李 靜，程魯光，萬九生，陳 超，鄧衛(wèi)東，張正紅，張 志，黎立光

(1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，昆明 650201；2.公安部昆明警犬基地，昆明 650201；3.公安部警犬技術重點實驗室，昆明 650201)

昆明犬是我國自主培育的唯一的國產(chǎn)工作犬品種，由公安部昆明警犬基地培育，被國家畜禽品種認證為中國犬類的國家級畜禽新品種。昆明犬在治安防范、追蹤、搜毒搜爆等多個警用領域發(fā)揮著巨大作用，是中國最優(yōu)秀的工作犬品種之一。昆明犬源自于20世紀50年代的云南本地狼犬(主體為本地犬和當時軍警用德國牧羊犬的雜交后代)。經(jīng)過近70余年的群體繼代選育及基礎群建設，目前已經(jīng)形成種群數(shù)量穩(wěn)定及遺傳多樣性豐富的狼青、黑背、草黃3個品系的昆明犬群，現(xiàn)具有25個核心家系，遍布全國及東南亞、朝鮮、韓國、巴基斯坦等國家。我國廣泛使用的工作犬品種還有源于歐洲的引進品種馬里努阿犬和德國牧羊犬。馬里努阿犬(簡稱馬犬)是將進口馬利諾斯犬(MALINOIS)的遺傳特性進行改良，選育出符合中國氣候環(huán)境、警用性能優(yōu)越的中系馬里努阿犬，其目前具有18個核心家系。德國牧羊犬也是廣泛使用的傳統(tǒng)軍警用犬，因其遺傳和警用性能穩(wěn)定而享譽世界。根據(jù)警用工作犬體型外貌、警用性能評定辦法劃分為普通家系和特異性家系。其中警用性能主要有膽量、興奮性、占有性、跟隨性等行為性狀。由于近年來逐漸重視對國產(chǎn)工作犬品種的保種與遺傳資源開發(fā)，因此利用基因組信息挖掘中國昆明犬與德國牧羊犬、馬犬等引進品種的遺傳關系及背景至關重要。

另外，由于家犬是人類親密的伙伴之一，利用它們的認知和行為能力的差別，家犬被選擇去完成各種各樣的任務，如軍警用、導盲、狩獵、放牧和陪伴犬，家犬的進化也經(jīng)歷了育種遺傳多樣性瓶頸效應，但目前大部分研究集中在控制體型、身高和被毛變化的基因上，在警用工作犬品種人工選擇中行為性狀變化的遺傳機制研究較少?；蛐酒捎谄鋬r格實惠、高效便捷的特性而在動物遺傳育種中廣泛使用，Illumina CanineHD Beadchip芯片技術特有高度多態(tài)性SNPs，為品系內(nèi)關聯(lián)和拷貝數(shù)變異(CNV)研究提供了充足的SNP密度，具有均勻的基因組覆蓋，可實現(xiàn)任何家犬品種遺傳變異的檢測。

本研究利用Illumina CanineHD Beadchip芯片對昆明犬、馬里努阿犬、德國牧羊犬共計24頭3個品種進行分析獲得數(shù)據(jù)，并利用主成分(PCA)、STRUCTURE和鄰接(NJ)樹分析方法檢測昆明犬的遺傳群體結(jié)構，同時在基因組水平上充分挖掘昆明犬品種形成過程中可能受到選擇的候選基因，為國內(nèi)目前警犬品種的遺傳資源保護和開發(fā)利用提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗共選取24頭犬采集全血樣本，對犬進行前肢靜脈采血方法收集。選取樣本為3個品種犬：其中采集昆明犬16頭，采集馬里努阿犬4頭，采集德國牧羊犬4頭，樣本的遺傳資源基本信息如表1所示。血液樣本用EDTA抗凝，-80 ℃保存，用于基因組DNA提取。

表1 本試驗采集犬的基本遺傳信息

1.2 主要試劑和儀器

血液基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；EDTA、瓊脂糖、DNA makerDL2000等均購自寶生物(大連)工程有限公司。

