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        聚兩性電解質(zhì)作冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用及進(jìn)展

        2022-05-28 02:38:58牛文雅占太杰胥義
        制冷技術(shù) 2022年1期

        牛文雅,占太杰,胥義

        (上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所,上海 200093)

        0 引言

        生物樣本庫(kù)的建設(shè)是推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展的重要基石之一[1-4],而低溫保存被認(rèn)為是高質(zhì)量保存生物樣本的重要措施[5-8]。特別是低溫生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域自20世紀(jì)70年代以來(lái),諸多研究團(tuán)隊(duì)深入研究了生物樣本降溫冷凍、貯藏、復(fù)溫以及臨床使用過(guò)程中存在的關(guān)鍵問(wèn)題,如凍融過(guò)程中冰的形成和生長(zhǎng)導(dǎo)致的機(jī)械性損傷以及細(xì)胞內(nèi)/外溶質(zhì)濃度的改變導(dǎo)致的滲透性損傷等[9-10]。在生物樣本低溫保存過(guò)程中添加低溫保護(hù)劑(Cryoprotective Agent,CPA),可以減少相關(guān)損傷,顯著提高樣本存活率,使生物樣本實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的長(zhǎng)期保存[11-12]。

        根據(jù)穿透細(xì)胞膜的能力,常用CPA可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性保護(hù)劑多為小分子中性物質(zhì),如二甲基亞砜(DMSO)[13-15]、乙二醇[16]和甘油等,但這些可快速透過(guò)細(xì)胞膜的保護(hù)劑有一定的基因毒性,會(huì)造成細(xì)胞的DNA等遺傳物質(zhì)受到損傷。因此大多需要解凍后立即將其去除[17];非滲透性保護(hù)劑多為小分子糖類或大分子物質(zhì),如蔗糖[18-20]、羥乙基淀粉(HES)[21-22]、聚乙烯咯烷酮(PVP)[23-25]和抗凍蛋白(AFPs)[26-27]等,但這類保護(hù)劑不能透過(guò)細(xì)胞膜,可在胞外發(fā)揮作用,抑制冰晶生長(zhǎng),誘導(dǎo)胞內(nèi)脫水,使得胞內(nèi)濃度提高,實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)玻璃化,一般與滲透性保護(hù)劑共同使用,可以減輕單一類型CPA對(duì)細(xì)胞的傷害、顯著提高細(xì)胞復(fù)溫后的存活率[28]。

        近年來(lái),圍繞著低毒性、高效率CPA的開(kāi)發(fā)已成為生物樣本保存的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[29]。2009年,MATSUMURA等[30]首次報(bào)道了一種聚兩性電解質(zhì)羧化聚賴氨酸(COOH-PLL),該物質(zhì)有較低的細(xì)胞毒性和較高的冷凍保存效率,且與各種類型的細(xì)胞相容性較好,已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了紅細(xì)胞[31]、人肺癌細(xì)胞(A549)[32]、小鼠胚胎[33]等樣本的冷凍保存,展現(xiàn)出了較大的應(yīng)用前景。但對(duì)于聚兩性電解質(zhì)作為冷凍保護(hù)劑的相關(guān)作用機(jī)制尚在探索中。

        本文將介紹聚兩性電解質(zhì)現(xiàn)有的分類合成方法,闡述其在冷凍保存過(guò)程中潛在的低溫保護(hù)機(jī)制,并討論其作為一種新型CPA在低溫保存中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

        1 聚兩性電解質(zhì)分類及合成方法

        聚兩性電解質(zhì)也稱兩性聚電解質(zhì)[34],是由帶正電和負(fù)電的單體亞基組成的聚合物體系。它們既可以是電中性的,也可以是帶有正或負(fù)電荷的[35]。這些帶電基團(tuán)之間的分子間和分子內(nèi)離子相互作用會(huì)影響聚兩性電解質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[36]。依據(jù)它們?cè)谒芤褐袑?duì)pH變化的響應(yīng)強(qiáng)弱(弱基團(tuán)對(duì)pH變化的響應(yīng)更大),聚兩性電解質(zhì)存在4個(gè)亞類[37](圖1)。已知的天然兩性電解質(zhì)包括蛋白質(zhì)和多肽[38],電荷沿著其組成的一級(jí)結(jié)構(gòu)以序列定義的模式分布。但對(duì)于人工合成的聚兩性電解質(zhì),電荷可以以無(wú)序或統(tǒng)計(jì)方式分布[39]?,F(xiàn)階段聚兩性電解質(zhì)一般由聚兩性電解質(zhì)單體組成。而通過(guò)兩性離子單體的聚合、引入疏水/親水基團(tuán)或者聚合后的修飾[40]等多種方法即可制備不同的聚兩性電解質(zhì)單體(圖2),如:逐步生長(zhǎng)聚合(Step-growth)[41-42]、自由基聚合(Free Radical Polymerization,F(xiàn)RP)[43]、可逆失活自由基聚合(Reversible Deactivation Radical Polymerization,RDRP)[44-45]和開(kāi)環(huán)易位聚合(Ring-Opening Metathesis Polymerization,ROMP)[46]等。隨著對(duì)各種合成方法的深入研究,可以聚合得到更多結(jié)構(gòu)不同的聚兩性電解質(zhì),大大拓展了其在納米醫(yī)學(xué)[47]、材料科學(xué)[48]、催化[49]和海洋應(yīng)用[50]等方面的推廣和使用。

