李二穩(wěn)，高改，王夢瑤，吳麗敏，謝治深，張振強(qiáng)，王輝，徐江雁

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為主要表現(xiàn)，但無過量飲酒史的臨床病理綜合征[1-2]，其疾病譜包括脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌[3]。NAFLD是全球最流行的慢性肝病之一，世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為25.24%[4]，也是我國肝功能異常的首要因素，在我國發(fā)病率逐年上升，并且呈低齡化趨勢[5]。目前，NAFLD的發(fā)病機(jī)制沒有明確定論，多數(shù)學(xué)者認(rèn)同“二次打擊”及“多重打擊”學(xué)說，認(rèn)為該病與脂代謝紊亂、肥胖、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等因素有關(guān)[6]。高脂血癥是指機(jī)體中脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，血液中的一種或多種脂質(zhì)成分含量發(fā)生異常的疾病[7]，脂質(zhì)在肝臟中過多堆積，則引發(fā)脂肪肝。因此，高脂血癥是誘發(fā)NAFLD的主要因素[8]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，肝細(xì)胞和肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的鐵死亡可能會(huì)促進(jìn)單純性脂肪肝變性向非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)發(fā)展[9]，因此，抑制鐵死亡可能是NAFLD的一種潛在治療手段。

中醫(yī)學(xué)雖然沒有明確記載非酒精性脂肪性肝病名，但對其病因病機(jī)及臨床特征有所記載。中醫(yī)根據(jù)NAFLD的臨床特征將其歸屬于“痰濁”“積聚”“肥氣”“脅痛”等范疇，認(rèn)為NAFLD的病機(jī)以脾胃失衡、運(yùn)化失司導(dǎo)致痰濁凝滯于肝脈為主。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者常見痰濕體質(zhì)。因此，脾胃虛損、內(nèi)生痰濁是導(dǎo)致NAFLD的主要原因之一[10-11]。澤瀉湯出自《金匱要略》，具有健脾制水、利水除飲的功效。方中澤瀉利水滲濕、瀉熱化濁降脂，白術(shù)健脾益氣、利水燥濕，二者合用能補(bǔ)氣健脾利濕，與NAFLD脾胃虛損、痰瘀互結(jié)的中醫(yī)病機(jī)相吻合，具有非常重要的理論及臨床實(shí)用價(jià)值[12]，且與已有的臨床報(bào)道一致[13-14]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，澤瀉湯可通過激活肝臟激活酶B1/腺苷酸激活蛋白激酶/過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(liver kinase B1/adenosine monophosphate-activated protein kinase/peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，LKB1/AMPK/PGC-1α)通路改善NAFLD[15]，白術(shù)能激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor2，Nrf2)改善氧化應(yīng)激[16]。基于此，本文擬基于Nrf2探討澤瀉湯抑制肝細(xì)胞鐵死亡改善NAFLD的作用機(jī)制，以期為澤瀉湯改善NAFLD提供更多的科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞與質(zhì)粒50只SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2019-0003。小鼠飼養(yǎng)在溫度(22±5) ℃，濕度(55±5)%，光照/黑暗周期為12 h/12 h的環(huán)境中，可自由攝食和飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均獲得河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號：DWLL201903085)。人肝癌細(xì)胞(human hepatoma，Huh-7)、人胚腎細(xì)胞(HEK-293T)(武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：CL-0120、CL-0005)接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)質(zhì)粒(美國 Promega公司，貨號：177775)。

