC組和si-setdb1組。提取蛋白，用Western Blot方法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。

2.6 染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技術(shù)檢測(cè)ECC-JHF Ⅱ?qū)nai1基因啟動(dòng)子上H3K9me3水平的影響將狀態(tài)較好的A549細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為空白組、TGF-β1組和ECC-JHF Ⅱ組，放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，ECC-JHF Ⅱ組給予ECC-JHF Ⅱ預(yù)處理12 h之后采用TGF-β1處理24 h；TGF-β1組給予TGF-β1處理24 h。通過(guò)甲醛交聯(lián)與超聲破碎細(xì)胞獲取樣本，加入與瓊脂糖共價(jià)結(jié)合的重組蛋白A、H3K9me3抗體、IgG抗體，4 ℃ 過(guò)夜。次日加入與瓊脂糖共價(jià)結(jié)合的重組蛋白A進(jìn)行免疫復(fù)合物沉淀后，進(jìn)行解交聯(lián)并回收DNA，通過(guò)qPCR測(cè)定目的基因含量。

3 結(jié)果

3.1 ECC-JHF Ⅱ?qū)549細(xì)胞活力的影響CCK8結(jié)果顯示，與0 mg·L-1ECC-JHF Ⅱ組比較，122.5 mg·L-1ECC-JHF Ⅱ組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)；3.83～61.25 mg·L-1ECC-JHF Ⅱ組細(xì)胞活力無(wú)顯著變化(P>0.05)，可選用該濃度范圍內(nèi)的ECC-JHF Ⅱ進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 ECC-JHF Ⅱ?qū)549細(xì)胞活力的影響

3.2 ECC-JHF Ⅱ濃度篩選與空白組相比，TGF-β1 組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，N-cadherin、FN1、Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)；與TGF-β1組相比，61.25 mg·L-1ECC-JHF Ⅱ組及PFD組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，N-cadherin、FN1、Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)ECC-JHF Ⅱ的使用濃度為 61.25 mg·L-1。見圖1，表2。

注：n=3；a:FN1、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達(dá)圖；b:Vimentin、α-SMA的蛋白表達(dá)圖；A：空白組；B：TGF-β1組；C：30.63 mg·L-1 ECC-JHF Ⅱ組；D：61.25 mg·L-1 ECC-JHF Ⅱ組；E：91.88 mg·L-1 ECC-JHF Ⅱ組；F：PFD組

表2 不同濃度ECC-JHF Ⅱ?qū)N1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表達(dá)的影響

3.3 ECC-JHF Ⅱ有效改善EMT相關(guān)蛋白及SETDB1、H3K9me3蛋白表達(dá)水平與空白組相比，TGF-β1組E-cadherin、SETDB1和H3K9me3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，F(xiàn)N1、α-SMA、N-cadherin、Vimentin、Snai1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與TGF-β1組相比，ECC-JHF Ⅱ組和PFD組SETDB1、H3K9me3和E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，F(xiàn)N1、α-SMA、N-cadherin、Vimentin、Snai1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖2，表3-表4。

表3 ECC-JHF Ⅱ?qū)N1、α-SMA、Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

注：a:FN1、α-SMA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)圖；b:Snail、H3K9me3、SETDB1的蛋白表達(dá)圖；n=3；A：空白組；B：TGF-β1組；C：ECC-JHF Ⅱ組；D：PFD組

表4 ECC-JHF Ⅱ?qū)nai1、E-cadherin、SETDB1、H3K9me3蛋白表達(dá)的影響

3.4 不同時(shí)間作用下ECC-JHF Ⅱ?qū)GF-β1誘導(dǎo)的EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與空白組相比，12 h TGF-β1組、24 h TGF-β1組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，Snail、FN1、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；36 h TGF-β1組SETDB1、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，F(xiàn)N1、Snai1、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。與12 h TGF-β1組相比，12 h TGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，F(xiàn)N1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與24 h TGF-β1組相比，24 h TGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，Snai1、FN1、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與36 h TGF-β1組相比，36 h TGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，Snai1、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖3，表5。

表5 不同時(shí)間作用下ECC-JHF Ⅱ?qū)MT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：a:SETDB1、H3K9me3、Snail的蛋白表達(dá)圖；b:FN1、N-cadherin、E-cadherin、的蛋白表達(dá)圖；n=3；A：空白組；B：12 hTGF-β1組；C：12 hTGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組；D：24 hTGF-β1組；E：24 hTGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組；F：36 hTGF-β1組；G：36 hTGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組