        圖1 聚兩性電解質(zhì)的4個(gè)亞類的代表性結(jié)構(gòu)

        圖2 應(yīng)用各種合成技術(shù)聚合成的聚兩性電解質(zhì)單體

        2 聚兩性電解質(zhì)的冷凍保護(hù)機(jī)制探索

        聚兩性電解質(zhì)作為一種低毒性的新型CPA,已經(jīng)成功用于小鼠成纖維細(xì)胞L929[51]、不同類型干細(xì)胞[52]、血液中紅細(xì)胞[53-54]等樣本的低溫保存。而深入探究其在低溫保存過(guò)程中的冷凍保護(hù)機(jī)制,將有助其推廣應(yīng)用于細(xì)胞工程和組織工程等領(lǐng)域?,F(xiàn)階段,聚兩性電解質(zhì)作為CPA的保護(hù)機(jī)制主要包括冰重結(jié)晶抑制活性、與細(xì)胞膜的相互作用、在細(xì)胞周圍形成緩沖區(qū)域3種不同的假說(shuō)。

        2.1 冰重結(jié)晶抑制活性假說(shuō)

        細(xì)胞冷凍保存后復(fù)溫的過(guò)程中,冰晶的再生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致膜破裂和脫水,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[55]。有研究表明可以利用冰重結(jié)晶抑制劑來(lái)控制該過(guò)程。如自然界廣泛存在的、具有較高熱滯活性、能改變冰晶生長(zhǎng)特性和抑制冰晶重結(jié)晶的蛋白質(zhì),即抗凍(糖)蛋白(AF(G)Ps)[56-57]。受AF(G)Ps啟發(fā)[58],MITCHELL等[59]在2014年首次對(duì)聚兩性電解質(zhì)的冰重結(jié)晶抑制(IRI)活性進(jìn)行定量研究。通過(guò)對(duì)聚甲基丙烯酸氨基乙酯后聚合改性、然后與琥珀酸酐反應(yīng)生成聚兩性電解質(zhì),結(jié)果顯示出較強(qiáng)的IRI活性,可以很大程度上降低細(xì)胞等樣本在復(fù)溫過(guò)程中冰重結(jié)晶風(fēng)險(xiǎn)。為了直觀了解聚兩性電解質(zhì)的IRI活性,STUBB等[60]對(duì)比了聚兩性電解質(zhì)與PBS緩沖劑在顯微鏡下的冰晶尺寸。結(jié)果顯示聚兩性電解質(zhì)的平均晶粒尺寸更小,顯示出在抑制冰晶生長(zhǎng)方面有較好的作用。盡管如此,聚兩性電解質(zhì)的IRI活性仍小于AF(G)Ps,說(shuō)明冰重結(jié)晶活性可能并不是聚兩性電解質(zhì)冷凍保護(hù)機(jī)制的主要原因,但利用AF(G)Ps的結(jié)構(gòu)進(jìn)行新型聚兩性電解質(zhì)的合成,可能提高其冰重結(jié)晶抑制活性,從而實(shí)現(xiàn)更高效率的樣本保存。

        2.2 與細(xì)胞膜的相互作用假說(shuō)

        盡管IRI活性是決定整個(gè)凍存體系防凍能力的重要參數(shù)之一,但在保存生物樣本時(shí),聚兩性電解質(zhì)如何與生物樣本相互作用可能更加關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞在聚兩性電解質(zhì)溶液中冷凍時(shí),聚兩性電解質(zhì)分子會(huì)附著在細(xì)胞膜上[62],維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,并且這種作用隨著聚合物濃度的增加以及疏水性基團(tuán)的引入而增強(qiáng)[63],如圖3所示。

