黃喬木， 何艷

1.咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學院附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 咸寧437199；2.咸寧市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，湖北 咸寧437099

糖尿病腎病是糖尿病臨床中常見的并發(fā)癥之一，由長期糖代謝異常、血流動力學改變和糖尿病微血管病變引起，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，現(xiàn)已成為慢性腎臟病和終末期腎病的主要病因之一［1］。糖尿病腎病的發(fā)病機制較復雜，與腎小球高濾過、高灌注、高壓力等腎臟局部血流動力學變化有關(guān)，同時，隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等異常激活，晚期糖基化終產(chǎn)物的積累和糖脂代謝異常也會導致糖尿病腎病［2］。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，有研究指出，足細胞損傷、自噬、凋亡、壞死等細胞過程介導了糖尿病腎病的疾病進展［3］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是目前公認的調(diào)控細胞增殖、凋亡等細胞周期的信號通路，參與多種惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展［4-5］。研究表明，雷帕霉素作為mTOR 通路的靶向抑制劑，通過抑制mToR通路的活化，在多種疾病中發(fā)揮抗炎、抗腫瘤效應(yīng)［6-7］。然而，目前尚不清楚雷帕霉素是否可以通過調(diào)控mTOR 信號通路影響糖尿病腎病大鼠足細胞的生物學行為。本研究通過構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，分離足細胞，以雷帕霉素處理細胞，觀察模型大鼠足細胞生物學行為的變化情況，以期為臨床治療糖尿病腎病患者提供更多靶向藥物。

1 材料與方法

1.1 動物及模型制備

20 只6~8 周齡清潔級SD 大鼠購自武漢大學動物實驗中心［SYXK（鄂）2017-0065］，體質(zhì)量為180~220 g，恒溫飼養(yǎng)籠環(huán)境：溫度24 ℃，相對濕度65%，12 h光照/12 h黑暗，并給予充足的飲用水和食物，定期清理飼養(yǎng)籠。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后取其中10 只大鼠采用60 mg·kg?1的鏈脲霉素一次性腹腔注射構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，3 d 后抽取大鼠尾靜脈血檢測血糖含量，當觀察到血糖＞16.7 mmol·L?1時認為造模成功。本試驗已通過動物倫理委員會審核批準（編號：2019XLLL09S）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 按照大鼠足細胞原代培養(yǎng)方法［8］取正常飼養(yǎng)的大鼠以及模型大鼠足細胞，將細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素混合物的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待細胞生長至90%融合時，以胰蛋白酶消化傳代，將正常大鼠體內(nèi)取出的足細胞設(shè)為對照組，模型大鼠體內(nèi)取出的足細胞設(shè)為糖尿病腎病模型組（DN 組），以2 mg·kg?1雷帕霉素干預(yù)DN 組足細胞，并將其設(shè)為雷帕霉素組（RAPA組）。

1.2.2 足細胞形態(tài)學觀察 取各組足細胞，采用5%戊二醛固定后脫水、干燥后以石蠟包埋，制成切片，于電子透射電鏡（日本電子株式會社，型號：JEM-1400）下觀察足細胞形態(tài)變化情況。

1.2.3 足細胞增殖檢測 采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽［3-（4，5-dimethylthiahiazo-z-y1）-2，5-diphenytetrazoliumromide，MTT］法檢測各組足細胞增殖水平，將各組細胞制成5×104個·mL?1單細胞懸液，按照每孔200 μL 接種于96孔板中，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度設(shè)置為37 ℃恒溫，相對濕度65%、5% CO2濃度，分別于24、48、72 h 時滴加30 μL的MTT溶液，37 ℃恒溫下再次孵育4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜溶液，采用酶標儀（山東萊恩德智能科技有限公司，型號：LD-96A）檢測波長為490 nm處每孔吸光度值。

1.2.4 足細胞遷移、侵襲檢測 采用Transwell 法檢測各組足細胞遷移和侵襲水平，將各組足細胞制成5×105個·mL?1細胞懸液，以每孔200 μL 接種于直徑為8 μmol·L?1的24 孔板的Transwell 上室中，下室中加入600 μL 的含胎牛血清培養(yǎng)液，37 ℃恒溫條件下共同培養(yǎng)24 h 后移除上室細胞，棄Transwell 膜上未穿過的細胞，4%多聚甲醛固定后，以1%結(jié)晶紫染色，并在倒置顯微鏡（廣州市萊特光電技術(shù)有限公司，型號：LM200）下觀察各組足細胞遷移數(shù)目。細胞侵襲實驗采用50 mg·L?1Matrigel 基質(zhì)膠稀釋后以50 μL 涂抹包被Transwell 小室膜，晾干后再進行后續(xù)步驟，均與細胞遷移實驗方法一致。

