武麗娜， 彭小忠， 魯重美*

1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院消化內科，北京100730；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究所，醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京100730

結直腸癌是威脅人類身體健康的高發(fā)腫瘤，據統(tǒng)計，我國結直腸癌死亡率在所有腫瘤中居第5 位，該病5 年生存率為66.1%，但出現遠處轉移時，患者5 年生存率會降至12.5%［1］。結腸腺瘤-腺癌序列最早是由病理學家Basil 發(fā)現并定義的，此后該序列各步驟發(fā)生發(fā)展的分子機制被逐漸完善［2］，并通過分子遺傳學研究揭示了一些新的癌基因及抑癌基因參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展［3］。人類基因組大約75%的基因可轉錄為RNA，其中僅有約2%的基因與編碼蛋白相關，其余均為非編碼RNA［4］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 nt、無蛋白質編碼功能的RNA 分子，其可以在轉錄水平、轉錄后水平及表觀遺傳水平發(fā)揮作用［4-5］，同時與部分腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關［6-7］。LncRNA 鋅指核轉錄因子反義鏈1（zinc finger nuclear transcription factor antisense RNA 1，ZFAS1）位于20q13，是鋅指核轉錄因子1（zinc finger nuclear transcription factor，Xbox binding 1-type containing 1，ZNFX1）的 反 義RNA，同時也是3 個C/D 盒小核仁RNA（C/D-box snoRNAs，SNORDs），即SNORD12C、SNORD12B及SNORD12 的載體。ZFAS1 包括10 種轉錄本，長度為504~1 075 bp。ZFAS1 的全長尚不清楚，且目前也鮮見對ZFAS1 進行cDNA 末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA ends，RACE）實驗的報道。本研究旨在探討ZFAS1 在結直腸癌中的表達及生物學功能，并以ZNFX1 為切入點，以期明確ZFAS1 在結直腸癌中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2014 年10 月—2015 年7 月于北京協(xié)和醫(yī)院進行結直腸癌手術，且手術病理結果證實為結直腸癌的患者67 例作為研究對象，其中男37例，平均年齡63 歲；女30 例，平均年齡65 歲。統(tǒng)計所有患者的臨床資料及病理資料，并將所有患者結直腸癌標本及配對正常結直腸組織浸入RNA laterTM（Ambion 公司）中，置于?20 ℃冰箱保存。所有患者均對本研究知情并自愿簽署知情同意書，本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 材料

人結腸癌細胞系HT-29、LoVo、SW480、HCT-116、RKO、HCT-8、HCT-15、DLD1及人結腸上皮細胞系CCD841CoN 均購自北京協(xié)和醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心，且均源于美國模式培養(yǎng)物集存庫（https：//www.atcc.org/）。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR（real-time PCR）測定目的基因在結腸癌細胞系中的表達水平 所有組織及細胞均由總RNA 抽提試劑TRIzol（Invitrogen 公司）裂解并提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒（Roche 公司）說明書進行反轉錄，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa公司）說明書進行realtime PCR檢測，引物序列見表1。

表1 ZFAS1和ZNFX1的real-time PCR引物Table 1 The real-time PCR primers of ZFAS1 and ZNFX1

1.3.2 Western blot 實驗測定ZNFX1 在結腸癌細胞系中的表達 裂解結腸癌細胞，根據BCA 蛋白試劑盒（Abcam 公司）說明書檢測蛋白質濃度。蛋白經8%SDS-PAGE 膠分離、轉膜、封閉，分別經一抗（抗ZNFX1抗體或抗β-actin抗體）及二抗孵育，采用增強化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影。利用Image J 軟件計算各蛋白條帶吸光度與β-actin 吸光度的比值，并進行半定量分析。

1.3.3 通過轉染小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）敲低目的基因 根據INTERFERinTM（Polyplus 公司）說明書將siRNA（30 pmol·mL?1）轉染至LoVo、SW480、HCT-116細胞。針對ZFAS1基因的2個siRNA序列見表2。