        圖3 聚兩性電解質(zhì)與細(xì)胞膜相互作用[63]

        CROWE等[64]發(fā)現(xiàn)海藻糖或蔗糖等物質(zhì)可以穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),降低其從凝膠態(tài)到液晶態(tài)的相變溫度。RAJAN等[63]研究了聚兩性電解質(zhì)與細(xì)胞的相互作用,利用差示掃描量熱儀(Differential Scanning Calorimeter,DSC)獲得聚兩性電解質(zhì)存在時(shí)脂質(zhì)的熱譜圖,發(fā)現(xiàn)聚兩性電解質(zhì)同樣也可以降低了磷脂膜的雙層凝膠-液晶的轉(zhuǎn)變溫度,并且隨著聚兩性電解質(zhì)濃度的增加,轉(zhuǎn)變溫度下降的越明顯。為了進(jìn)一步證明其與膜的相互作用方式,采用電子自旋共振(Electron Spin-resonance Spectroscopy,ESR)光譜,通過(guò)探針對(duì)膜磷脂雙分子層進(jìn)行旋轉(zhuǎn)標(biāo)記,研究聚兩性電解質(zhì)對(duì)膜極性區(qū)域的影響,發(fā)現(xiàn)具有明顯冷凍保護(hù)特性的聚兩性電解質(zhì)會(huì)與膜的外表面相互作用,這種相互作用可以保護(hù)膜免受各種冷凍誘導(dǎo)的破壞。據(jù)此,這種與細(xì)胞膜的強(qiáng)烈相互作用被諸多研究者看作聚兩性電解質(zhì)冷凍保護(hù)機(jī)制一個(gè)重要組成部分。

        2.3 細(xì)胞周圍形成緩沖區(qū)域假說(shuō)

        除了冰重結(jié)晶抑制活性、膜保護(hù)機(jī)制外,還有一種觀點(diǎn)認(rèn)為:聚兩性電解質(zhì)在細(xì)胞周圍形成富含聚合物的液相,在細(xì)胞周圍提供無(wú)冰的局部環(huán)境,并促進(jìn)細(xì)胞脫水以抑制細(xì)胞內(nèi)的冰晶[65]。解凍過(guò)程中,聚合物的液相區(qū)域融化速度快,細(xì)胞被濃縮的聚合物溶液包圍覆蓋,從而在細(xì)胞和剩余的冰之間形成了一個(gè)緩沖區(qū),這個(gè)緩沖區(qū)可以減小重結(jié)晶帶來(lái)的細(xì)胞損傷(圖4)。因此,這種作用機(jī)制可能賦予了聚兩性電解質(zhì)高效的冷凍保存效率。

        圖4 細(xì)胞周圍形成緩沖區(qū)域[65]

        3 聚兩性電解質(zhì)冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用

        聚兩性電解質(zhì)具有補(bǔ)充或替代DMSO和其他冷凍保護(hù)劑(例如非滲透性CPA)的潛力。前期關(guān)于聚兩性電解質(zhì)在冷凍保存方面的工作都集中于琥珀酸酐改性的羧化聚賴氨酸[30](COOH-PLL),因其優(yōu)良的低溫保存特性,逐漸吸引了更多的研究人員開(kāi)發(fā)了一系列的聚兩性電解質(zhì)用作CPA,將它們單獨(dú)使用或與其他CPA結(jié)合使用時(shí)都能提高樣本的存活效率,如表1所示。

        表1 其它聚兩性電解質(zhì)作為冷凍保護(hù)劑

        3.1 聚兩性電解質(zhì)在冷凍保存中的應(yīng)用

        3.1.1 第一種用作保護(hù)劑的聚兩性電解質(zhì)

        2009年,MATSUMURA等[30]首次發(fā)現(xiàn)在保存L929細(xì)胞時(shí),通過(guò)合成COOH-PLL(制備路線如圖5所示)用作CPA可以實(shí)現(xiàn)良好的保存效果,且表現(xiàn)出比DMSO更高的冷凍保存效率和更低的細(xì)胞毒性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),COOH-PLL的保護(hù)效果與其正負(fù)基團(tuán)比例相關(guān)(如表2),當(dāng)其正負(fù)基團(tuán)擁有適量比例且羧基略多時(shí)IRI活性最高,冷凍保存效果最好,這說(shuō)明聚兩性電解質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)保護(hù)效果至關(guān)重要。另有文獻(xiàn)[62]證明COOH-PLL不會(huì)影響細(xì)胞的表型特征和后續(xù)增殖能力,細(xì)胞在-80 ℃冰箱凍存24個(gè)月,解凍后仍能保持其良好的存活和增殖能力。對(duì)于部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存,如牛卵丘細(xì)胞[66]、人真皮成纖維細(xì)胞等[67],選用COOH-PLL作為單一型CPA可實(shí)現(xiàn)其低溫保存。