3.5 ECC-JHF Ⅱ改善TGF-β1誘導(dǎo)的Snai1啟動(dòng)子上H3K9me3表達(dá)下調(diào)與空白組相比，TGF-β1 組Snai1啟動(dòng)子上H3K9me3表達(dá)減少(P<0.05)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+ECC-JHF Ⅱ組Snai1啟動(dòng)子上H3K9me3表達(dá)增加(P<0.01)。見圖4。

注：n=3；與空白組比較，1)P<0.05；與TGF-β1組比較，4)P<0.01

3.6 siRNA敲低SETDB1抑制ECC-JHF Ⅱ?qū)MT相關(guān)蛋白的改善作用與空白組相比，TGF-β1組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，F(xiàn)N1、N-cadherin、Snai1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與TGF-β1組相比，ECC-JHF Ⅱ組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，F(xiàn)N1、N-cadherin、Snai1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與Nc組相比，si-setdb1組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，Snai1、FN1、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；與Nc+ECC-JHF Ⅱ組相比，si-setdb1+ECC-JHF Ⅱ組SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，Snai1、FN1、N-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。見圖5，表6。

注：n=3；A：空白組；B：TGF-β1組；C：Nc組；D：si-setdb1組；E：ECC-JHF Ⅱ組；F：Nc+ECC-JHF Ⅱ組；G：si-setdb1+ECC-JHF Ⅱ組

表6 si-setdb1抑制ECC-JHF Ⅱ?qū)MT相關(guān)蛋白表達(dá)的改善作用

4 討論

近年來(lái)，特發(fā)性肺纖維化發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[11]。但目前治療策略十分有限，臨床推薦藥物吡非尼酮和尼達(dá)尼布也只能起到延緩肺纖維化進(jìn)展的作用，無(wú)法阻止甚或逆轉(zhuǎn)其病理進(jìn)程[12-13]。肺移植手術(shù)是其有效的治療手段，但存在肺源不足及費(fèi)用昂貴等問(wèn)題。由此，亟需加強(qiáng)本病的防治研究。

肺纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，EMT是其關(guān)鍵病理機(jī)制之一。肺纖維化發(fā)生后，肺內(nèi)有大量肺纖維化細(xì)胞灶形成[12]。肺纖維化灶主要由成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞組成，它們分泌的大量膠原成為異常沉積的細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化中約有1/3的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞都經(jīng)EMT形成[14]。EMT發(fā)生后，細(xì)胞骨架重排，上皮細(xì)胞由卵圓形變?yōu)槌砷L(zhǎng)梭狀，E-鈣粘蛋白等上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)下調(diào)，N-鈣粘蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖維連接蛋白等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)增加[15]。

TGF-β1是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的重要因子。在肺泡上皮細(xì)胞受到損傷后，機(jī)體為進(jìn)行損傷修復(fù)而產(chǎn)生大量的致纖維化細(xì)胞因子，如TGF-β等。TGF-β與TGF-β Ⅱ型受體(TGF-βRⅡ)結(jié)合，募集并誘導(dǎo)Ⅰ型受體C端磷酸化，從而激活Smads，激活的Smad2/Smad3與受體分離后，與Smad4形成三聚體，并作為轉(zhuǎn)錄因子移位到細(xì)胞核內(nèi)[16-17]。Smad3/4復(fù)合物響應(yīng)TGF-β，靶向Snai1序列，激活Snai1的表達(dá)[18]。Snai1通過(guò)與Smad3/4協(xié)同作用，抑制E-cadherin等上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)，激活N-cadherin等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)[19-20]。

表觀遺傳學(xué)修飾是指在不改變基因堿基序列的情況下，通過(guò)DNA或組蛋白的甲基化和乙?；纫鹂蛇z傳的基因功能改變，進(jìn)而引起細(xì)胞表型變化[21]。目前關(guān)于肺纖維化發(fā)病過(guò)程中表觀遺傳調(diào)控作用的研究甚少。已有研究表明，抗纖維化基因的超甲基化和促纖維化基因的低甲基化是導(dǎo)致成纖維細(xì)胞大量生成和肺瘢痕形成的原因[22-23]。在EMT過(guò)程中，基因表達(dá)的重編程伴隨著組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)變化[24]。關(guān)于信號(hào)通路中相關(guān)因子的表觀遺傳學(xué)變化，特別是在EMT發(fā)生時(shí)如何控制EMT驅(qū)動(dòng)基因的組蛋白修飾，研究較少。SETDB1作為轉(zhuǎn)移抑制因子，可通過(guò)與Smad2/3形成阻遏復(fù)合物抑制肺癌轉(zhuǎn)移，其在高度轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞中受到強(qiáng)烈抑制，恢復(fù)SETDB1的表達(dá)則抑制了絲狀偽足的形成、遷移和侵入[25]。此外，SETDB1可以抑制乳腺上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程[10]。課題組前期研究顯示，SETDB1通過(guò)H3K9me3的表觀修飾可以直接調(diào)節(jié)Snai1的表達(dá)，驅(qū)動(dòng)EMT基因重編程；TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞通過(guò)減弱SETDB1的表達(dá)以促進(jìn)EMT的發(fā)生[26]。

