莫定敢 唐蘭艷

廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院，南寧市 530218

近年來(lái)，我國(guó)不孕不育患者數(shù)量逐年增多，不孕不育已成為我國(guó)重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。調(diào)查結(jié)果[1]顯示，不孕不育癥的一半原因在于男性，而其中超過(guò)30%的原發(fā)性男性不育與Y染色體微缺失所導(dǎo)致的生精障礙有關(guān)。研究[2-6]發(fā)現(xiàn)，男性Y染色體上“無(wú)精子因子”區(qū)(AZF)是實(shí)現(xiàn)生精及維持生精功能不可或缺的因子，AZF部分缺失是男性生精障礙的重要影響因素，其中大部分的AZF缺失發(fā)生在AZFc區(qū)(其他兩個(gè)區(qū)域?yàn)锳ZFa、AZFb)，而男性遺傳性生精障礙與AZFc區(qū)中的DAZ基因拷貝數(shù)差異有關(guān)；男性生精障礙患者的AZFc缺失在不同地域、種族之間存在較大差異。為探討廣西地區(qū)男性不育患者AZFc部分缺失與生精障礙的關(guān)系，本研究選取廣西地區(qū)男性生精障礙患者268例以及同期正常體檢者100例為研究對(duì)象進(jìn)行了檢測(cè)分析。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2021年9月在我院接受診治的不育男性患者268例為患者組，年齡26～45歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)臨床檢查結(jié)果、參照男性不育的診療指南[7]確診為男性不育；(2)祖籍為廣西地區(qū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)梗阻性無(wú)精子癥患者；(2)精索靜脈曲張、隱睪、附睪損傷患者；(3)輸精管發(fā)育不良患者；(4)泌尿生殖道感染患者；(5)低促性腺激素性性腺功能減退癥患者。根據(jù)精液檢查結(jié)果、參照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)[8]將患者分為無(wú)精子組(精子濃度<0.1×106/mL)88例、嚴(yán)重少精組(精子濃度<5×106/mL)103例、少精組[精子濃度(5～20)×106/mL]77例。參照不育患者的年齡選取同期體檢正常者100例為對(duì)照組(精子濃度大于20×106/mL)，年齡26～45歲。兩組研究對(duì)象均簽署檢測(cè)研究知情同意書(shū)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 AZFc缺失篩查 抽取研究對(duì)象外周靜脈血5 mL，分離淋巴細(xì)胞，使用全血DNA提取試劑盒[亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司]提取DNA，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。采用多重PCR法對(duì)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS) 進(jìn)行檢測(cè)，分析AZFc缺失情況。設(shè)置6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)：SY160(上游5′-TACGGGTCTCGAATGGAATA-3′，下游5′-TCATTGCATTCCTTTCCATT-3′)；SY254(上游5′-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3′，下游5′-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3′)；SY1291(上游5′-TAAAAGGCAGAACTGCCAGG-3′，下游5′-GGGAGAAAAGTTCTGCAACG-3′)；SY1125(上游5′-GTGGGGGTTTCACATTATGG-3′，下游5′-GGTCACAGACTCACATTTAAGCA-3′)；SY1191(上游5′-CCAGACGTTCTACCCTTTCG-3′，下游5′-GAGCCGAGATCCAGTTACCA-3′)；SY1201(上游5′-CCGACTTCCACAATGGCA-3′，下游5′-GGGAGAAAAGTTCTGCAACG-3′)?？偡磻?yīng)體系主要包括：緩沖液、引物、dNTP、Taq酶、無(wú)核酸水，共25 μL。反應(yīng)條件：預(yù)熱95℃ 3 min，95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，延伸72℃ 10 min。