1.2.5 足細胞凋亡檢測 采用流式細胞術(shù)檢測各組足細胞凋亡水平，將上述各組以PBS 沖洗多次后，加入1 mL 不含EDTA 胰酶消化后使細胞懸浮，將細胞置于流式管中，高速離心5 min 后棄上清，采用200 μL 的Binding Buffer 緩沖液重懸細胞，滴加5 μL Annexin V-FITC 溶液，充分混勻后加入5 μL 碘化丙啶染溶液，搖勻后室溫下避光孵育15 min，采用流式細胞儀（上海寰熙醫(yī)療器械有限公司，型號：FACSVia）檢測各組足細胞凋亡水平。

1.2.6 足細胞上皮?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和mTOR 信號通路檢測 采用Western blot 法檢測足細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形纖維蛋白（Vimentin）、mTOR 和核糖體S6 激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）蛋白的表達水平，首先以BCA 法定量50 mg 足細胞內(nèi)的總蛋白，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h 后與稀釋后的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、mTOR、S6K1 和β-actin 一抗4 ℃下孵育過夜，Tris-HCl 緩沖鹽溶液洗膜3 次后，加入稀釋后的帶有熒光標記的山羊抗兔二抗于脫色搖床上孵育1 h，Tris-HCl 緩沖鹽溶液再次洗滌3 次后，采用ImageJ 軟件掃描各組蛋白條帶并進行成像，均以β-actin 作為標準化內(nèi)參進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Graphpad Prism 8軟件進行圖像繪制，計量資料均以平均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用重復測量方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組足細胞形態(tài)學變化情況分析

如圖1 所示，對照組足細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，足突清晰可見，腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)完整，無明顯系膜增生；DN 組足細胞結(jié)構(gòu)大部分受損，足突部分融合，腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)被破壞，系膜出現(xiàn)明顯增生，管腔結(jié)構(gòu)受損，并伴有局灶節(jié)段性硬化；RAPA 組足細胞結(jié)構(gòu)受損程度有所改善，足突融合程度有所改善，腎小球濾過率膜結(jié)構(gòu)基本完整，系膜增生較DN 組顯著改善。結(jié)果表明雷帕霉素可有效保護糖尿病腎病大鼠足細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖1 各組足細胞形態(tài)學變化Fig.1 Morphological changes of podocytes in each group

2.2 各組足細胞增殖水平比較

如圖2 所示，與對照組相比，DN 組細胞增殖水平被明顯抑制（P＜0.01）；與DN 組相比，RAPA組細胞增殖水平明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果表明雷帕霉素可顯著誘導糖尿病腎病大鼠足細胞體外增殖。

2.3 各組足細胞遷移、侵襲水平比較

如圖3 所示，與對照組相比，DN 組細胞遷移、侵襲水平顯著升高（P＜0.001）；與DN 組相比，RAPA 組細胞遷移、侵襲水平顯著降低（P＜0.001）。結(jié)果表明雷帕霉素可顯著抑制糖尿病腎病大鼠足細胞遷移和侵襲能力。

2.4 各組足細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化水平比較

如圖4 所示，與對照組相比，DN 組上皮-間充轉(zhuǎn)標志物E-cadherin 表達顯著下調(diào)，N-cadherin 和Vimentin 表達顯著上調(diào)（P＜0.001）；與DN 組相比，RAPA 組E-cadherin 表達顯著上調(diào)，N-cadherin 和Vimentin 表達顯著下調(diào)（P＜0.001）。結(jié)果表明經(jīng)雷帕霉素處理后糖尿病腎病大鼠足細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化能力被顯著抑制。

圖4 各組足細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化水平差異Fig.4 Comparison of podocyte epithelial-mesenchymal transition in each group

2.5 各組足細胞凋亡水平差異

如圖5 所示，與對照組相比，DN 組細胞凋亡率顯著增加（P＜0.001）；與DN 組相比，經(jīng)雷帕霉素處理后的RAPA 組細胞凋亡率顯著減少（P＜0.001）。結(jié)果表明雷帕霉素可顯著減少糖尿病腎病大鼠足細胞體外凋亡水平，發(fā)揮保護足細胞的作用。

圖5 各組足細胞凋亡水平比較Fig.5 Comparison of podocyte apoptosis in each group

2.6 各組足細胞內(nèi)mTOR信號通路表達比較

如圖6 所示，與對照組相比，DN 組mTOR/S6K1 信號通路被顯著活化（P＜0.001）；與DN 組相比，RAPA 組mTOR 和S6K1 的蛋白表達被顯著抑制（P＜0.01）。結(jié)果表明雷帕霉素對于mTOR/S6K1信號通路有較好的調(diào)控作用，通過活化該通路能夠影響糖尿病腎病大鼠足細胞生物學行為。