電泳儀購自北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購自Invitrogen公司；離心機購自Eppendorf公司；-80 ℃冰箱購自海爾公司；核酸質(zhì)量檢測儀購自Thermo公司

1.3 基因組DNA提取、純化與分型

利用血液基因組DNA提取試劑盒從血樣中提取基因組DNA純化后，采用Illumina CanineHD Beadchip芯片進行基因分型分析獲得數(shù)據(jù)，用 PLINK軟件對芯片進行軟件處理質(zhì)控。

1.4 群體遺傳結(jié)構分析

采用PLINK和Frappe軟件進行群體結(jié)構分析，對24個犬個體進行K=2～5的分析(每個K 3個重復)，用PLINK計算3個品種犬群體的雜合度和近交系數(shù)，馬爾科夫蒙特卡洛(MCMC)計算的參數(shù)都將燃盡值設為20 000次，重復值設為30 000次。

1.5 聚類分析

聚類分析之前，用PLINK軟件的indep-pairwise選項進行SNP修剪(參數(shù)設為：25個SNPs為一個窗口，5個SNPs為一個步長，R2的閾值定為0.05)。PCA分析使用R語言包(http://www.r-project.org/)來進行主成分分析。

1.6 NJ進化樹分析

利用GENEPOP軟件計算群體之間的兩兩距離，進行聚類分析，從而推斷出種群間的親緣關系遠近。用Treebest軟件、鄰接法(neighbor-joining methods)構建個體NJ進化樹。

1.7 滑動窗口位點篩選和基因注釋

通過在常染色體上設置500 kb的滑動窗口，選擇每個窗口中具有最高最小等位基因頻率(MAF)的SNPs位點，搜尋SNPs所在的基因區(qū)域。如果某個基因落在這個選擇區(qū)段內(nèi)，將這個基因定義為該行為性狀差異的“候選基因”。若候選基因名稱在兩個數(shù)據(jù)庫中有歧義，則按照Ensembl Genome Browser 中所注釋名稱?；蜃⑨屚ㄟ^R包完成，利用DAVID6.8(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)在線軟件對選擇出來的候選基因進行基因功能富集分析，分析的內(nèi)容主要為基因功能聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 SNP統(tǒng)計分析及質(zhì)控結(jié)果

基于芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，最終有86 270個SNPs被篩選出來用于分析。SNP功能注釋詳見表2，其中同義突變有782個，非同義突變有368個，非同義突變引起翻譯提前終止5個，共有1 154個SNPs突變位于外顯子區(qū)。

表2 犬芯片SNP信息統(tǒng)計

2.2 群體結(jié)構及遺傳多樣性分析

基于貝葉斯模型的聚類算法來檢測3個警犬品種基因組群體的分離程度(圖1)，當假設有兩個祖先群體(K=2)時，德國牧羊犬(DM)和其他品種犬完全區(qū)分開來；當K=3時馬里努阿犬(ML)、昆明犬、德國牧羊犬可以區(qū)分開來，但昆明犬黑背品系(KH)中混有25.1%德國牧羊犬雜合。當K=4時，昆明犬品種中狼青品系(KL)、草黃品系(KC)從昆明犬中分離出來。昆明犬品種中黑背品系(KH)與其他群體間的親緣關系很近，其中含有10.2%德國牧羊犬雜合，含有37.1%狼青品系雜合，含有35.2%的草黃品系雜合。當K=5時昆明犬品種中狼青品系的A1家系(KL01-04)和A2家系(KL05-08)可以分離出來，昆明犬黑背品系(KH)較難區(qū)分出來。