        圖5 羧化聚賴氨酸(COOH-PLL)制備路線[30]

        表2 使用不同羧基/氨基比例的COOH-PLL保存,解凍后的L929細(xì)胞活力

        而對(duì)于豬胚胎、胰島等大型樣本的低溫保存,COOH-PLL單一型CPA效果并不理想。若此時(shí)將COOH-PLL與其他CPA(乙二醇、甘油和葡聚糖等)結(jié)合使用,保存效率則會(huì)有明顯的提升。表3所示為COOH-PLL單一使用或與其他CPA結(jié)合使用時(shí)保存各類細(xì)胞的研究進(jìn)展。

        表3 COOH-PLL作為冷凍保護(hù)劑

        1.3.2 其余物質(zhì)為前體的聚兩性電解質(zhì)

        COOH-PLL展現(xiàn)了出色的保護(hù)效果,但制備COOH-PLL所需的前體聚賴氨酸較為昂貴。于是MITCHELL等[54]利用一種低成本的共聚物,即馬來(lái)酸酐作為前體,通過(guò)自由基聚合反應(yīng)生成1∶1正負(fù)電荷比的聚兩性電解質(zhì)。并且證明這種聚兩性電解質(zhì)顯示出特定的IRI活性,與羥乙基淀粉共同使用時(shí)可以顯著提高冷凍保存后紅細(xì)胞的存活率。通過(guò)自由基聚合反應(yīng)合成的聚兩性電解質(zhì)高效且成本低廉,但無(wú)法控制聚合物的分子量及其分散性。BALLEY等[53]同樣基于馬來(lái)酸酐共聚物為前體開(kāi)發(fā)了一種的新型區(qū)域規(guī)則性的聚合物,這種聚兩性電解質(zhì)與DMSO相比,不僅可以使解凍后的A549細(xì)胞存活率達(dá)89%以上,而且還可以使更弱的細(xì)胞系,如小鼠腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(Neuro-2a)和小鼠顱骨成骨細(xì)胞(MC-3T3)存活率提高三倍。另外,ZHAO等[65]合成以丙烯酰胺基為前體合成的三元聚兩性電解質(zhì)(PDA30與PDA45),材料同樣易得、且水解穩(wěn)定,合成步驟簡(jiǎn)單。但這種新型的保護(hù)劑顯示出分子結(jié)構(gòu)和分子量的依賴性,僅當(dāng)分子量為49 kDa的PDA30表現(xiàn)出與10%DMSO相近的低溫保護(hù)效果。然而,僅使用丙烯酰胺基為前體的聚兩性電解質(zhì)作為CPA保存后的細(xì)胞,經(jīng)過(guò)24 h后存活率會(huì)略微降低。但若是將2%的DMSO加入到10%丙烯酰胺基為前體的聚兩性電解質(zhì)中,可顯著改善細(xì)胞存活率。

        RAJAN等[61]利用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)的方式,以甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)為前體合成了一種聚兩性電解質(zhì)。這種新型的聚兩性電解質(zhì)可以將凍融后L929細(xì)胞的存活率提高到90%以上。與此同時(shí),少量疏水性基團(tuán)的引入可以顯著提高它們的低溫保護(hù)性能。其中可能的原因是疏水度的增加導(dǎo)致冰晶尺寸減小[64]。但引入疏水性基團(tuán)增加低溫保存效率不是通用的。ZHAO等[65]將疏水性基團(tuán)結(jié)合到聚兩性電解質(zhì)中,期望進(jìn)一步提高細(xì)胞存活率。但是發(fā)現(xiàn)隨著疏水性基團(tuán)濃度增加細(xì)胞存活率反而下降??赡艿脑蚴蔷蹆尚噪娊赓|(zhì)在較高的疏水含量下,聚合物鏈的溶劑化減弱導(dǎo)致結(jié)構(gòu)塌陷。其中大部分疏水基團(tuán)都在塌縮的螺旋內(nèi),無(wú)法發(fā)揮作用。從而導(dǎo)致對(duì)冰晶的抑制作用較弱。因此疏水性基團(tuán)的引入如何改善聚兩性電解質(zhì)的冷凍保護(hù)活性仍需要進(jìn)一步研究。

