李天昊，趙學(xué)慧，宋 晨，委慧玲，齊玉梅，田常青，祁國(guó)軍，史文靜，茍惠天，薛慧文

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

李氏桿菌()可污染奶制品、肉制品、水產(chǎn)品以及即食食品等，是重要的食源性致病菌之一。目前常見(jiàn)的李氏桿菌共有7種，其中,產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌(，)是唯一能引起人類疾病的。當(dāng)攝入被產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌污染的食品后，孕婦、嬰幼兒及老人等免疫低下人群極易罹患李氏桿菌病，其致死率高達(dá)23.6%。由于缺乏完善的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的低溫生長(zhǎng)等特性，李氏桿菌病仍作為世界四大食源性疾病，給人畜帶來(lái)嚴(yán)重危害。

由于過(guò)度使用抗生素導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加和超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，有望將噬菌體視為可能的抗生素補(bǔ)充或替代品。噬菌體在治療細(xì)菌性感染方面，較抗生素其優(yōu)勢(shì)：嚴(yán)格的宿主特異性、增殖速度快、研發(fā)時(shí)間短、成本低、安全無(wú)污染等。基于以上特點(diǎn)，雖然國(guó)內(nèi)外已有將噬菌體用于疾病治療及食品生產(chǎn)加工方面的報(bào)道，但噬菌體的應(yīng)用也存在一些缺陷。由于噬菌體的高度特異性，單一的噬菌體或給藥途徑的治療方式，效果并不十分明顯。根據(jù)目前對(duì)其他噬菌體的研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體和抗生素聯(lián)用取得的效果比單一噬菌體或抗微生物藥物給藥所取得的治療效果更為顯著。

本試驗(yàn)主要利用實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌為宿主菌，使用雙層瓊脂平板法從屠宰污水樣品中分離出噬菌體，通過(guò)對(duì)其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、基因組學(xué)等方面進(jìn)行鑒定。旨在評(píng)價(jià)分離到的噬菌體在預(yù)防和治療產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌病過(guò)程中的效果以及應(yīng)用價(jià)值，為實(shí)驗(yàn)室后續(xù)建立產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌噬菌體庫(kù)和基于產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌噬菌體的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源 分別從甘肅省定西市、武威市某屠宰場(chǎng)，采集污水樣品，4 ℃保存。

1.1.2 菌株來(lái)源 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌、威爾斯李氏桿菌和英諾克李氏桿菌。

1.2 分離和純化

離心并過(guò)濾后的樣品進(jìn)行共孵育，37 ℃，震蕩培養(yǎng)24 h，分離時(shí)采用雙層瓊脂平板法，瓊脂比例為上層1.2%，下層0.5%。挑取單個(gè)噬菌斑，進(jìn)行雙瓊脂平板培養(yǎng)，重復(fù)5～6次，得到單一噬菌體。

1.3 濃縮和超離

噬菌體裂解液與宿主菌各100 μL混合，37 ℃，共孵育15 min后，加入100 mL TSB-YE培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r·min培養(yǎng)12 h，利用PEG8000沉淀法進(jìn)行沉淀。對(duì)噬菌體濃縮液進(jìn)行氯化銫密度梯度離心，進(jìn)一步提高效價(jià)以及純化噬菌體顆粒(噬菌斑的解離條件為4 ℃過(guò)夜解離，濃縮中加入PEG8000后冰浴4 h)。

1.4 效價(jià)的測(cè)定

噬菌體濃縮液進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋。選取合適的梯度進(jìn)行培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取平均值。噬菌體效價(jià)(滴度)的計(jì)算方法：

噬菌體效價(jià)(PFU·mL)=密度適當(dāng)平板上的噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.5 電鏡觀察

取5 μL超速離心后的噬菌體樣品滴加到300目銅網(wǎng)上吸附10 min。濾紙吸干噬菌體溶液，滴加5 μL的1 %磷鎢酸溶液復(fù)染2 min后，吸除染液。室溫晾干后，電鏡觀察。

