魏睿元,趙一萍,白東義,韓海格,王希生,阿娜爾,烏英嘎,芒 來*,李旭東

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 馬屬動(dòng)物研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站 內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.北京軍區(qū)紅山軍馬場(chǎng)，赤峰 025377)

蒙古馬是經(jīng)過千年的自然和蒙古族先民選育，塑成具有抵抗嚴(yán)寒、耐粗飼、抗病能力強(qiáng)、騎乘速力佳、能持久長(zhǎng)途跋涉等特有品性。作為草原上的使者，蒙古馬一直承載著祖輩曾經(jīng)的輝煌與精神。目前，蒙古馬運(yùn)動(dòng)性能方面的研究，主要集中于分子生物學(xué)方面。楊麗華對(duì)蒙古馬運(yùn)動(dòng)相關(guān)候選基因在運(yùn)動(dòng)前后的表達(dá)及蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分子鑒定，吳蘇日古嘎就蒙古馬運(yùn)動(dòng)候選基因的表達(dá)及基因多態(tài)性進(jìn)行了分析。對(duì)于馬運(yùn)動(dòng)代謝組學(xué)方面的研究國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。代謝組學(xué)是以高通量檢測(cè)和大數(shù)據(jù)深度分析為基礎(chǔ)的系統(tǒng)生物學(xué)學(xué)科，與常規(guī)的某一項(xiàng)或多項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)方法相比，能更全方位、敏銳的監(jiān)測(cè)機(jī)體整體性的生命代謝活動(dòng)的動(dòng)態(tài)變化。對(duì)蒙古馬運(yùn)動(dòng)代謝組學(xué)的研究，有助于深入了解其在運(yùn)動(dòng)過程中機(jī)體的生物學(xué)變化特征，為指導(dǎo)科學(xué)訓(xùn)練，有效發(fā)掘耐力運(yùn)動(dòng)的遺傳潛能，保障競(jìng)賽中人、馬的安全，助力蒙古馬訓(xùn)育工作提供重要參考。

本研究應(yīng)用核磁共振(NMR)技術(shù)，采集蒙古馬兩次耐力負(fù)荷(15、30 km)運(yùn)動(dòng)前后的血液樣本，分析血漿代謝譜，結(jié)合單變量方差分析和多變量多維分析，鑒別耐力運(yùn)動(dòng)前后明顯變化的血液小分子化合物，比較兩次耐力負(fù)荷代謝物間的差異，發(fā)現(xiàn)潛在的標(biāo)志性代謝物，以探索耐力負(fù)荷下蒙古馬機(jī)體代謝通路，為我國(guó)耐力型運(yùn)動(dòng)馬的訓(xùn)練及選育工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究在烏蘭布統(tǒng)鄉(xiāng)的紅山軍馬場(chǎng)5 km專用比賽跑道完成。試驗(yàn)動(dòng)物為5歲左右的蒙古馬騸馬6匹，體尺指標(biāo)基本一致(表1)。6匹馬15 和30 km負(fù)荷訓(xùn)練全程均以快步步法完成，用時(shí)控制在相近的范圍內(nèi)，確保均速一致，以排除體尺因素的影響(表2)。

表1 蒙古馬的基本情況

表2 蒙古馬耐力運(yùn)動(dòng)信息表

1.2 血樣采集

對(duì)6匹蒙古馬分別進(jìn)行15 與30 km運(yùn)動(dòng)負(fù)荷訓(xùn)練，每匹馬每次采集其運(yùn)動(dòng)前晨血液樣本20 mL，運(yùn)動(dòng)后再采集血液樣本20 mL，共計(jì)24個(gè)血液樣本，用肝素鈉抗凝，5 000 r·min低速離心3 min，用移液槍迅速分離出1.5 mL血漿放到凍存管中，立刻投入液氮保存，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，用于H-NMR代謝組檢測(cè)。

1.3 核磁檢測(cè)樣品處理

核磁待檢樣本制備：將6個(gè)血漿樣本解凍，分別快速渦旋30 s，吸取混勻的血漿萃取上清液800 μL于超濾膜中，13 000 r·min、4 ℃離心30 min，再重復(fù)1次，離心15 min；分別各吸取濾液450 μL到離心管，再加入50 μL ACDSS試劑，10 s渦旋使ACDSS試劑與濾液混勻；將混勻的混合濾液，4 ℃ 13 000 r·min離心2 min，分別吸取上清液480 μL到核磁管中，標(biāo)記編號(hào)，用于采集核磁共振圖譜。