每種顏色代表一個群體，每個豎線塊代表一個樣本。橫坐標為樣本編號，縱坐標代表在祖先群體中所占的比例

德國牧羊犬(DM)、昆明犬品種中黑背品系(KH)、草黃品系(KC)和狼青品系(KL)、馬里努阿犬(ML)幾個群體共24個個體進行雜合度和近交系數(shù)分析(表3)。群體平均、均小于0.5，說明幾個群體均受到一定程度的選擇。其中德國牧羊犬(DM)的最小0.247 2，其近交系數(shù)(F)值最高0.036 47。其次是馬犬(ML)的為0.264 4，其近交系數(shù)()值為0.034 16，與德國牧羊犬差異不大，但高于昆明犬3個品系群體的值。昆明犬中黑背品系(KH)的平均值最高為0.382 1，近交系數(shù)()值為0.021 88，草黃品系(KC)和狼青品系(KL)的值略低于黑背品系(KH)。

表3 3個品種犬群體的雜合度和近交系數(shù)

2.3 群體PCA分析

通過主成分分析(principal components analysis，PCA)的方法估計了3個品種犬的群體結(jié)構(圖2)。與STRUCTURE 結(jié)果相符，第一、二主成分能將德國牧羊犬(DM)、馬里努阿犬(ML)、昆明犬清楚地分開(圖2A)，PC1可以解釋原所有變量(所有SNP)總體方差的16.93%，PC2、PC3分別占總變異的12.40%和9.25%。另外，與STRUCTURE分析K=4的結(jié)果相比，PCA 的第一、第三成分已能很好地將昆明犬品種中狼青品系(KL)、草黃品系(KC)、黑背品系(KH)從昆明犬中明顯分離出來，兩個主成分(PC1和PC3)黑背品系與狼青品系存在一定程度的混合(圖2B)。

坐標軸標簽括號中的數(shù)值代表主成分解釋總體方差的百分比

2.4 NJ-TREE分析

NJ樹結(jié)果如圖3顯示，主要由3大分支組成，分別為德國牧羊犬(DM)、昆明犬和馬里努阿犬(ML)。昆明犬3個品系主要在一個主要分支中，其中昆明犬草黃品系(KC01-04)聚為一支，昆明犬品種中黑背品系(KH01、03、04)聚為一支，昆明犬品種中狼青品系的A1家系(KL01-04)和A2家系(KL05-08)各聚為一支。

圖3 3個警犬品種群體系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.5 受選擇基因的檢測

為了避免每條染色體的開始/結(jié)束端缺少側(cè)翼標記信息，每條染色體開始和結(jié)束端的 SNP 標記必須選擇。最后，選擇了昆明犬554個具有高MAF的信息SNPs位點。將這些區(qū)域注釋后，得到22個在昆明犬品種形成過程中可能受到選擇的候選基因。用DAVID Bioinformatics Resource.(6.8)對可能受到選擇的22個候選基因進行功能聚類分析發(fā)現(xiàn)(表4)，在昆明犬與其他品種分離后，其基因組中有兩個類別的基因受到了正選擇。第一類是與腺苷酸環(huán)化酶活化g蛋白偶聯(lián)受體信號通路相關的基因及蛋白，包括腺苷酸環(huán)化酶2(ADCY2)、腺苷酸環(huán)化酶3(ADCY3)、腺苷酸環(huán)化酶8(ADCY8)。另一類是在神經(jīng)元軸突的生長錐中具有聚合和穩(wěn)定微管的功能，影響軸突和前導突起生長的相關基因。其中在腦發(fā)育過程中，候選基因13調(diào)控神經(jīng)元的遷移、大腦皮層和海馬組織結(jié)構的形成，從而影響學習與記憶等腦功能。