表2 siRNA序列Table 2 The sequences of siRNA

1.3.4 通過轉染表達載體質粒過表達目的基因 構建ZNFX1 CDS 區(qū)第1~5 757 位的克隆質粒并命名為ZNFX1-1-5757bp，該表達載體質粒包括ZN-FX1 的全長；構建ZNFX1 CDS 區(qū)第1~3 646 位的克隆質粒并命名為ZNFX1-1-3646bp，該表達載體質粒包括ZNFX1 的兩個AAA 結構域。根據Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司）說明書將這兩個表達載體質粒轉染至LoVo、SW480、HCT-116 細胞，從而過表達克隆質粒所攜帶的基因片段。

1.3.5 細胞活力試驗測定結腸癌細胞的增殖能力在96 孔板中將各組細胞以3×103個細胞·孔?1鋪板，根據細胞增殖實驗試劑盒（Promega 公司）說明書，將四氮唑化合物［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS］及電子偶聯劑（phenazine methosulfate，PMS）按體積比20∶1 配制MTS/PMS 溶液，將MTS/PMS 與細胞培養(yǎng)基按體積比為1∶5 加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)4 h。以630 nm 波長處的吸光度值作為校正，分別取5 個時間點（轉染后0、24、48、72、96 h）在490 nm 波長處檢測吸光度，設3 次生物學重復。

1.3.6 平板克隆形成試驗測定結腸癌細胞的增殖能力 在轉染后24 h，在6 孔板中將各組細胞以3×103個細胞·孔?1鋪板，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度（95%）環(huán)境下，靜置培養(yǎng)10~14 d，待各孔中出現肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)，并采用4%多聚甲醛固定，2.5%結晶紫染色，計數每孔克隆數目，設3次生物學重復。

1.3.7 Transwell遷移試驗測定結腸癌細胞的遷移能力 以1×105個細胞·孔?1將各組細胞接種于Transwell上層小室中，小室中加入無血清培養(yǎng)基，在下層小室中加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2孵箱孵育24~48 h，并采用4%多聚甲醛固定，2.5%結晶紫染色，在M205 體視顯微鏡（Leica 公司）下統(tǒng)計遷移到下層小室的細胞數，設3次生物學重復。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以平均數±標準差（x±s）表示，兩獨立樣本間比較采用t檢驗，多組樣本間比較采用One-Way ANOVA 檢驗，兩獨立樣本的四格表資料采用Chi-square 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 ZFAS1 在結直腸癌組織及結腸癌細胞系中的表達水平

如圖1 所示，ZFAS1 在結腸癌細胞系（DLD1、HCT-116、LoVo、HCT-8、HT-29 及RKO）中的相對表達量顯著高于正常結腸上皮細胞系（CCD841 CoN），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ZFAS1 在結直腸癌組織中的相對表達量（0.56±0.09）顯著高于癌旁正常組織（0.23±0.04），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果表明，ZFAS1 在結直腸癌組織及結腸癌細胞系中高表達。

圖1 ZFAS1在結腸癌細胞系和結直腸癌組織中的表達水平Fig.1 The expression levels of ZFAS1 in colorectal cancer cell lines and colorectal cancer tissues

2.2 ZFAS1 在結直腸癌中表達水平與臨床病理學資料的相關性

ZFAS1在結直腸癌組織中相對表達量的中位數為0.35，并以此作為分界值將67 例患者分為高表達組（≥0.35）及低表達組（＜0.35）。由表3可知，高表達組與低表達組在性別、年齡、血癌胚抗原水平、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM 分期比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果表明，ZFAS1 在結直腸癌組織中高表達或低表達與結直腸癌患者的臨床病理學情況無顯著相關性。

表3 ZFAS1的表達與結直腸癌患者的臨床病理資料的相關性Table 3 Correlation between ZFAS1 and clinicopathological data of colorectal cancer patients n(%)