1.4 1H-NMR圖譜采集

樣品進(jìn)行H-NMR 掃描。質(zhì)譜儀氫質(zhì)子共振頻率600.13 MHz，檢測(cè)溫度298 K，脈沖序列Noesygppr1D，采樣參數(shù)：DSS為內(nèi)標(biāo)(標(biāo)準(zhǔn)DSS峰的50%高峰寬≤1.2 Hz，11%高峰寬≤15 Hz，5%高峰寬≤30 Hz)，脈沖序列中等待1 s、混合0.1 s，施加50 Hz低功率強(qiáng)度進(jìn)行水峰連續(xù)波抑制，8 kHz譜寬，0.15 s混合，馳豫延遲1 s，采樣點(diǎn)數(shù)32 k，65 536頻率域?qū)?frequency domain size)，時(shí)間域?qū)?time domain size)32 678，F(xiàn)ID 64次累加，進(jìn)行一維NMR譜相位調(diào)整，傅立葉變換，基線校正。所有樣本的H-NMR譜都在同一譜儀上獲得。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將NMR自由衰減感應(yīng)(FID)信號(hào)導(dǎo)入軟件Chenomx NMR suit 8.0(edmonton，Canada)中，自動(dòng)進(jìn)行譜線校準(zhǔn)。用0.0 ppm DSS-d6峰為譜圖化學(xué)位移的基準(zhǔn)，進(jìn)行譜圖峰形調(diào)整。以DSS-d6的譜峰面積和濃度為標(biāo)準(zhǔn)，通過軟件數(shù)據(jù)庫對(duì)樣本核磁譜圖的檢測(cè)信號(hào)一一比對(duì)解析。采用目標(biāo)分析法，將分析確認(rèn)的代謝化合物的類別和濃度數(shù)值數(shù)據(jù)，經(jīng)過R語言pls包、ggplot2包進(jìn)行質(zhì)量歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化處理，再進(jìn)行有監(jiān)督偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模式識(shí)別及可視化作圖，以分析觀察組間代謝模式是否有差異，分析結(jié)果以得分圖(score plot)的形式表示。以判定模型提取的VIP值(變量重要性投影值)作為對(duì)區(qū)分分組差異有貢獻(xiàn)的目標(biāo)代謝物，將VIP>1的代謝物作為感興趣的代謝物，同時(shí)使用SPSS20.0軟件(IBM-SPSS公司，芝加哥，美國(guó))進(jìn)行組間代謝物的One-way ANOVA差異性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 蒙古馬不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷水平的血漿代謝物歸屬

利用加拿大Chenomx公司商用代謝組數(shù)據(jù)庫，對(duì)6匹蒙古馬兩次運(yùn)動(dòng)前后血漿NMR圖譜中的代謝物類別及濃度進(jìn)行歸屬，共歸屬出47種代謝物，如圖1和表3所示。其中，對(duì)蒙古馬經(jīng)過15 km運(yùn)動(dòng)負(fù)荷前后的血漿代謝物進(jìn)行分析，共鑒定出21種差異代謝物(表4)；對(duì)蒙古馬經(jīng)過30 km運(yùn)動(dòng)負(fù)荷前后的血漿代謝物進(jìn)行分析，共鑒定出10種差異代謝物(表5)。對(duì)蒙古馬經(jīng)過15 和30 km運(yùn)動(dòng)負(fù)荷后的血漿代謝物進(jìn)行分析，共鑒定出18種差異代謝物(表6)。蒙古馬在兩次運(yùn)動(dòng)負(fù)荷前后的差異代謝物類別上存在明顯不同，說明在兩次運(yùn)動(dòng)負(fù)荷期間蒙古馬代謝存在明顯差異。