表4 昆明犬中受正選擇作用基因的功能聚類分析

3 討 論

3.1 3個警用工作犬品種的群體遺傳結(jié)構

本研究對3個中國主要警犬品種的共計24個個體(其中包含昆明犬狼青、黑背、草黃3種品系)用Illumina CanineHD Beadchip芯片進行基因分型，同時運用群體PCA主成分分析、STRUCTURE分析和NJ樹進行了群體遺傳分析。其中，昆明犬狼青品系(KL)、黑背品系(KH)、草黃品系(KC)3個品系有相似的體型和行為，不同的只是毛色。雄性成年個體體高在65～70 cm之間，而雌性成年個體體高在60～65 cm之間。狼青品系(KL)全都是黑色、黃色和灰色被毛，而黑背品系(KH)是黑色的背部和黃色的腹部和四肢，草黃品系(KC)主要是黃色被毛，少量黑色被毛。馬里努阿犬(ML)被毛短，全身褐色，頭面部黑色，體型外形勻稱呈方形。德國牧羊犬(DM)被毛稍長，基本是黑背黃腹，雄性成年個體體高在60～65 cm之間，性情溫良，服從命令，警惕性高，被廣泛用于軍警方面(圖4)。

A.昆明犬狼青品系(KL)；B.昆明犬黑背品系(KH)；C.昆明犬草黃品系(KC)；D.馬里努阿犬(ML)；E.德國牧羊犬(DM)

已有研究表明，家犬是一個由于人類馴化活動和遷徙運動產(chǎn)生的特殊物種，家犬起源學說也證明現(xiàn)代犬種歷經(jīng)了兩個馴化階段，既第一次由灰狼到家犬的馴化，以及第二次強力選擇下的品系形成過程才形成了千差萬別的400多個豐富的家犬品種。本研究結(jié)果表明，當假設有兩個祖先群體(K=2)時，德國牧羊犬(DM)和其他品種犬完全區(qū)分開來；當假設有3個群體(K=3)時，昆明犬(包含狼青品系、草黃品系、黑背品系)與馬里努阿犬(ML)、德國牧羊犬(DM)可以分離開來。這也是由于歐洲隨著工業(yè)革命的興起，生產(chǎn)力逐漸剩余，人工選擇開始傾向于由犬幫助人類進行警戒、守衛(wèi)活動和以聰慧易于服從的大腦偏好為選種選育目標進而形成多品種的工作犬。根據(jù)本研究結(jié)果，昆明犬存在部分與德國牧羊犬的雜合成分，表明昆明犬與德國牧羊犬群體間存在親緣關系，這與前人對中國地方狼犬與德國牧羊犬毛色的遺傳規(guī)律研究結(jié)果吻合。尤其是昆明犬的黑背品系，是通過早期與德國牧羊犬黑背品系雜交選育得來的。由于昆明犬品種選育中引入了擁有優(yōu)良性狀的品種進行雜交，因此昆明犬黑背品系的雜合度高，近郊系數(shù)低，遺傳多樣性豐富。另外兩個品系與馬犬、德牧的遺傳關系較遠，可以明顯分離出來。而馬犬、德牧在長時間定向選育中，有效群體數(shù)量逐漸減少，群體遺傳變異水平降低，雜合度降低，近交系數(shù)升高，遺傳多樣性降低。3個品種警犬平均和均小于0.5，說明3個群體均受到的強烈選擇。草黃品系(KC)和狼青品系(KL)的值略低于黑背品系(KH)，群體遺傳分析能夠區(qū)分群體的生理差異和地理起源，對應本研究中，昆明犬3個品系聚在一個分支中，但昆明犬草黃品系(KC)、黑背品系(KH)、狼青品系(KL)均存在一定程度的分化，本結(jié)果對3個中國主要警犬品種的遺傳結(jié)構進行了說明。但本試驗樣本數(shù)量偏少，德國牧羊犬和馬犬兩個犬種分別選擇4個有代表性的核心群樣本，對群體遺傳結(jié)構說明支撐力不足。

