王彩虹， 陳劍飛， 鞠久君， 朱雪潔， 王彩霞*

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所，北京100050；2.濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，煙臺市腫瘤代謝中藥藥理重點實驗室，山東 煙臺264003

腫瘤作為世界上發(fā)病率和死亡率都較高的疾病，已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。肺癌是最常見的腫瘤，也是最致命的腫瘤。根據(jù)全球最新的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，肺癌的發(fā)病率和死亡率均排在第一位［1］。乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌和肝癌都有較高的新發(fā)病率。前列腺癌和結(jié)直腸癌在男性中的發(fā)病率較高，而肝癌和胃癌死亡率較高。對于女性來說，乳腺癌是最常見的腫瘤且死亡率較高。因此，癌癥的預(yù)防和治療是研究者需要面對和解決的重大問題。

丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝方面起著關(guān)鍵作用。作為一種進化上保守的代謝酶，丙酮酸激酶可促進磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）之間的不可逆磷酸反應(yīng)，從而產(chǎn)生磷酸酯和三磷酸腺苷（adenosine trisphosphate，ATP）。在哺乳動物中，存在4 種組織特異性的丙酮酸激酶，分別是PKL、PKR、PKM1 和PKM2［2］。其 中PKM1 和PKM2 是 由PKM基 因 通過可變剪接形成的。PKM2 作為其中一種亞型，主要存在于具有高合成代謝要求的高增殖細(xì)胞中［3］，尤其是腫瘤和胚胎組織中。此外，目前已發(fā)現(xiàn)PKM2 在肺癌［4］、乳腺癌［5］等腫瘤組織中過表達，并作為癌細(xì)胞代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［6］。除此之外，PKM2 還可以充當(dāng)轉(zhuǎn)錄共激活劑，促進癌細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄。

PKM2 的過表達在人類癌癥中被普遍發(fā)現(xiàn)，并與不良的臨床結(jié)果相關(guān)［3，7］。已有研究報道，PKM2可以調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤中NEK2的表達，表明它可以作為預(yù)后標(biāo)記［8］。在多發(fā)性骨髓瘤患者中，預(yù)后不佳與PKM2基因表達水平較高相關(guān)［9］。高腫瘤細(xì)胞代謝活性和增殖能力由PKM2 反射，因此它可作為非有機分子標(biāo)記［3］。此外，一些PKM2 也通過癌細(xì)胞壞死和腫瘤細(xì)胞更新釋放到鄰近組織，有望用于癌癥的早期診斷?；颊哐貉h(huán)中的PKM2 水平可作為各種癌癥［10］的潛在診斷標(biāo)記。PKM2 在許多方面影響癌細(xì)胞的代謝活動。因此，PKM2 可以作為癌癥治療的靶標(biāo)。一些研究表明，當(dāng)shRNA 和miRNA 干擾PKM2 的表達時，這兩種情況都會導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡、代謝活性降低和腫瘤減少［11-12］。其他幾項研究表明，當(dāng)shRNA 干擾PKM2 表達時，腫瘤細(xì)胞對某些藥物（如多克他塞爾和順鉑）的敏感性增加，從而促進腫瘤組織死亡和腫瘤的減少［13-14］。然而，PKM2能否成為廣譜的腫瘤標(biāo)志物及其對腫瘤影響的機制尚不清楚。

本研究旨在對PKM2 在不同瘤種的腫瘤組織和正常組織的表達量進行分析，探索其與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，并檢測其對腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。同時通過Hsp90α 的分泌和EMT 相關(guān)蛋白表達水平的檢測，探索PKM2 調(diào)控腫瘤的分子機制，以期為腫瘤治療提供新的診斷標(biāo)志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肺癌細(xì)胞A549、小鼠黑色素瘤細(xì)胞F0 和F10 均購自國家生物醫(yī)學(xué)實驗細(xì)胞資源庫。所有細(xì)胞均用RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640 或 者DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培養(yǎng)，其中加入10%的胎牛血清、100 U·mL?1的青霉素和100 μg·mL?1的鏈霉素。細(xì)胞在37 ℃含有5%CO2的恒溫細(xì)胞箱中培養(yǎng)。其中RPMI-1640和DMEM購自中國維森特公司，胎牛血清購自美國GIBCO公司。