圖6 各組足細胞內(nèi)mTOR信號通路表達比較Fig.6 Comparison of mTOR signaling pathway in podocytes of each group

3 討論

糖尿病腎病作為糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一，主要由膜細胞增生、細胞外基質(zhì)增多、腎小球基底膜增厚和硬化引發(fā)患者腎功能障礙，最終導致慢性腎衰竭和終末期腎?。?］，嚴重威脅患者的生命安全。糖尿病腎病的發(fā)病機制較為復雜，糖代謝機制紊亂、血流動力學異常、遺傳易感因素和多種基因表達的失衡均會導致糖尿病腎病的發(fā)病風險增加［10］。研究表明，當腎臟中存在大量復合物沉積時，足細胞受到損傷，表面負電荷發(fā)生變化，引起腎小球損傷，并進一步進展為糖尿病腎?。?1］，因此，探究糖尿病腎病足細胞生物學行為及其變化對明確糖尿病腎病的發(fā)病機制和制定有效的治療策略十分關(guān)鍵。本研究基于mTOR 信號通路探究足細胞生物學行為，采用mTOR 通路靶向抑制劑雷帕霉素處理糖尿病腎病大鼠足細胞，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素對模型大鼠足細胞有較好的保護作用。

雷帕霉素是進化保守的蛋白激酶家族成員之一，也是現(xiàn)階段臨床常用的器官移植后抗排異的有效藥物［12］，可與其靶蛋白mTOR 分子特異性結(jié)合，靶向抑制mTOR 的表達，影響細胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯、核糖體合成，進而調(diào)控細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、自噬等細胞周期［13］。Gao 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素通過抑制mTOR 信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進而抑制心肌梗死后大鼠H9c2 心肌細胞凋亡，誘導細胞自噬，抑制心臟重塑，改善心功能。Liu等［15］也發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可與mTOR 激酶特異性結(jié)合，抑制mTOR 通路的活性，調(diào)節(jié)糖尿病腎病大鼠腎組織細胞病理自噬過程，發(fā)揮改善蛋白尿和腎功能的作用。本研究通過鏈脲霉素腹腔注射構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，取出足細胞后以雷帕霉素進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可顯著誘導足細胞體外增殖，抑制細胞遷移、侵襲、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和凋亡，發(fā)揮腎小球足細胞保護作用，其機制是通過調(diào)控mTOR 信號通路影響細胞生物學行為實現(xiàn)的。

mTOR 蛋白作為重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞內(nèi)多種信號通路的下游靶點，可調(diào)控下游S6K1、翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白1 等基因，影響機體氧化應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)等過程［16］，調(diào)節(jié)細胞生長因子水平和細胞周期進展，參與介導多種疾病的發(fā)生發(fā)展［17］。S6K1作為mTOR 的重要下游底物之一，可受磷酸化的mTOR分子活化，提高細胞內(nèi)RNA的翻譯、轉(zhuǎn)錄能力，促進細胞內(nèi)多種mRNA 的合成，影響細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等細胞周期［18］。本研究結(jié)果表明，mTOR/S6K1 通路在鏈脲霉素誘導的糖尿病腎病大鼠足細胞內(nèi)被顯著激活，經(jīng)雷帕霉素處理后，mTOR 和S6K1 的表達顯著下調(diào)，發(fā)揮保護模型大鼠足細胞的作用。雷帕霉素通過競爭性結(jié)合FK-結(jié)合蛋白12，并與其形成RPM/FKBP12 復合物，使mTOR 通路失活，阻斷mTOR/S6K1 通 路 的 信 號 轉(zhuǎn) 導［19］，影 響 細 胞 內(nèi)mRNA 翻譯啟動，抑制足細胞遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，避免足細胞功能結(jié)構(gòu)損傷［20］，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，延緩糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生，從而發(fā)揮保護足細胞的作用。

綜上所述，雷帕霉素可顯著促進糖尿病腎病大鼠足細胞的體外增殖，抑制細胞遷移、侵襲、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和凋亡，其調(diào)控機制為雷帕霉素可靶向抑制mTOR，下調(diào)足細胞內(nèi)mTOR 和S6K1 的蛋白表達，發(fā)揮保護足細胞的作用。本研究結(jié)果為臨床治療糖尿病腎病提供了新的分子靶點和生物標志物，值得臨床參考借鑒。