表3 蒙古馬血漿代謝物歸屬信息

圖1 蒙古馬15和30 km運(yùn)動(dòng)前后血漿代謝物歸屬圖譜

2.2 蒙古馬不同耐力運(yùn)動(dòng)水平的血漿PLS-DA模式識(shí)別與差異標(biāo)志代謝物

對(duì)蒙古馬15 和30 km耐力運(yùn)動(dòng)前后血漿樣本H-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別分析，獲得有監(jiān)督的偏最小二乘判別(PLS-DA)得分，見圖2、圖3與圖4。PLS-DA模式分析結(jié)果顯示，15 和30 km耐力運(yùn)動(dòng)前后的樣本能很好地區(qū)分開，說明兩次耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)蒙古馬機(jī)體的代謝模式均造成了明顯的影響。對(duì)PLS-DA模型進(jìn)行有效性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)蒙古馬15 km運(yùn)動(dòng)前后血漿代謝物的Q2=0.722 2，30 km運(yùn)動(dòng)前后血漿代謝物的Q2=0.760 6，15 和30 km運(yùn)動(dòng)后血漿代謝物的Q2=0.731 4，通常Q2>0.4認(rèn)為可信度較高，說明本研究模型的結(jié)果是可信的，且發(fā)現(xiàn)蒙古馬兩次運(yùn)動(dòng)前、后的血漿代謝物均有明顯的差異。

通常選取VIP>1的差異代謝物作為判別樣本組間差異有較大影響的潛在標(biāo)志代謝物。從圖2B和表4可以看出，乳酸、葡萄糖、甘油、丙氨酸、丙酮酸、乙醇對(duì)區(qū)分蒙古馬15 km運(yùn)動(dòng)前后血漿代謝差異有較大作用。從圖3B和表5可以看出，葡萄糖、乙醇、甘氨酸、甲醇、谷氨酰胺、賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、τ-甲基組氨酸、肌酸對(duì)區(qū)分蒙古馬30 km運(yùn)動(dòng)前后血漿代謝差異有較大作用。從圖4B和表6可以看出，乳酸、乙酸、甲醇、丙氨酸、二甲基砜、檸檬酸、丙酮酸對(duì)區(qū)分蒙古馬15與30 km耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后血漿代謝差異有較大作用。

A.血漿PLS-DA得分圖；B.血漿代謝物VIP圖。MFB.運(yùn)動(dòng)前；MFA.運(yùn)動(dòng)后。不同顏色表示相應(yīng)分組樣本的總體95%置信區(qū)間范圍。下同

A.血漿PLS-DA得分圖；B.血漿代謝物VIP圖

A.血漿PLS-DA得分圖；B.血漿代謝物VIP圖

2.3 蒙古馬兩次運(yùn)動(dòng)前后血漿代謝物差異性比較分析

對(duì)兩次負(fù)荷運(yùn)動(dòng)前后的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，鑒別出其他具有潛在差異性的代謝物，以便能夠更全面地闡釋耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)馬匹機(jī)體代謝造成的影響。從表4可以看出，蒙古馬經(jīng)過15 km耐力運(yùn)動(dòng)后，血漿中亮氨酸、酪氨酸、異丁酸、纈氨酸、乙酰乙酸、3-羥基異丁酸、O-乙酰肉堿、2-羥基異丁酸、苯丙氨酸極顯著升高(<0.01)，甘露糖顯著下降，蘇氨酸、蛋氨酸、肌酐、甘油、3-甲基-2-氧代戊酸、3-羥基異戊酸顯著升高(<0.05)。從表5可以看出，蒙古馬經(jīng)過30 km耐力運(yùn)動(dòng)后，血漿中乙醇、谷氨酰胺顯著的下降(<0.05)，賴氨酸極顯著下降(<0.01)。從表6可以看出，對(duì)15 km與30 km運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行比較，蒙古馬血漿中甲醇、3-羥基異戊酸、二甲基砜、N-苯乙酰甘氨酸極顯著升高(<0.01)，異丁酸、丙二酸、丙酮、2-羥基異戊酸、2-羥基異丁酸極顯著下降(<0.01)，馬尿酸鹽顯著升高(<0.05)，泛酸、甜菜堿、賴氨酸顯著下降(<0.05)。