        通過(guò)不同前體物質(zhì)的探索,應(yīng)用到不同生物樣本中,聚兩性電解質(zhì)作為CPA表現(xiàn)出良好的低溫保存效果,盡管部分聚兩性電解質(zhì)暫時(shí)不能完全代替DMSO作為冷凍保護(hù)劑,但是通過(guò)與其他類型的CPA聯(lián)合使用,有望實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)含DMSO型保護(hù)劑替代使用。

        3.2 聚兩性電解質(zhì)CPA的新型使用方法

        傳統(tǒng)聚兩性電解質(zhì)作為CPA使用時(shí),通過(guò)直接溶解在水溶液中制得CPA溶液體系,再加載到生物樣本中進(jìn)行低溫保存,但是通過(guò)化學(xué)合成方法,利用聚兩性電解質(zhì)內(nèi)部帶電荷的官能團(tuán)之間的離子交聯(lián)形成的聚兩性電解質(zhì)水凝膠,表現(xiàn)出良好的生物相容性[72]與多功能性,且在控制藥物釋放、調(diào)控降解過(guò)程以及定標(biāo)靶向位置等方面顯示出較大的應(yīng)用價(jià)值[73]。

        聚兩性電解質(zhì)水凝膠也可作為低溫保存載體,用于細(xì)胞生物樣品的低溫保存。2013年,JAIN等[74]利用點(diǎn)擊化學(xué)法開(kāi)發(fā)出一種基于葡聚糖的聚兩性離子水凝膠(圖6),用于在冷凍保存之前封裝細(xì)胞形成構(gòu)建體。這種基于葡聚糖的聚兩性電解質(zhì)水凝膠可將L929細(xì)胞存活率提高到90%,并且無(wú)需同時(shí)加載其他CPA。但這種水凝膠只對(duì)懸浮細(xì)胞顯現(xiàn)出良好的保護(hù)效果,在保存單層細(xì)胞或者厚度較大的樣品時(shí)效果不佳。除了利用點(diǎn)擊化學(xué)法制備的聚兩性電解質(zhì)水凝膠,JAIN等[75]利用聚兩性電解質(zhì)與鋰皂石之間相互作用,將解凍后載有聚兩性電解質(zhì)的細(xì)胞與適量的皂石混合形成智能水凝膠,用于特定部位的細(xì)胞遞送和組織修復(fù)。細(xì)胞在這種水凝膠系統(tǒng)中凍融后仍能存活,使用時(shí)無(wú)需洗脫CPA。因此有希望使其成為長(zhǎng)期儲(chǔ)存系統(tǒng)和合適的現(xiàn)成組織工程產(chǎn)品。

        圖6 聚兩性電解質(zhì)水凝膠用于細(xì)胞包封和冷凍保存[74]

        聚兩性電解質(zhì)水凝膠在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中有巨大潛力[76]。盡管聚兩性電解質(zhì)水凝膠在CPA中的應(yīng)用較少,但未來(lái)可研究該系統(tǒng)是否可以應(yīng)用于更復(fù)雜的細(xì)胞或組織中、或者通過(guò)與其他相關(guān)技術(shù)手段相結(jié)合,進(jìn)一步發(fā)揮其在低溫保存應(yīng)用中的價(jià)值。

        4 結(jié)論

        本文介紹了聚兩性電解質(zhì)的結(jié)構(gòu)多樣性、分析了聚兩性電解質(zhì)作冷凍保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)制,整理了當(dāng)前不同聚兩性電解質(zhì)冷凍保護(hù)劑的保存效率,得出如下結(jié)論:

        1)新型聚兩性電解質(zhì)保護(hù)劑,具有高效、低毒的顯著優(yōu)勢(shì);

        2)聚兩性電解質(zhì)的保存效率與其分子量、正負(fù)基團(tuán)比例、疏水性基團(tuán)濃度密切相關(guān);

        3)聚兩性電解質(zhì)優(yōu)化使用后可將生物樣本存活率提高至90%以上;聚兩性電解質(zhì)制備成低溫保存水凝膠具有更加廣泛的應(yīng)用前景;

        4)在未來(lái),需要更加深入研究聚兩性電解質(zhì)的冷凍保護(hù)機(jī)制,探索聚兩性電解質(zhì)是否可用于保存更復(fù)雜的對(duì)象,并開(kāi)發(fā)毒性更低、價(jià)格更低廉和更易于合成的聚兩性電解質(zhì)用作CPA,為聚兩性電解質(zhì)的新式應(yīng)用提供更多的可能性。

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