3.2 昆明犬品種中受選擇的基因

本試驗篩選昆明犬基因組上的選擇信號，利用基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)了可能受到選擇的重要候選基因。通過與基因組數(shù)據(jù)信息進行比對和基因注釋共找到了22個選擇信號候選基因。通過富集分析發(fā)現(xiàn)，第一類是與參與腺苷酸環(huán)化酶活化g蛋白偶聯(lián)受體信號通路的基因及蛋白，包括腺苷酸環(huán)化酶2(2)、腺苷酸環(huán)化酶3(3)、腺苷酸環(huán)化酶8(8)基因。與犬ADCYs同源的基因在人的大腦組織中特異性高表達。已有研究表明，跨膜腺苷酸環(huán)化酶()參與腦中突觸可塑性、多發(fā)性的形成，如學習和記憶的調(diào)節(jié)。它們合成由G蛋白偶聯(lián)受體活化的細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)。Sanabra和Mengod通過原位雜交檢查大鼠和小鼠大腦9個ADCYs亞型的神經(jīng)解剖分布證明了ADCYs在大鼠和小鼠腦的皮質(zhì)、海馬、丘腦核、嗅覺系統(tǒng)和小腦顆粒層中廣泛分布。

本研究還明確揭示了在昆明犬受選擇基因中的鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶2α(CAMK2A/II)、蛋白激酶(APRKX)和激腺苷酸環(huán)化酶(ADCY3)，這3個基因均存在于嗅覺傳導(olfactory transduction)通路中。研究表明，CaMKII能增強控鈉通道的電活性和神經(jīng)元興奮性，ADCY3在大鼠增強突觸可塑性中發(fā)揮重要作用，與恐懼相關的學習記憶和長期記憶鞏固有關，在控制學習和記憶機制中起著重要作用，對昆明犬利用嗅覺進行鑒別的科學意義重大。已有研究表明，CaMKⅡ alpha亞型(CaMKⅡα)是在小鼠腦中特異并且大量表達，在缺乏3′UTR的小鼠中，mRNA的樹突狀定位表達被破壞，嗅覺關聯(lián)學習受到嚴重損害。因此揭示了CaMKIIα局部翻譯是作為嗅覺可塑性的決定因素。Daroles等通過比較中國土狗和比格獵犬在慢性應激刺激和不應激刺激兩種條件下腎上腺皮質(zhì)和垂體的轉(zhuǎn)錄組分析，證明了2、1等基因是通過控制下丘腦-垂體-腎上腺軸調(diào)節(jié)的關鍵基因，進而影響中國土狗和比格獵犬經(jīng)受壓力刺激時表現(xiàn)出不同應激反應耐受的差異。

另一類候選基因是在神經(jīng)元軸突的生長錐中具有聚合和穩(wěn)定微管的功能，影響軸突和前導突起的生長；在腦發(fā)育過程中，F(xiàn)GF13調(diào)控神經(jīng)元的遷移、大腦皮層和海馬組織結(jié)構的形成，從而影響學習與記憶等腦功能。在小鼠上的試驗證實，13基因敲除小鼠由于神經(jīng)元遷移遲滯造成大腦皮層和海馬結(jié)構分層異常，學習記憶能力受到明顯損害。結(jié)合本研究的結(jié)果，上述基因在犬上均未有明確的功能驗證，以往的工作犬行為學研究普遍認為犬膽量本質(zhì)上是適應和克服恐懼的能力，本研究結(jié)果表明，犬在受選擇過程中與大腦功能偏好的基因在大腦的學習和記憶功能起到了重要作用。后續(xù)會繼續(xù)開展警犬受選擇基因的表達驗證和功能研究，探究影響膽量、嗅覺學習等犬的警用行為性狀的大腦遺傳機制。

4 結(jié) 論

本研究分析了昆明犬的的群體遺傳結(jié)構，探討了3種警用工作犬品種的遺傳關系。同時得到了22個在昆明犬品種形成過程中可能受到選擇的候選基因。本試驗挖掘的相關基因證明了昆明犬受到了強烈的人工選擇進而產(chǎn)生了對影響應激反應、嗅覺學習記憶性能的調(diào)控。針對受選擇基因，在后續(xù)應通過功能性驗證來證明上述基因在昆明犬學習、記憶方面發(fā)揮的重要作用。本研究為國內(nèi)警用工作犬的種質(zhì)資源開發(fā)利用提供了重要理論依據(jù)。