中醫(yī)藥在肺纖維化的防治上有明顯優(yōu)勢(shì)，中醫(yī)認(rèn)為肺纖維化常見虛實(shí)夾雜或本虛標(biāo)實(shí)之證，治療以扶正祛邪為要。黃云鑒等通過(guò)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化的治療以養(yǎng)肺化痰、益氣養(yǎng)陰、養(yǎng)肺清熱和活血通絡(luò)為主，使用清熱、活血、益氣類中藥的頻率較高[27]。中醫(yī)治療肺纖維化在臨床實(shí)踐中有許多有效方劑，如孔祥文[28]用血府逐瘀湯和丹參飲合二陳湯加減治療痰瘀互結(jié)型肺纖維化，以補(bǔ)肺湯及平喘固本湯加減治療肺纖維化后期肺腎氣虛證。臨床觀察顯示益氣活血固本方治療氣虛血瘀型肺纖維化臨床有效，能改善臨床癥狀并緩解肺功能下降[29]；益氣祛痰化瘀湯聯(lián)合西醫(yī)治療能減輕IPF氣虛兼痰瘀阻肺型患者胸悶、咳嗽、氣短等主要癥狀，改善肺功能[30]；“氣陰兩補(bǔ)”法治療肺纖維化臨床效果較好，能有效降低炎癥因子水平，改善患者肺功能[31]。

李建生教授基于肺纖維化“正虛絡(luò)痹積損”病機(jī)，以補(bǔ)益肺腎、活血化痰為主要治法，擬定了金水緩纖方，該方能明顯提高患者生存質(zhì)量，減緩疾病進(jìn)展。課題組在此基礎(chǔ)上通過(guò)組分優(yōu)化配伍獲得了與之療效相當(dāng)?shù)慕鹚徖w組分方Ⅱ[5]。金水緩纖組分方Ⅱ能有效改善肺纖維化并減輕上皮細(xì)胞間質(zhì)化[5]；并可通過(guò)激活mTOR和自噬，抑制巨噬細(xì)胞的極化，從而減緩博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[32]。金水緩纖組分方Ⅱ中的單體成分具有抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、成纖維細(xì)胞活化及抗氧化作用。其中，淫羊藿苷可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞EMT，從而抑制氣道重塑[33]。川陳皮素抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT，抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移并抑制Snai1的表達(dá)[34]。異甘草素通過(guò)激活Nrf2的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用[35]，還可通過(guò)激活MRC-5細(xì)胞的自噬作用，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化[36]。貝母素甲具有抗炎、抗癌、治療急性肺損傷的作用[37]；芍藥苷可通過(guò)增加E-cadherin表達(dá)，降低Snai1和α-SMA的表達(dá)，抑制TGF-β1引起的A549細(xì)胞EMT[38]，并可減輕博來(lái)霉素引起的小鼠肺纖維化[39]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，金水緩纖組分方Ⅱ可通過(guò)增加SETDB1的表達(dá)，上調(diào)Snai1啟動(dòng)子上的H3K9me3水平，抑制Snai1及N-鈣粘蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)、促進(jìn)E-鈣粘蛋白的表達(dá)，從而緩解EMT。為驗(yàn)證SETDB1在其中是否起關(guān)鍵作用，用siRNA沉默SETDB1基因的表達(dá)，觀察金水緩纖組分方Ⅱ?qū)MT的抑制作用是否受到影響。結(jié)果顯示，敲低SETDB1表達(dá)后，金水緩纖組分方Ⅱ緩解TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用受到抑制，這表明SETDB1對(duì)Snai1的表觀調(diào)控作用在金水緩纖組分方Ⅱ抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT的過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。本研究為從細(xì)胞層面進(jìn)一步闡釋金水緩纖組分方Ⅱ治療肺纖維化的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上，金水緩纖組分方Ⅱ可通過(guò)調(diào)控SETDB1/Snai1表現(xiàn)抑制A549細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究從表觀遺傳學(xué)角度闡釋了金水緩纖組分方Ⅱ通過(guò)組蛋白甲基化修飾抑制Snai1表達(dá)，進(jìn)而抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制。由于研究中使用的A549細(xì)胞不能完全代表正常的人肺泡上皮細(xì)胞，后續(xù)研究可在其他細(xì)胞系或基因敲除小鼠中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。