PKM2 抗體、E-cadherin 抗體、N-cadherin 抗體以及Vimentin 抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；Hsp90α抗體購自Abcam公司；βactin 抗體以及HRP 偶聯(lián)抗兔和抗小鼠IgG 均購自中國中杉金橋公司；免疫印跡化學(xué)發(fā)光液購自Santa cruz 公司；PVDF 膜以及Transwell 小室購自Millipore 公司；Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物公司；細(xì)胞增殖檢測試劑盒CCK8（Cell Counting Kit-8）購自Dojindo 公司；Turbo 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司；PCR 引物合成和測序在睿博生物有限公司完成。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

通過GEPIA網(wǎng)站（http：//gepia.cancer-pku.cn/）對TCGA 數(shù)據(jù)庫中33 種腫瘤（表1）患者腫瘤組織和正常組織PKM2 的mRNA 水平進行分析，并分析該基因的表達水平與癌癥患者預(yù)后的總體生存率的關(guān)系。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中腫瘤中英文名稱及縮寫Table 1 The name and abbreviation of tumor in TCGA database

1.3 慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

通過慢病毒感染的方法構(gòu)建PKM2 敲低A549 細(xì)胞系。將包裝質(zhì)粒psPAX2、pVSVG 和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLKO.1 共同轉(zhuǎn)染到HEK-293T 細(xì)胞中，shRNA 序列為5'-CCGGGTTCGGAGGTTTGATGA AATCCTCGAGGATTTCATCAAACCTCCGAACTTTT TTG-3'。72 h后，收集病毒，用0.45 μm濾膜過濾，加入到A549細(xì)胞中。用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，向細(xì)胞中加入嘌呤霉素進行篩選。將pkm2構(gòu)建到pcDNA3.1 載體中。當(dāng)細(xì)胞密度達到80%時，用turbo 試劑進行轉(zhuǎn)染。以pcDNA3.1 空質(zhì)粒作為對照。

1.4 免疫印跡

將不同處理組的細(xì)胞收集后，加蛋白上樣緩沖液裂解并沸水浴煮10 min，進行SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，牛奶室溫封閉后，加一定比例稀釋的一抗室溫孵育2 h，洗膜后，加入對應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光液進行顯影。

1.5 細(xì)胞增殖實驗

收集對照組和過表達PKM2 的細(xì)胞后，種植等量的細(xì)胞到96孔板中，每組8個重復(fù)，細(xì)胞生長48 h后，棄上清，加入稀釋好的CCK8溶液，37 ℃培養(yǎng)2 h后，450 nm吸光度下測定細(xì)胞生長情況。

1.6 Transwell 實驗

將細(xì)胞收集后，進行計數(shù)，按照每孔200 μL約5×104個的細(xì)胞進行稀釋。在24 孔板的下層加入600 μL 的培養(yǎng)基，上層放置Transwell 小室，每個小室中加入200 μL 稀釋好的細(xì)胞懸液。每組進行3 個重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)18 h 后，取出24 孔板，將細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定。之后結(jié)晶紫染色，將小室上方的細(xì)胞用棉簽擦去，顯微鏡下觀察遷移的細(xì)胞，并進行計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究中的數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（xˉ±SD），所有的免疫印跡、細(xì)胞增殖和遷移實驗均進行至少3次重復(fù)。不同組別的比較通過GraphPad軟件的非配對t檢驗完成。使用Kaplan-Meier 方法構(gòu)建生存曲線，通過Log-rank（Mantel-Cox）檢驗不同組之間的差異。P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PKM2 在腫瘤組織和正常組織中的表達情況