表4 蒙古馬15 km運(yùn)動(dòng)前后血漿差異代謝標(biāo)志物

表5 蒙古馬30 km運(yùn)動(dòng)前后血漿差異代謝標(biāo)志物

表6 蒙古馬15 與30 km運(yùn)動(dòng)后血漿差異代謝標(biāo)志物

3 討 論

通常對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練負(fù)荷的監(jiān)控，常采用生化測(cè)試指標(biāo)、酶類或生理指數(shù)等輔助指標(biāo)。代謝組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)(NMR、LC、GC、MS等)與常規(guī)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)相比，能更迅捷、精銳、整體性地描繪出機(jī)體生命代謝活動(dòng)模式的實(shí)時(shí)變化，質(zhì)子核磁共振技術(shù)手段能夠量化全部小分子化合物，能全面性的檢測(cè)機(jī)體對(duì)內(nèi)外部刺激的波動(dòng)反應(yīng)。在馬運(yùn)動(dòng)科學(xué)技術(shù)中具明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和實(shí)際應(yīng)用前景。本研究基于NMR代謝組學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蒙古馬經(jīng)過15 km運(yùn)動(dòng)負(fù)荷前后共鑒定出21種差異代謝物，經(jīng)過30 km運(yùn)動(dòng)負(fù)荷前后共鑒定出10種差異代謝物。蒙古馬在兩次運(yùn)動(dòng)負(fù)荷前后的差異代謝物類別上存在明顯不同，說明在兩次運(yùn)動(dòng)負(fù)荷期間蒙古馬代謝存在明顯差異。

3.1 蒙古馬無氧供能系統(tǒng)代謝

無氧代謝是劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)氧供應(yīng)不足，機(jī)體通過三磷酸腺苷-磷酸肌酸(ATP-CP)系統(tǒng)及糖酵解途徑迅速供給能量的代謝過程。肌酸池由肌酸、磷酸肌酸構(gòu)成，ATP合成中脫水或脫磷酸最終以肌酐形式排出，通常是運(yùn)動(dòng)員速度、力量素質(zhì)的評(píng)定指標(biāo)，大量運(yùn)動(dòng)引起尿液、血清肌酐升高，反映了骨骼肌細(xì)胞磷酸源釋放及代謝循環(huán)加強(qiáng)。機(jī)體內(nèi)主要的糖為葡萄糖和糖原。短時(shí)間低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，糖原持續(xù)分解及糖異生增強(qiáng)，使血糖升高，但長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)劇烈運(yùn)動(dòng)使體內(nèi)糖原消耗殆盡，肌肉攝取血糖增加，使血糖下降。丙酮酸、檸檬酸是機(jī)體糖、脂、氨基酸進(jìn)行三羧酸循環(huán)(TAC)代謝或相互轉(zhuǎn)換的中間產(chǎn)物。丙酮酸參與清除過氧化氫，在機(jī)體持續(xù)缺氧時(shí)，線粒體氧化速率下降，丙酮酸大量累積，而經(jīng)糖酵解途徑還原生成乳酸供能，血乳酸值被用作無氧代謝能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。研究顯示，短時(shí)間大強(qiáng)度訓(xùn)練和中長(zhǎng)跑、馬拉松比賽后血糖水平均下降，乳酸、丙酮酸值均升高，力竭運(yùn)動(dòng)后尿液檸檬酸呈下降趨勢(shì)。

本研究發(fā)現(xiàn)，15 km負(fù)荷后蒙古馬血漿中肌酐顯著升高，葡萄糖、乳酸、丙酮酸升高，30 km負(fù)荷后蒙古馬血漿中肌酸升高，葡萄糖下降，30 km較15 km負(fù)荷后血漿中丙酮酸極顯著升高，檸檬酸、乳酸下降，與曾亞琦等對(duì)伊犁馬耐力性能研究中的結(jié)果相似。肌酐、肌酸的變化說明兩次耐力負(fù)荷中，蒙古馬骨骼肌中的磷酸肌酸均被大量消耗，且30 km負(fù)荷期間肌酸重新合成在增強(qiáng)。15 km負(fù)荷期間葡萄糖、乳酸、丙酮酸表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，說明機(jī)體糖酵解系統(tǒng)供能加強(qiáng)。30 km較15 km負(fù)荷后丙酮酸升高，檸檬酸、乳酸下降則表明30 km負(fù)荷期間蒙古馬有氧代謝過程供能在加強(qiáng)。兩次負(fù)荷期間糖原均被大量消耗，提示30 km以上的中長(zhǎng)距離耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，可能會(huì)造成蒙古馬機(jī)體磷酸源及糖代謝能量物質(zhì)被大量消耗，誘發(fā)訓(xùn)練后疲勞。在長(zhǎng)時(shí)間的耐力運(yùn)動(dòng)后，適當(dāng)補(bǔ)充糖類和有助于有氧代謝的物質(zhì)，對(duì)緩解蒙古馬機(jī)體疲勞，促進(jìn)恢復(fù)會(huì)有很大幫助。