2.3 敲低ZFAS1 對結腸癌細胞的生長及遷移的影響

選取3 株應用廣泛，細胞培養(yǎng)難度低結腸癌細胞系HCT-116、LoVo 及SW480 進行后續(xù)的生物學功能試驗。檢測ZFAS1 siRNAs 轉染結腸癌細胞系的敲低效果，由圖2 可知，與control siRNA 相比，ZFAS1 siRNA1 及ZFAS1 siRNA2 均可顯著下調ZFAS1的表達量（P＜0.05），且ZFAS1 siRNA1的作用更明顯，因此，選用ZFAS1 siRNA1 進行后續(xù)細胞功能學試驗。敲低ZFAS1 后，結腸癌細胞系HCT-116、LoVo 及SW480 的克隆形成數量均少于control siRNA。敲低ZFAS1 后，結腸癌細胞系HCT-116、LoVo 及SW480 的活細胞數量均顯著少于control siRNA（P＜0.05）。敲低ZFAS1 后，結腸癌細胞系HCT-116、LoVo 及SW480 穿過Transwell微孔濾膜的細胞數量均少于control siRNA。結果表明，敲低ZFAS1，結腸癌細胞的生長能力和遷移能力均下降，提示ZFAS1 可以促進結腸癌細胞的生長和遷移。

圖2 敲低ZFAS1對結腸癌細胞的生長及遷移的影響Fig.2 Knockdown effects of ZFAS1 on the growth and migration of colorectal cancer cells

2.4 敲低ZFAS1對ZNFX1表達的影響

由圖3 可知，ZNFX1 在結腸癌細胞系（LoVo、DLD1、HCT-116、SW480、HCT-8）中的相對表達量均低于正常結腸細胞系CCD841CoN。敲低ZFAS1 后，與ZFAS1 相比，ZNFX1 表達水平上調（P＜0.05）。結果表明，ZNFX1 在結腸癌細胞系中低表達，ZFAS1可以負調控ZNFX1的表達水平。

圖3 ZFAS1與ZNFX1表達量的相關性Fig.3 The relationship between the expression level of ZFAS1 and ZNFX1

2.5 過表達ZNFX1 對結腸癌細胞生長及遷移的影響

目前對于ZNFX1 編碼蛋白的晶體結構尚無解析結果，本研究根據蛋白質結構預測在線軟件（http：//smart. embl-heidelberg.de/）對ZNFX1 進行結構域預測：ZNFX1 的肽鏈從N 端到C 端依次是由2 個AAA 結構域及3 個鋅指結構域組成（圖4A）。將兩種表達載體質粒（ZNFX1-1-5757bp和ZNFX1-1-3646bp）分別轉染結腸癌細胞，檢測過表達效果，結果表明，轉染ZNFX1-1-5757bp 的結腸癌細胞中ZNFX1 的表達量高于pcDNA-NC，轉染ZNFX1-1-3646bp的結腸癌細胞在130~180 kD分子量之間出現一條新的條帶，即為構建的ZNFX1-1-3646bp 克隆質粒所表達出的蛋白（圖4B）。過表達ZNFX1-1-5757bp 及ZNFX1-1-3646bp 后，結腸癌細胞系HCT-116、LoVo 及SW480 的活細胞數量顯著少于pcDNA-NC（P＜0.05，圖4C），且結腸癌細胞系HCT-116、LoVo 及SW480 的克隆形成數量少于pcDNA-NC（圖4D）。同時，結腸癌細胞系HCT-116、LoVo 及SW480 穿過Transwell 微孔濾膜的細胞數量少于pcDNA-NC（圖4E）。結果表明，ZNFX1可以抑制結腸癌細胞的生長及遷移，過表達ZNFX1，結腸癌細胞的生長及遷移能力下降，并且ZNFX1的AAA結構域區(qū)段可以獨立發(fā)揮該功能。

圖4 過表達ZNFX1對結腸癌細胞的生長及遷移的影響Fig.4 Proliferation and migration of CRC cells after ZNFX1 overexpression

3 討論

研究表明ZFAS1 在不同腫瘤組織中的表達情況存在差異［8］，如Askarian-amiri 等［9］研究發(fā)現，ZFAS1 在正常乳腺中高表達，在乳腺侵襲性導管腺癌中表達下調；大量研究發(fā)現，ZFAS1 在胃癌［10］、腎透明細胞癌［11］、骨肉瘤［12］中均為高表達。本研究發(fā)現ZFAS1 在結直腸癌組織及結腸癌細胞系中表達升高，并且可以促進結腸癌細胞的生長及遷移，證實ZFAS1 在結直腸癌中具有原癌基因的潛質，這與既往ZFAS1 在結直腸癌中的相關研究結果相符［13］。