1.2 藥物與試劑澤瀉(安徽金芙蓉中藥飲片有限公司，批號：01-20020101)；白術(shù)(浙江方藥制藥有限公司，批號：YPX2011021X)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)付鈺副教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientalis(Sam.)Juzep.的干燥塊莖和菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖。DMEM培養(yǎng)基(美國Corning公司，貨號：10013061)；胰酶、青鏈霉素混合液、5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液、高效放射性免疫沉淀法分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(組織/細(xì)胞)、噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)試劑、TriQuick Reagent總RNA提取試劑、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、核蛋白提取試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(北京索萊寶科技有限公司，貨號：T1320、P1400、P1040、R0010、M8180、R1100、PC0020、R0050、D8371)；胎牛血清(美國Gibco公司，貨號：42Q0682K)；特丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone，t-BHQ，美國MCE公司，貨號：HY-100489)；BeyoRTTMⅢ First Strand cDNA合成試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：D7180L)；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：01090300)；PolyJet體外轉(zhuǎn)染試劑(深圳恩科生物科技有限公司，貨號：61758)；熒光素酶報(bào)告基因試劑盒(美國Promega公司，貨號：0000312919)；小鼠Actin(C-2)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，貨號：sc-8432)；兔Nrf2單克隆抗體(英國Abcam公司，貨號：ab62352)；兔核纖層蛋白B1(Lamin B1)單克隆抗體(上海Abways公司，貨號：P20700)；兔谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)單克隆抗體(武漢ABclonal公司，貨號：A13309)；兔血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)單克隆抗體、兔鐵死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1)單克隆抗體、DAPI染液(武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：GB11104、GB11397、G1012)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(美國Proteintech公司，貨號：SA00001-2、SA00001-1)；ROS染液(德國SIGMA公司，批號：D7008)；還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)比色法測試盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，貨號：E-BC-K030-M)；丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒[硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法，南京建成生物工程研究所，貨號：A003-1-2]；線粒體超氧化物紅色熒光探針(中國Yeasen公司，貨號：40778ES50)；氯化鈉(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，CAS號：7647-14-5)；甲醇、異丙醇、乙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，CAS號：67-56-1、67-63-0、64-17-5)；引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 儀器LightCycler?96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；Eclipset S100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；Series Ⅱ Water Jackxet型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、5020型Arktik熱循環(huán)儀、1510型全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱(上海安競公司)；Microfuge 20R型冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司，離心半徑：8 cm)；PowerPacTMBasic小型垂直電泳儀、Chemidoc MP型凝膠成像系統(tǒng) (美國BIO-RAD公司)；FLUO star OPTIMA型多功能酶標(biāo)儀(德國BMG Labtech公司)。

2 方法

2.1 澤瀉湯提取物的制備按ZXT的藥材組成稱取澤瀉150 g及白術(shù)60 g，加入8倍量的水煎煮3次，每次2 h，過濾，合并三次濾液，減壓濃縮后冷凍干燥，得澤瀉湯水提粉末(得率37.33%)。使用前，將澤瀉湯水提粉末溶于1 mL DMSO中，配成質(zhì)量濃度為250 g·L-1(以提取物粉末計(jì))的ZXT貯備液，用0.22 μm濾膜過濾除菌，于-20 ℃保存。

2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為空白對照組、模型組及澤瀉湯低、中、高劑量組，每組10只。除空白對照組，其余各組均采用高脂飲食(high-fat diet，HFD，含60%脂肪和20%蛋白質(zhì))喂養(yǎng)建立NAFLD模型，正常組小鼠給予正常飼料喂養(yǎng)。模型建立的同時(shí)澤瀉湯低、中、高劑量組小鼠分別以1.3 g·kg-1、2.6 g·kg-1、5.2 g·kg-1的劑量(按生藥量計(jì))灌胃給予澤瀉湯提取物溶液[17]，空白對照組和模型組灌胃等體積(10 mL·kg-1)的0.5%羧甲基纖維素鈉，每天1次，連續(xù)9周。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為8×104mL-1，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，將其隨機(jī)分為空白組，澤瀉湯不同質(zhì)量濃度(0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1、1 g·L-1)組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。用完全培養(yǎng)基將ZXT溶液稀釋至所需濃度，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基100 μL，空白對照組加入完全培養(yǎng)基100 μL。培養(yǎng)24 h后，加入5 g·L-1的MTT 并孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，檢測490 nm處的光密度(optical density,OD)值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(正常組OD值-空白組OD值)×100%

2.4 細(xì)胞線粒體超氧化物水平的測定取對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105mL-1，接種于6孔板，每孔2 mL，隨機(jī)分為空白組、模型組、t-BHQ(陽性藥)組、澤瀉湯組(1 g·L-1)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)過夜后，空白組加入2 mL完全培養(yǎng)基，模型組加入2 mL含0.6 mmoL 油酸(oleic acid，OA)的完全培養(yǎng)基，t-BHQ組加入2 mL含0.6 mmoL OA和10 μmoL t-BHQ的完全培養(yǎng)基，澤瀉湯組加入2 mL含0.6 mmoL OA和1 g·L-1澤瀉湯水提物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，按照試劑盒說明書加入1 mL探針工作液，置于37 ℃避光孵育10 min，PBS清洗后加入DIPA復(fù)染細(xì)胞核，封片后進(jìn)行觀察。