1.6 生長(zhǎng)特性鑒定

1.6.1 宿主譜的測(cè)定 利用不同菌株與噬菌體LP8進(jìn)行混合孵育后，利用雙層瓊脂平板法計(jì)算噬菌體效價(jià)(PFU)，計(jì)算宿主菌與受試菌電鍍效率(EOP)，計(jì)算公式為EOP=受試菌平均PFU/宿主菌平均PFU。

1.6.2 溫度 設(shè)定25、35、45、55、65、75 ℃不同的溫度梯度，將噬菌體裂解液置于其中孵育30 min后進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)平板計(jì)數(shù)確定該噬菌體的最適溫度和失活溫度。

1.6.3 pH 將噬菌體液加入pH為2、4、6、7、8、10、12的SM緩沖液中，37 ℃孵育1 h，通過(guò)培養(yǎng)來(lái)確定該噬菌體的最適pH。

1.6.4 有機(jī)溶劑 在噬菌體液(1×10PFU·mL)中等體積加入異戊醇、丙三醇、甲醇、乙醇、氯仿和硫酸鎂緩沖液(SM緩沖液)。37 ℃作用30 min后，測(cè)定效價(jià)。

1.6.5 一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定 通過(guò)對(duì)噬菌體-宿主菌共培養(yǎng)液，不同時(shí)間點(diǎn)(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min)取混合物進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定噬菌體的效價(jià)，繪制一步生長(zhǎng)曲線，確定噬菌體的潛伏期等。

1.6.6 最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)測(cè)定 對(duì)細(xì)菌和噬菌體進(jìn)行定量，設(shè)置不同的感染比例(0.001、0.01、0.1、1、10、100)進(jìn)行共孵育，培養(yǎng)后計(jì)算出不同感染復(fù)數(shù)下的噬菌體效價(jià)(見(jiàn)“1.4”)，試驗(yàn)重復(fù) 3 次，并確定噬菌體的 MOI。

1.7 全基因組測(cè)序

利用Tris法對(duì)噬菌體超離液中的噬菌體顆粒進(jìn)行基因組提取。在所提取的基因組中加入DNase Ⅰ、RNase Ⅰ和綠豆核酸酶，對(duì)基因組進(jìn)行酶切、電泳，鑒定基因組類型。將成功提取的噬菌體基因組送至廣東惠通生物科技有限公司，采用Illumina測(cè)序技術(shù)完成噬菌體基因組掃描測(cè)序，構(gòu)建了Illumina PE文庫(kù)，對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后利用生物信息學(xué)分析手段完成噬菌體的全基因組組裝。利用基因組繪圖軟件Snap Gene繪制基因組圖，對(duì)其相應(yīng)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌噬菌體的分離

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌作為宿主菌，對(duì)采集的所有污水樣品利用雙瓊脂平板法進(jìn)行分離，分離出若干株噬菌體，選取一株性狀優(yōu)良、傳代穩(wěn)定的噬菌體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并命名為L(zhǎng)P8，宿主菌編號(hào)為ATCC19111(1/2a)，平板上可以觀察到明顯的噬菌斑，噬菌斑形狀規(guī)整，邊緣整齊，顏色透亮，直徑2 mm左右，純化傳代穩(wěn)定，無(wú)暈環(huán)(圖1)。

A.LP8分離純化平板；B.對(duì)照組。平板直徑為90 mm

2.2 噬菌體超離

利用氯化銫密度梯度離心法對(duì)LP8噬菌體濃縮液進(jìn)行超離，在密度為1.50～1.70 g·mL的氯化銫溶液梯度之間具有噬菌體層，吸取噬菌體超離液，通過(guò)效價(jià)核定，效價(jià)為4.4×10PFU·mL。

2.3 噬菌體電鏡觀察

利用透射電鏡對(duì)LP8樣品進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)LP8為肌尾科噬菌體，具有標(biāo)準(zhǔn)的20面體的頭部，還有一個(gè)由中空的針狀結(jié)構(gòu)和鞘組成的尾部，以及尾針組成的基部，噬菌體的頭部直徑約為80 nm；尾部長(zhǎng)度約為120 nm(圖2)。

白色箭頭表示噬菌體，比例尺為200 nm

2.4 LP8噬菌體效價(jià)的測(cè)定

對(duì)LP8噬菌體的裂解液、濃縮液、超離液進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，結(jié)果分別為1.76×10、2.67×10、4.4×10PFU·mL。