ZFAS1在結腸癌細胞中的功能機制多樣，既往研究主要從以下幾個方面進行探索：①ZFAS1 作為內源性競爭性RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）與miRNA 結合，作為“miRNA 海綿”阻斷miRNA 介導的抑癌功能。在宮頸癌中，ZFAS1可與miR-190a-3p結合阻斷miR-190a-3p介導的抑癌功能［14］。在結直腸癌中，ZFAS1作為ceRNAs 可與miR-144［15］、miR-7-5p［16］、miR-150-5p［17］、miR-484［18］等miRNA 結合，促進結直腸癌的增殖及轉移。②ZFAS1是3個SNORDs的載體，既往研究提示，lncRNA 可以通過snoRNA 起到促進腫瘤增殖及轉移的作用，如GAS5基因在結腸癌中的抑癌作用可能與由GAS5衍生的snoRNA相關，且研究表明在DNA損傷信號通路中，p53誘導GAS5snoRNA表達，從而起到促進凋亡并減慢細胞周期的作用［19］。ZFAS1 在結直腸癌中的作用是否與SNORDs 相關尚并不清楚，有待進一步研究。③ZFAS1是ZNFX1的反義RNA，二者“頭對頭”轉錄，ZFAS1及ZNFX1 在小鼠肺、乳腺、腎臟、腦、脾、心、肝、胚胎等組織中均有表達［8］，且在大多數組織中兩者的表達水平存在相關性。在侵襲性導管腺癌中ZFAS1 表達下調，而ZNFX1 表達上調［9］。在結腸癌中ZFAS1的功能是否與ZNFX1相關尚不明確。

本研究發(fā)現，敲低ZFAS1 后，ZNFX1 表達上調，表明ZFAS1 與ZNFX1 在結腸癌細胞系中的表達水平具有相關性，ZFAS1 能夠潛在負調控ZNFX1 的表達。ZNFX1 在結腸癌細胞系中表達下調，表明ZNFX1 在結腸癌細胞及正常結腸細胞中存在差異性表達。細胞功能學試驗證明，ZNFX1可以抑制結腸癌細胞的生長及遷移，提示ZFAS1可能通過抑制ZNFX1 的表達從而起到促進結腸癌細胞增殖及轉移的作用。此外ZNFX1 的肽鏈是由2 個AAA 結構域及3 個鋅指結構域組成。AAA 結構域與一系列細胞活性相關，包括膜融合、蛋白質水解及DNA 復制等［20-21］。鋅指結構域屬于相對較小的蛋白模體，通過指樣結構域識別DNA、RNA、蛋白質及脂質底物等［22］。為確定ZNFX1 哪個區(qū)段在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中起到作用，本研究采用截短法，通過轉染不同結構域區(qū)段的質粒進行生物學功能試驗，證明ZNFX1的AAA結構域區(qū)段可以獨立發(fā)揮抑制結腸癌細胞生長及遷移的功能。

綜上所述，本研究結果表明，ZFAS1在結直腸癌組織及結腸癌細胞系中表達上調，可以促進結腸癌細胞的生長及遷移，即ZFAS1 具有原癌基因的潛質，且ZFAS1 可能通過抑制其潛在靶基因ZNFX1 的表達從而起到促進結腸癌細胞增殖及轉移的作用。但本研究未發(fā)現ZFAS1 的高表達或低表達與結直腸癌患者的臨床病理學資料之間有統(tǒng)計學意義，考慮可能與納入的患者例數較少有關，未來需進一步擴大樣本量評估二者的相關性。另外，本研究發(fā)現ZFAS1 可能通過抑制ZNFX1的表達從而起到促進結腸癌細胞增殖及轉移的作用，但具體的分子機制尚不清楚，未來需進一步完善分子生物學機制研究。