3.2 蒙古馬有氧氧化系統(tǒng)代謝

有氧氧化代謝系統(tǒng)是糖、脂、氨基酸在氧元素的參與下分解代謝合成大量ATP，最終排出二氧化碳和水的物質(zhì)代謝過程，是進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間耐力活動(dòng)的主要供能系統(tǒng)。脂肪組織動(dòng)員儲(chǔ)存的三酰甘油參與能量供應(yīng)的重要性，隨運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間延續(xù)而升高，隨運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度加強(qiáng)而下降。本研究中15 km負(fù)荷后蒙古馬血漿甘油顯著升高，異丁酸、乙酰乙酸、O-乙酰肉堿、2-羥基異丁酸極顯著升高；30 km較15 km負(fù)荷后血漿中丙酮、異丁酸、2-羥基異丁酸極顯著下降，N-苯乙酰甘氨酸極顯著升高，泛酸、甜菜堿顯著下降，這些標(biāo)志物涉及脂肪分解，脂肪酸有氧代謝、酮體代謝、β-氧化，機(jī)體抗氧化、抗疲勞、自由基清除、磷脂合成、細(xì)胞修護(hù)、滲透壓調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等，研究顯示，混合氧運(yùn)動(dòng)后短鏈脂肪酸濃度明顯升高，長(zhǎng)時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)中血酮體增加將改變骨骼肌能量供需，由葡萄糖氧化逐漸過渡至以脂肪氧化供能為主，以節(jié)省血糖保持運(yùn)動(dòng)能力。中等強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)比大強(qiáng)度短時(shí)間運(yùn)動(dòng)更易發(fā)生酮癥。隨運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加，骨骼肌O-乙酰肉堿含量增加，同時(shí)自由肉毒堿含量降低，血漿泛酸、甜菜堿濃度下降。補(bǔ)充泛酸、甜菜堿能降低運(yùn)動(dòng)性疲勞，增進(jìn)耐力，提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)。本研究中代謝物變化表明兩次耐力負(fù)荷期間脂肪代謝供能均增加。

本研究發(fā)現(xiàn)，15 km負(fù)荷期間蒙古馬脂肪酸酮體代謝明顯增強(qiáng)，顯示葡萄糖存量不能滿足需求，而30 km負(fù)荷期間脂肪酸酮體代謝下降，有氧氧化供能增加，機(jī)體的氧化應(yīng)激均升高，但30 km負(fù)荷造成機(jī)體免疫壓力增高。提示短距離耐力賽時(shí)，脂肪酸有氧代謝、酮體代謝均參與蒙古馬機(jī)體能量供應(yīng)，酮體代謝對(duì)維持機(jī)體運(yùn)動(dòng)能量的需要至關(guān)重要，運(yùn)動(dòng)結(jié)束可能會(huì)出現(xiàn)酮癥。30 km以上的中長(zhǎng)耐力賽，脂肪酸主要以有氧代謝方式供應(yīng)蒙古馬機(jī)體能量需求。賽程初始階段，酮體代謝是能量供應(yīng)模式轉(zhuǎn)換的過渡階段，隨賽程持續(xù)蒙古馬機(jī)體逐步適應(yīng)，脂肪酸有氧代謝能量供給平衡建立，酮體代謝減弱，但異丁酸下降，可能預(yù)示機(jī)體氧含量逐漸下降，處于一定程度的缺氧狀態(tài)。運(yùn)動(dòng)后補(bǔ)充O-乙酰肉堿、泛酸、甜菜堿等能促進(jìn)脂肪酸代謝、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)的物質(zhì)，或許有助于蒙古馬機(jī)體穩(wěn)態(tài)的快速調(diào)整，避免代謝性傷病發(fā)生。此外，關(guān)于2-羥基異丁酸、N-苯乙酰甘氨酸對(duì)運(yùn)動(dòng)能力影響的研究目前尚少，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