根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)庫分析不同瘤種中PKM2 在腫瘤組織和癌旁正常組織的表達量發(fā)現(xiàn)，在乳腺浸潤癌、宮頸鱗癌和腺癌、結(jié)腸癌、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞肝癌、肺鱗癌、卵巢漿液性囊腺癌、胰腺癌、直腸腺癌、皮膚黑色素瘤、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮肉瘤等15 種腫瘤中，PKM2 的mRNA 表達量明顯高于正常組織（圖1A，P＜0.05）。

此外，本研究利用免疫印跡的方法檢測了PKM2 在不同惡性程度黑色素瘤細(xì)胞F0 和F10 中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PKM2 在惡性程度高的F10 細(xì)胞中表達量顯著高于惡性程度低的F0 細(xì)胞（圖1B）。

圖1 PKM2在不同腫瘤中的表達情況Fig.1 The expression of PKM2 in different tumors

2.2 PKM2對癌癥患者生存的影響

為了明確PKM2 對不同腫瘤患者生存的影響，本研究利用TCGA 數(shù)據(jù)集中的不同腫瘤數(shù)據(jù)集進行生存分析。分析結(jié)果顯示，PKM 的表達水平在宮頸鱗癌和腺癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、急性髓細(xì)胞樣白血病、肝細(xì)胞肝癌、肺腺癌、間皮瘤、胰腺癌、葡萄膜黑色素瘤等腫瘤中對生存時間有顯著影響（圖2），總體上，高表達PKM2 使得腫瘤患者的生存時間縮短。

圖2 PKM2的表達與不同腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 The relationship of expression of PKM2 and the prognosis of different tumor patients

2.3 過表達PKM2 對肺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

為了證明PKM2 對腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，本研究在A549 細(xì)胞中過表達PKM2（圖3A），利用CCK8 檢測過表達PKM2 對A549 細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達PKM2 能夠顯著增加A549的增殖能力（圖3B）。利用Transwell 檢測PKM2 對肺癌細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達PKM2 能夠顯著增強A549 細(xì)胞的遷移能力（圖3C~D）。

圖3 過表達PKM2對肺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響Fig.3 The effect of PKM2 overexpression on the proliferation and migration of lung cancer cells

2.4 PKM2對Hsp90α分泌的影響

利用免疫印跡檢測PKM2 對Hsp90α 分泌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MCF-7以及肺癌A549中過表達PKM2 后，胞內(nèi)的Hsp90α 無明顯變化，然而胞外Hsp90α 顯著上調(diào)（圖4）。這些結(jié)果表明，PKM2 能夠促進乳腺癌和肺癌中的Hsp90α 的分泌。

圖4 過表達PKM2對Hsp90α分泌的影響Fig.4 The effect of PKM2 overexpression on the secretion of Hsp90α

2.5 PKM2對EMT相關(guān)蛋白的影響

此外，利用前期構(gòu)建的PKM2 敲低細(xì)胞系［15］，用免疫印跡的方法檢測PKM2 對EMT 相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果顯示，敲低PKM2 后，A549細(xì)胞中的E-cadherin 明顯上調(diào)，而N-cadherin、Vimentin 明顯下調(diào)（圖5）。這些結(jié)果證明PKM2 能夠通過影響EMT 相關(guān)蛋白的表達促進腫瘤的發(fā)展。