2.5 免疫組化法檢測小鼠肝臟中 HO-1、GPX4、FSP1 的蛋白表達(dá)水平石蠟切片脫蠟脫水，切片置于檸檬酸中抗原修復(fù)，然后以PBS洗滌，再將切片放入3%過氧化氫避光孵育，之后用PBS洗滌3次，每次5 min，用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)室溫封閉30 min，甩掉封閉液之后滴加 HO-1、GPX4、FSP1一抗(稀釋比例1700)，4 ℃孵育過夜，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋比例15 000)，室溫孵育50 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，水沖洗，然后蘇木素復(fù)染細(xì)胞核 1 min 左右，水沖洗，切片脫水、封片后，使用顯微鏡鏡檢，采集圖像。

本著“遠(yuǎn)來都是客”和對“獨(dú)在異鄉(xiāng)為異客”的同情，不得不說，日常執(zhí)法中，我們可能對于異鄉(xiāng)人多少都會(huì)客氣些，也會(huì)更有耐心：出門在外，都不容易；咱們執(zhí)法工作更要將心比心，換位思考。

2.6 RT-PCR法檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平測定細(xì)胞處理方法如2.4所示。采用Trizol法提取細(xì)胞和小鼠肝臟總RNA，按照BeyoRTTMⅢ First Strand cDNA合成試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒說明書，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共10 μL，含cDNA 4 μL，SYBR Green Mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 加熱2 min；95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性 15 s；60 ℃ 退火1 min；72 ℃延伸30 s；共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 肝臟ROS水平測定肝臟冰凍切片復(fù)溫，加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，水沖洗，滴加ROS染液，37 ℃恒溫避光孵育30 min，PBS洗滌，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，避光室溫孵育10 min，脫水、封片，切片置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.8 小鼠肝臟MDA、GSH水平測定取一定質(zhì)量的肝臟，按照肝臟質(zhì)量與生理鹽水19的比例加入生理鹽水，勻漿，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.9Nrf2-ARE熒光素酶活性的測定取對數(shù)生長期的HEK-293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 4×105mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL，隨機(jī)分為空白組，t-BHQ(10 μmol·L-1)組，澤瀉湯不同質(zhì)量濃度(0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1、1 g·L-1)組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞長至80%時(shí)，使用PolyJet體外轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Nrf2-ARE質(zhì)粒，每孔加入100 ng質(zhì)粒，6 h后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 18 h，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基 100 μL，空白組加入完全培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h后，按照熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明書，棄去培養(yǎng)液，每孔加入報(bào)告基因裂解液100 μL，室溫震蕩 30 min，每孔吸取30 μL轉(zhuǎn)移至白色不透明96孔板，再加入熒光素酶檢測試劑，每孔50 μL，酶標(biāo)儀檢測熒光素酶化學(xué)發(fā)光值。

熒光素酶相對活性=給藥組化學(xué)發(fā)光值/對照組化學(xué)發(fā)光值

2.10 Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)量取對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105mL-1，接種于6孔板，每孔2 mL，隨機(jī)分為空白組，模型組，t-BHQ組，澤瀉湯不同質(zhì)量濃度(0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、1 g·L-1)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后，空白組加入2 mL完全培養(yǎng)基，模型組加入2 mL含0.6 mmoL OA的完全培養(yǎng)基，t-BHQ組加入2 mL含0.6 mmoL OA和10 μmoL t-BHQ的完全培養(yǎng)基，澤瀉湯不同質(zhì)量濃度組加入2 mL含0.6 mmoL OA和不同質(zhì)量濃度澤瀉湯水提物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，按照核蛋白提取試劑盒說明書，加入漿蛋白抽提試劑，冰上裂解10 min，4 ℃條件下15 000 r·min-1離心15 min，上清即為漿蛋白。向沉淀中加入核蛋白抽提試劑，冰上裂解 10 min，4 ℃條件下15 000 r·min-1離心15 min，上清即為核蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，變性蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dadecyl sulfate palyacrylaniongel electroptoreis,SDS-PAGE)后分離，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉，加入Nrf2、β-actin、Lamin B1一抗(稀釋比例11 000)，置于4 ℃過夜，用Tris緩沖鹽溶液+吐溫(tris-buffered saline with tween，TBST)洗滌4次，每次10 min，加入相對應(yīng)的二抗(稀釋比例110 000)，室溫振搖孵育2 h，TBST洗滌4次，每次10 min，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯影液，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光成像。使用Image J 1.8.0軟件對條帶的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以目的蛋白條帶和β-actin條帶的灰度值比值，作為胞漿目的蛋白的表達(dá)量；以目的蛋白條帶和Lamin B1條帶的灰度值比值，作為胞核目的蛋白的表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.2 ZXT改善OA誘導(dǎo)的Huh-7細(xì)胞鐵死亡OA是一種單不飽和脂肪酸，在體外引起脂質(zhì)蓄積，造成脂肪變性，是NAFLD常用的造模方法[20]。長鏈酯酰輔酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)是鐵死亡最關(guān)鍵的因子之一，催化合成CoA，用于合成鐵死亡需要的多不飽和脂肪酸，進(jìn)而促進(jìn)鐵死亡[21]。與空白組比較，模型組CoQ10mRNA水平顯著下降(P<0.001)，ACSL4mRNA水平顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，ZXT干預(yù)可顯著提高FSP1mRNA、CoQ10mRNA的水平(P<0.05)，顯著降低ACSL4mRNA的水平(P<0.001)。以上結(jié)果表明，ZXT可在體外抑制肝細(xì)胞鐵死亡。見圖2。