2.5 LP8噬菌體宿主譜鑒定

利用實(shí)驗(yàn)室所保存的產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌、威爾斯李氏桿菌和英諾克李氏桿菌對(duì)LP8噬菌體進(jìn)行宿主譜鑒定，結(jié)果顯示LP8噬菌體對(duì)18株LM都具有裂解性，對(duì)5株威爾斯李氏桿菌(C10、9-2、4-40、C59、4-43)具有裂解性，對(duì)22株英諾克李氏桿菌均無(wú)裂解性(表1)。

表1 LP8噬菌體宿主譜

2.6 LP8噬菌體生長(zhǎng)特性

對(duì)LP8設(shè)置不同的感染比例，測(cè)定出LP8的MOI為1(圖3A)；設(shè)置25、35、45、55、65、75 ℃溫度梯度，確定LP8的最適溫度為45 ℃(圖3B)；設(shè)置pH為2、4、6、7、8、10、12梯度，確定LP8的最適pH為7(圖3C)；采用的6種有機(jī)溶劑中，氯仿和異戊醇對(duì)LP8影響最大，可造成LP8全部失活，丙三醇和SM空白對(duì)照組沒(méi)有影響，甲醇和乙醇會(huì)導(dǎo)致噬菌體部分失活(圖3D)；繪制一步生長(zhǎng)曲線，確定LP8潛伏期為23 min，對(duì)數(shù)期為23～80 min，80 min以后達(dá)到平臺(tái)期，噬菌體效價(jià)最大可達(dá)到3.4×10PFU·mL(圖3E)。

A.最佳感染復(fù)數(shù)；B.溫度影響；C.pH影響；D.有機(jī)溶劑影響；E.一步生長(zhǎng)曲線

2.7 LP8基因組酶切鑒定

電泳條帶顯示，噬菌體LP8基因組在1、2號(hào)DNA酶泳道未出現(xiàn)條帶，在3、4號(hào)RNA泳道和5、6號(hào)綠豆核酸酶泳道都出現(xiàn)了條帶，根據(jù)條帶結(jié)果得出噬菌體基因組為雙鏈DNA(圖4)。

M.15000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.DNase I；3、4.RNase I；5、6.綠豆核酸酶

2.8 LP8基因組測(cè)序

經(jīng)測(cè)序，噬菌體LP8的基因組為87 038 bp，共有120個(gè)編碼基因，編碼基因的累加長(zhǎng)度為76 326 bp、編碼基因的平均長(zhǎng)度為636 bp、編碼區(qū)域長(zhǎng)度占基因組的比例為87.69%。通過(guò)SnapGene軟件對(duì)全基因組進(jìn)行繪圖，分析其基因的大小和分布情況。通過(guò)COG、KEGG、GO對(duì)LP8的基因進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)編碼基因參與原噬菌體合成；有20個(gè)編碼基因參與噬菌體有關(guān)的生物過(guò)程；11個(gè)編碼基因參與分子功能，如結(jié)合或催化；8個(gè)編碼基因參與噬菌體的合成，具體生物學(xué)通路最多的為嘌呤代謝和嘧啶代謝(圖5)。

圖5 LP8噬菌體基因組

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)從事產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌噬菌體的研究，多見(jiàn)于產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌噬菌體裂解酶、噬菌體蛋白對(duì)于李氏桿菌的快速檢測(cè)、產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌溶源性噬菌體的誘導(dǎo)與鑒定等。對(duì)于產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌裂解性噬菌體的分離鑒定及臨床應(yīng)用相關(guān)研究較少，而國(guó)外此方面研究相對(duì)較多，美國(guó)、加拿大和瑞士已使用LISTEXP100用以防治產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌所引起的食品安全問(wèn)題；LP8與國(guó)外LISTEXP100產(chǎn)品相比，具有作用時(shí)間短、作用溫度范圍廣、保存時(shí)效性長(zhǎng)等特點(diǎn)。LP8在25～45 ℃具有很高的活性，而且在55 ℃時(shí)，LP8噬菌體的效價(jià)仍能保持在2.1×10PFU·mL。