圖5 敲低PKM2對EMT的影響Fig.5 Effect of PKM2 knockdown on EMT

3 討論

腫瘤的發(fā)展是一個十分復(fù)雜的過程，涉及到基因表達的改變。因此，研究腫瘤中基因的異常表達對尋找腫瘤標(biāo)志物及治療靶點具有重要意義。盡管不同腫瘤的免疫化學(xué)染色實驗揭示了PKM2 在多種腫瘤組織中的存在。多項研究表明PKM2 在結(jié)直腸癌患者中表達上調(diào)［16-18］。但其是否能作為廣譜的腫瘤標(biāo)志物及靶點并不清楚，且其作用機制也有待于進一步研究。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，PKM2 在肺癌的表達水平顯著高于正常組織，且胞外PKM2 可以作為肺癌的診斷標(biāo)志物［15］。本研究中，我們利用TCGA 數(shù)據(jù)庫分析了PKM2 在33 種腫瘤中的表達量，發(fā)現(xiàn)其中包括肺癌在內(nèi)的15 種腫瘤中PKM2 的表達水平顯著高于正常組織，并且其中9 種腫瘤中，PKM2 的表達與生存顯著相關(guān)。此外，本研究還檢測了不同惡性程度的小鼠黑色素瘤細(xì)胞中PKM2 的表達，結(jié)果顯示，惡性程度高的黑色素瘤細(xì)胞中的PKM2水平顯著高于惡性程度低的黑色素瘤細(xì)胞。因此，本實驗結(jié)果為PKM2 成為廣譜的腫瘤標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。

大量的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞會主動釋放出大量的外泌體、凋亡小體或微粒體，以便與微環(huán)境進行交流，從而促進腫瘤的惡性進展。這些胞外小泡在腫瘤細(xì)胞的快速發(fā)展［19-20］中起著至關(guān)重要的作用。有研究報道，PKM2 通過磷酸突觸體相關(guān)蛋白質(zhì)23 促進外泌體的釋放，該過程反過來又促進了SNARE 復(fù)合體的形成［20］。Hsp90α 作為一個重要的分子伴侶蛋白，已經(jīng)被廣泛報道參與腫瘤的發(fā)展［21-22］。近期我們與其他團隊合作的研究顯示，Hsp90α 能夠通過外泌體的形式被分泌到胞外［22］。且胞外Hsp90α 能夠促進腫瘤的惡性進展［23-24］。在該研究中，我們發(fā)現(xiàn)PKM2 能夠促進Hsp90α 的分泌。我們前期的研究證明，敲低PKM2 能夠抑制A549 腫瘤細(xì)胞的遷移能力［15］。在本研究中，進一步證明了過表達PKM2 能夠促進腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。因此，PKM2 可以通過調(diào)控Hsp90α的分泌從而促進腫瘤的進展。

增長的證據(jù)表明轉(zhuǎn)移的一個顯著特點是上皮到間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchgmal transition，EMT）。EMT 蛋白水平的變化，包括E-cadherin 的降低，以及N-cadherin 和Vimentin 的升高，都可以提示腫瘤細(xì)胞EMT 的發(fā)生，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移［25］。有研究報道PKM2 進入核內(nèi)后會抑制上皮細(xì)胞鈣粘蛋白（E-cadherin）的活性［26］。在細(xì)胞核中，PKM2 與TGIF2 相結(jié)合，將HDAC 帶到CDH1基因的啟動子區(qū)，導(dǎo)致組蛋白H3 的脫乙?；约熬幋aE-cadherin 的CDH1基因表達的降低。因此，E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄被抑制，導(dǎo)致EMT 的喪失，從而促進細(xì)胞入侵和轉(zhuǎn)移［27］。本研究中，在肺癌細(xì)胞中敲低PKM2后，發(fā)現(xiàn)E-cadherin的表達量增加，同時檢測到N-cadherin和Vimentin表達量降低。同樣證明了PKM2 可能通過調(diào)控E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 的表達影響肺癌細(xì)胞的EMT過程，從而影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)15 種腫瘤組織的PKM2表達量高于正常組織，且9種腫瘤的生存率與PKM2 的表達量顯著相關(guān)。因此，為PKM2 成為一個廣譜的腫瘤標(biāo)志物提供了理論依據(jù)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)高表達PKM2 可以促進肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，且過表達PKM2 能夠促進Hsp90α的分泌及EMT 的抑制，揭示了PKM2 促進腫瘤進展的新機制。PKM2促進Hsp90α的分泌機制還有待于進一步研究。PKM2 能否成為廣譜的腫瘤標(biāo)志物還需要加大樣本進行臨床試驗。總之，本研究為PKM2 作為廣譜腫瘤標(biāo)志物提供了進一步的證據(jù)，為靶向PKM2的治療提供了新的理論依據(jù)。