注：A：Huh-7細(xì)胞中FSP1 mRNA的表達(dá)水平；B：Huh-7細(xì)胞中CoQ10 mRNA的表達(dá)水平；C：Huh-7細(xì)胞中ACSL4 mRNA的表達(dá)水平；n=6；與空白組相比，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，###P<0.001

3.3 ZXT改善NAFLD小鼠肝臟氧化應(yīng)激脂質(zhì)過氧化是引起細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵因素，而MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝終產(chǎn)物，是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物之一，且氧化應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)GSH耗竭。與空白組比較，高脂飲食誘導(dǎo)后，模型組小鼠肝臟ROS、MDA水平顯著增加(P<0.001)，HO-1、GPX4、GSH的水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，ZXT可顯著降低ROS、MDA水平(P<0.05)，顯著升高 HO-1、GPX4、GSH的水平(P<0.001)。以上結(jié)果表明，ZXT能改善NALFD小鼠肝臟氧化應(yīng)激。見圖3。

注：A：肝臟ROS染色圖(×400)，n=3；B：肝臟HO-1、GPX4免疫組化圖(×400)，n=3；C：A的量化圖；D-E：B的量化圖；F-G：肝臟MDA、GSH含量，n=6；與空白組相比，*P<0.05,***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

3.4 ZXT改善OA誘導(dǎo)的Huh-7細(xì)胞氧化應(yīng)激與空白組比較，模型組線粒體MitoSOX水平顯著上調(diào)(P<0.001)；與模型組比較，ZXT干預(yù)后線粒體MitoSOX水平顯著下調(diào)(P<0.001)。結(jié)果表明，ZXT可在體外改善氧化應(yīng)激。見圖4。

注：A：Huh-7細(xì)胞線粒體超氧化物染色圖；B：A的量化圖，n=3；與空白組相比，***P<0.001；與模型組相比，###P<0.001；比例尺：200 μm

3.5 ZXT激活Nrf2并促進(jìn)其靶基因的表達(dá)為研究ZXT改善氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，使用熒光素酶報(bào)告基因法檢測ZXT對Nrf2-ARE熒光素酶活性的影響，Nrf2是核轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)入細(xì)胞核后會(huì)發(fā)揮抗氧化能力。與空白組比較，ZXT劑量依賴性提升Nrf2-ARE的轉(zhuǎn)錄活性。與空白組比較，模型組Nrf2mRNA的表達(dá)量顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，ZXT可顯著增加Nrf2及其下游抗氧化基因GPX4、GSS、UGT、GST的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，劑量依賴性上調(diào)Nrf2核蛋白表達(dá)量。以上結(jié)果表明，ZXT可在體外激活Nrf2改善氧化應(yīng)激。見圖5。

注：A：Huh-7細(xì)胞活力檢測，n=6；B：Nrf2-ARE熒光素酶活力檢測，n=6；C-H：Nrf2及其下游基因mRNA相對表達(dá)量檢測，n=6；I：Huh-7細(xì)胞胞漿及核Nrf2蛋白檢測，n=3；J-K：I圖的量化，n=3；與空白組相比，*P<0.05，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

3.6 ZXT促進(jìn)NAFLD小鼠肝臟Nrf2下游靶基因表達(dá)與空白組比較，模型組小鼠肝臟中HO-1mRNA、GPX4mRNA、GSSmRNA、GCLmRNA的相對表達(dá)量顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，給予ZXT治療后，小鼠肝臟中Nrf2下游靶基因HO-1mRNA、GPX4mRNA、GSSmRNA、GCLmRNA、UGTmRNA的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。以上結(jié)果表明，ZXT在體內(nèi)也可激活Nrf2改善氧化應(yīng)激。見圖6。