3.3 蒙古馬氨基酸代謝

參與馬匹機(jī)體生命活動(dòng)的氨基酸約21種，其中必需氨基酸有：組氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸10種，且第1限制性氨基酸為賴氨酸。本研究中15 km負(fù)荷后蒙古馬血漿中纈氨酸、丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、3-羥基異丁酸極顯著升高，蘇氨酸、蛋氨酸、3-甲基-2-氧代戊酸、3-羥基異戊酸顯著升高，甘露糖顯著下降；30 km負(fù)荷后蒙古馬血漿中纈氨酸、甘氨酸、τ-甲基組氨酸、脯氨酸下降，賴氨酸極顯著下降，谷氨酰胺顯著下降；30 km較15 km負(fù)荷后血漿丙氨酸下降，丙二酸顯著升高，3-羥基異戊酸、二甲基砜、賴氨酸極顯著升高，2-羥基異戊酸極顯著下降，與Luck等研究結(jié)果相似。這些氨基酸及其代謝衍生物，涉及糖、脂、氨基酸能量代謝、糖異生、丙氨酸-葡萄糖循環(huán)，參與機(jī)體糖原、磷脂、體蛋白、非必需氨基酸、含氮物質(zhì)合成，細(xì)胞保護(hù)，自由基、活性氧簇清除，抗氧化應(yīng)激，炎癥因子、免疫力、血氨、血乳酸、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，脂肪酸氧化、機(jī)體發(fā)育、組織修復(fù)、骨骼肌合成分解，防止組織缺氧，疲勞抵抗密切相關(guān)。研究顯示，混合氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后尿液甘氨酸水平升高，是人體脂肪組織代謝供能比例上升的標(biāo)志。長(zhǎng)時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)中，血液中芳香族氨基酸水平升高，谷氨酰胺、丙氨酸、支鏈氨基酸(BCAA)、谷氨酸水平顯著下降，但耐力訓(xùn)練初期，肌肉中丙氨酸合成增加，血液中濃度升高。蛋白質(zhì)合成調(diào)節(jié)因子的3-羥基異戊酸(HMB)，能降低肌肉損傷。骨骼肌收縮蛋白分解產(chǎn)物τ-甲基組氨酸(3-MH)。高強(qiáng)度大負(fù)荷訓(xùn)練后恢復(fù)期尿液3-MH排出量先下降再上升，骨骼肌蛋白分解具有延緩性，但骨骼肌運(yùn)動(dòng)性損傷，尿液3-MH排出會(huì)持續(xù)增加。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中，肝組織蛋白為主的非收縮蛋白分解會(huì)增加，而肌肉組織蛋白分解是降低的。運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期，則以骨骼肌蛋白分解為主，這是引起訓(xùn)練后延緩性肌肉損傷的原因之一。臨床和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中血漿谷氨酰胺、3-MH、酪氨酸、脯氨酸羥基化修飾生成的羥脯氨酸常作為監(jiān)測(cè)機(jī)體骨骼肌分解代謝和過度訓(xùn)練監(jiān)控的重要標(biāo)志代謝物。此外，在比賽前及運(yùn)動(dòng)中，馬拉松、越野滑雪運(yùn)動(dòng)員補(bǔ)充BCAA，可明顯提升選手的成績(jī)，降低其心理疲勞度，且補(bǔ)充酪氨酸能有效降低運(yùn)動(dòng)后血漿乳酸和氨水平，緩解疲勞。本研究中，15 km運(yùn)動(dòng)后氨基酸水平趨于升高，而30 km運(yùn)動(dòng)后氨基酸水平趨于下降，隨負(fù)荷增加蒙古馬機(jī)體氨基酸代謝參與供能，由丙氨酸-葡萄糖及糖異生途徑向脂肪酸氧化供能轉(zhuǎn)變。氨基酸消耗大增，尤其BCAA隨負(fù)荷增加被大量消耗，隨之機(jī)體氧化應(yīng)激、免疫壓力不斷升高。3-羥基異戊酸、τ-甲基組氨酸的變化，預(yù)示機(jī)體蛋白分解有增加的趨勢(shì)，30 km負(fù)荷更顯著刺激了蒙古馬肌蛋白分解合成的頻率，可能會(huì)引起運(yùn)動(dòng)后肌肉組織損傷。提示耐力性運(yùn)動(dòng)期間，隨負(fù)荷持續(xù)增加蒙古馬機(jī)體氧化應(yīng)激及免疫壓力相應(yīng)升高，機(jī)體可能會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性疲勞和免疫力下降，肌肉等軟組織急劇分解的趨勢(shì)會(huì)上升，出現(xiàn)傷病的可能性升高。恢復(fù)期補(bǔ)充適當(dāng)?shù)腂CAA、谷氨酰胺及一些必需氨基酸有助于蒙古馬機(jī)體快速恢復(fù)，對(duì)緩解運(yùn)動(dòng)性肌損傷至關(guān)重要。