Song等測(cè)定3種LM噬菌體LP020、LP027、LP094的一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，這3種LM噬菌體的潛伏期都在45～60 min，LP8的潛伏期在23 min左右，80 min便達(dá)到平臺(tái)期，平臺(tái)期最高效價(jià)4種噬菌體都在1×10PFU·mL以上，具有相同效果，但LP8作用速度更快。Lee等從雞糞樣品中分離到的兩種LM噬菌體LMP1和LMP7對(duì)ATCC7644、ATCC15313、ATCC19114、ATCC19115四種LM具有裂解性。LP8除了對(duì)18株產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌具有裂解性外，對(duì)5株威爾斯李氏桿菌(9-2、4-40、C10、C59、4-43)也具有裂解性，說(shuō)明LP8具有跨種裂解性，且有較高的感染復(fù)數(shù)。綜上，LP8具有更好的生物制劑開(kāi)發(fā)前景。

本試驗(yàn)分離得到的噬菌體中，有30%的噬菌體會(huì)在純化階段不能穩(wěn)定傳代而丟失，表明丟失的噬菌體本身裂解能力并不強(qiáng)。司樨東提出，噬菌體在感染宿主菌的過(guò)程中，部分基因會(huì)整合到宿主菌的基因組中，在一定條件下并不會(huì)立即表達(dá)，裂解性噬菌體基因有成為溶原性噬菌體基因的可能性，也會(huì)影響噬菌體的表達(dá)。在本試驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)瓊脂的濃度較低時(shí)，噬菌斑會(huì)變大，顏色更透亮。究其原因，下層瓊脂一般為營(yíng)養(yǎng)瓊脂，較硬的質(zhì)地為上層瓊脂提供支持和營(yíng)養(yǎng)作用，上層瓊脂質(zhì)地較軟，噬菌體受到本身構(gòu)造限制，其穿行能力較弱，如果僅限于培養(yǎng)細(xì)菌涂布后干燥的平板表面條件，噬菌體對(duì)周圍的細(xì)菌沒(méi)有侵襲能力，很小的作用范圍并不支持形成肉眼可見(jiàn)的噬菌斑，而且噬菌斑能被肉眼觀察，是由于在噬菌斑內(nèi)沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，與周圍生長(zhǎng)有細(xì)菌的瓊脂形成色差導(dǎo)致。我們?cè)谄胀ü鈱W(xué)顯微鏡下觀察噬菌斑，發(fā)現(xiàn)噬菌斑相較于周圍瓊脂較低，形成一個(gè)略淺的凹陷，裂解挑斑發(fā)現(xiàn)噬菌斑本身具有一定厚度，與周圍正常瓊脂相比，厚度約減少1/5，可能是由于噬菌斑內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)菌被侵蝕死亡而造成的坍縮導(dǎo)致。

通過(guò)對(duì)LP8全基因組序列進(jìn)行對(duì)比，確定本試驗(yàn)所分離的噬菌體為李氏桿菌新噬菌體，噬菌體基因組編碼區(qū)占基因組大小的80%以上。所編碼的基因中，76個(gè)基因與沙門(mén)菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體、歐文菌噬菌體、檸檬酸桿菌噬菌體中的部分基因具有高度相似性，基因組序列單一覆蓋率最大7%，累計(jì)覆蓋率38.4%?；蚪M所編碼的120個(gè)基因與噬菌體基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因相似性都很低，其中44個(gè)基因功能未知，以上現(xiàn)象說(shuō)明LP8在進(jìn)化過(guò)程中可能經(jīng)歷了復(fù)雜的基因水平轉(zhuǎn)移、突變、重組等過(guò)程，也有可能是由其他噬菌體演化而來(lái)。

4 結(jié) 論

LP8相較于其他噬菌體，熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，酸堿耐受范圍更廣，對(duì)有機(jī)溶劑的抵抗性更高，對(duì)LM具有強(qiáng)裂解性，并且可以跨種裂解李氏桿菌。因此，LP8噬菌體在未來(lái)的噬菌體生物制劑的研發(fā)過(guò)程中，具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。