注：A-E：小鼠肝臟Nrf2下游基因mRNA相對表達(dá)量檢測；與空白組相比，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，###P<0.001

4 討論

鐵死亡是一種鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化物積聚造成的細(xì)胞死亡，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)鐵超載導(dǎo)致的ROS大量蓄積，細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并最終造成細(xì)胞死亡。近年來研究表明，脂質(zhì)過氧化、鐵超載、氧化應(yīng)激等均是NAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。鐵死亡細(xì)胞中的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物會(huì)促進(jìn)NASH的發(fā)生發(fā)展[22-24]。NASH模型小鼠中有鐵死亡發(fā)生，鐵死亡抑制劑治療后，小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積明顯減少[25]。因此，改善氧化應(yīng)激、抑制鐵死亡可能是治療NAFLD的治療策略之一。

澤瀉湯由白術(shù)、澤瀉兩味中藥組成，具有藥簡效佳的特點(diǎn)，方中澤瀉甘、淡、利水滲濕為君藥，白術(shù)甘、苦、健脾燥濕為臣藥，二者相須使用，共奏健脾利濕泄?jié)嶂А，F(xiàn)代研究表明，澤瀉湯具有降血脂、改善體內(nèi)代謝異常的作用[26-31]。

脾主運(yùn)化功能在機(jī)體脂質(zhì)代謝中具有重要作用。脾失健運(yùn)就會(huì)形成濕濁、痰凝，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂。而高脂血癥是誘發(fā)NAFLD的關(guān)鍵因素，痰濕脾困是高脂血癥發(fā)生的主要病機(jī)，臨床上常用健脾、燥濕、祛痰等方法進(jìn)行治療。在高脂飲食喂養(yǎng)或者OA誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)積聚大量的游離脂肪酸，脂代謝紊亂，脂質(zhì)過氧化加劇，導(dǎo)致鐵死亡發(fā)生，與中醫(yī)認(rèn)為脾主運(yùn)化水谷相吻合。因此，脂質(zhì)過氧化引起的肝細(xì)胞鐵死亡可能是痰濕脾困的現(xiàn)代分子學(xué)基礎(chǔ)之一。

鐵死亡具有獨(dú)特的生化特征，如胞內(nèi)鐵離子的積聚、ROS升高以及脂質(zhì)過氧化、GSH的耗竭、GPX4的減少等。GPX4是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子，可通過GSH減少脂質(zhì)的蓄積，繼而阻止鐵死亡的發(fā)生[32]。脂質(zhì)過氧化物的過度蓄積也是鐵死亡的一大特征[33]，MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，會(huì)影響脂肪酸的氧化分解，進(jìn)一步加劇肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)[34]。本研究結(jié)果顯示，ZXT可上調(diào)NAFLD小鼠肝臟FSP1、CoQ10、GPX4、GSH水平，降低MDA、ROS含量，還能逆轉(zhuǎn)OA誘導(dǎo)的Hun-7細(xì)胞中FSP1mRNA、CoQ10mRNA、GPX4mRNA水平的降低，促進(jìn)ACSL4mRNA表達(dá)，減少線粒體超氧化物含量，提示ZXT可抑制肝細(xì)胞鐵死亡。由此推測，澤瀉湯可通過改善氧化應(yīng)激抑制鐵死亡發(fā)生，進(jìn)而發(fā)揮改善NAFLD的作用。

正常情況下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1)結(jié)合，不能入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，一旦受到外界活性氧等刺激，Nrf2可從Keap1上解離出來，進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核啟動(dòng)原件ARE相結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，如HO-1、GPX4等，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用，減輕氧化損傷[35]，抑制鐵死亡[36]。目前認(rèn)為，Nrf2可能是治療代謝性疾病如肥胖、NAFLD、糖尿病等的關(guān)鍵潛在靶點(diǎn)[37-38]。本研究結(jié)果顯示，ZXT能顯著上調(diào)Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，升高Nrf2表達(dá)，提示ZXT可能通過激活Nrf2抗氧化抑制肝細(xì)胞鐵死亡。

綜上所述，ZXT可抑制肝細(xì)胞鐵死亡改善NAFLD，其作用可能與激活Nrf2通路有關(guān)。本研究為澤瀉湯改善NAFLD提供了新的思路和方法，但還需要進(jìn)行更深入的機(jī)制研究。