3.4 蒙古馬腸道菌群活動(dòng)

馬是具有發(fā)達(dá)盲腸消化系統(tǒng)的單胃食草動(dòng)物。其盲腸功能相似于反芻動(dòng)物瘤胃。定植于盲腸內(nèi)的微生物區(qū)系參與著馬腸道飼草料的消化、吸收及合成代謝，故消化道中盲腸區(qū)系菌群正常代謝活動(dòng)，對(duì)保持馬屬動(dòng)物自身健康狀態(tài)至關(guān)重要。腸道菌群處于厭氧環(huán)境時(shí)，由腸道厭氧菌代謝丙酮酸生成甲酸、乙酸、乙醇。腸道甲烷菌生成的甲烷可被代謝為甲醇，厭氧條件下甲醇亦可被甲烷菌用來合成甲烷。馬及其它草食動(dòng)物生命活動(dòng)代謝副產(chǎn)物馬尿酸鹽會(huì)隨尿液排出。馬尿酸鹽是苯甲酸在肝細(xì)胞Mg2+CoA、ATP的共同作用下，通過肽鍵結(jié)合甘氨酸生成的代謝物，脫去甘氨酸可再生成苯甲酸。馬尿酸鹽與腸道微生物代謝密切相關(guān)，在能源極其匱乏的狀態(tài)時(shí)，馬尿酸能抑制骨骼肌利用葡萄糖，促使能源物質(zhì)優(yōu)先供應(yīng)給大腦、神經(jīng)等最重要的生命活動(dòng)中，激發(fā)機(jī)體保護(hù)性抑制。

本研究中15 km負(fù)荷后蒙古馬血漿中乙醇下降，30 km負(fù)荷后蒙古馬血漿中乙醇顯著下降，30 km較15 km負(fù)荷后血漿中甲醇極顯著升高，乙酸下降，馬尿酸鹽顯著升高，甲醇下降，表明兩次負(fù)荷期間蒙古馬腸道微生物活動(dòng)受到抑制。隨負(fù)荷的增加機(jī)體葡萄糖消耗加劇，甲醇升高預(yù)示腸道甲烷產(chǎn)出增加，腸道嚴(yán)格厭氧的甲烷菌活動(dòng)更加活躍，機(jī)體缺氧的程度在加深。提示耐力運(yùn)動(dòng)期間，蒙古馬腸道微生物活動(dòng)處于抑制狀態(tài)。隨耐力負(fù)荷增加運(yùn)動(dòng)后機(jī)體能源物質(zhì)消耗加劇，缺氧狀態(tài)加重，可能會(huì)引發(fā)腸道脹氣類疾病。運(yùn)動(dòng)后補(bǔ)充適當(dāng)能源類、腸道菌群調(diào)節(jié)的物質(zhì)，同時(shí)采取緩解機(jī)體缺氧狀態(tài)的措施，會(huì)有助于蒙古馬耐力賽后機(jī)體穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)。

4 結(jié) 論

在蒙古馬15 和30 km兩次運(yùn)動(dòng)前后血漿代謝物中共發(fā)現(xiàn)47種差異代謝物，且兩次運(yùn)動(dòng)前后的差異代謝物類別存在明顯不同，表明蒙古馬在兩次運(yùn)動(dòng)中的代謝存在明顯差異。蒙古馬15 km耐力運(yùn)動(dòng)的供能方式以糖酵解的無氧代謝為主，兼脂肪酸有氧和酮體代謝，而30 km耐力運(yùn)動(dòng)的供能方式則以脂肪酸的有氧代謝為主，酮體代謝是能量供應(yīng)模式轉(zhuǎn)換的過渡性階段。