1.2.2 DAZ基因拷貝數(shù)分析 對(duì)AZFc部分缺失患者進(jìn)一步進(jìn)行DAZ基因拷貝數(shù)檢測(cè)。采用PCR-RFLP分析DAZ基因中SNV 5(上游5′-CCTGGAGATTTCTTGTATATGGAA-3′，下游5′-CTTACAAACATTATGCTGAGTGAA-3′)，檢測(cè)DAZ 基因拷貝數(shù)差異。SNV 5的特定片段分為DAZ1/2與DAZ3/4。另選DAZ基因外Y染色體上M159位點(diǎn)(上游5′-GCTAGTAGTGGTGCTTGATAA-3′，下游5′-TTTAAAAAGTACCAGAAGAAGG-3′)作為內(nèi)參以消除 DNA 濃度不均產(chǎn)生的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用%描述，組間比較用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不育患者與體檢正常者的AZFc缺失率比較 268例不育患者中，存在AZFc部分缺失78例，缺失率為29.10%，對(duì)照組體檢正常者的AZFc缺失率為3.00%。無(wú)精子組不育患者的AZFc缺失率明顯高于少精組及對(duì)照組，嚴(yán)重少精組不育患者的AZFc缺失率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不育患者與體檢正常者的AZFc缺失率比較 [n(%)]

2.2 268例患者STS各序列位點(diǎn)的AZFc缺失分布 檢測(cè)分析結(jié)果顯示，SY254序列位點(diǎn)的AZFc缺失率最高為34.70%，SY1125序列位點(diǎn)的AZFc缺失率為23.13%，SY160序列位點(diǎn)的AZFc缺失率為16.42%。見(jiàn)表2。

表2 268例患者STS各序列位點(diǎn)的AZFc缺失分布

2.3 AZFc區(qū)域DAZ基因拷貝缺失情況比較 對(duì)81例AZFc部分缺失者(78例患者，3例體檢正常者)進(jìn)行 DAZ 基因拷貝缺失分析。結(jié)果顯示，DAZ1/2拷貝缺失者有30例，DAZ3/4 拷貝缺失者有55例，部分不育癥患者存在DAZ1/2與DAZ3/4共缺失情況。無(wú)精子組、嚴(yán)重少精組、少精組、對(duì)照組研究對(duì)象的DAZ1/2基因拷貝缺失率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但4組間的DAZ3/4拷貝缺失率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，無(wú)精子組、嚴(yán)重少精組、少精組患者的DAZ3/4拷貝缺失率均明顯高于對(duì)照組 (P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 AZFc區(qū)域DAZ基因拷貝缺失情況比較 [n(%)]

3 討 論

男性不育的遺傳因素逐漸受到業(yè)內(nèi)的重視，研究發(fā)現(xiàn)，男性Y染色體AZFc缺失是男性生精障礙的重要因素，AZFc中的 DAZ 基因拷貝缺失與男性原發(fā)性無(wú)精、嚴(yán)重少精癥的關(guān)系尤為密切[9-10]。對(duì)AZFc部分缺失進(jìn)行檢測(cè)有助于對(duì)男性原發(fā)性無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者進(jìn)行輔助生育精子質(zhì)量篩選。綜合分析國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，男性原發(fā)不育患者AZFc部分缺失的發(fā)生率可能與其種族、地域及基因多態(tài)性相關(guān)。廣西地區(qū)男性不育形勢(shì)日益嚴(yán)峻，對(duì)廣西地區(qū)男性不育患者AZFc缺失發(fā)生率展開(kāi)調(diào)查，可進(jìn)一步弄清AZFc缺失與男性原發(fā)不育癥的關(guān)系。

本研究對(duì)268例廣西地區(qū)不育男性患者進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，患者的AZFc缺失率為29.10%，少精組、嚴(yán)重少精組、無(wú)精子組患者的AZFc缺失率依次升高，提示AZFc缺失率越高男性的生精障礙越嚴(yán)重。在本研究中，無(wú)精子癥患者的AZFc缺失率高達(dá)40.91%，嚴(yán)重少精癥組患者的AZFc缺失率達(dá)26.21%，比既往文獻(xiàn)報(bào)道的AZFc缺失率稍高[3,11]，可能與各研究樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)或患者所在地區(qū)不同有關(guān)。AZFc與男性生精密切相關(guān)的DAZ基因拷貝缺失是AZFc區(qū)缺失率高的核酸基礎(chǔ)，本研究所選的STS均為AZFc區(qū)常見(jiàn)的序列位點(diǎn)，已覆蓋AZFc區(qū)，在男性原發(fā)無(wú)精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者輔助生育精子質(zhì)量篩選與預(yù)后評(píng)估中，能夠很好地減少因AZFc垂直傳遞帶來(lái)的干擾。

男性Y染色體上有兩個(gè)呈反向排列的DAZ基因拷貝區(qū)，即DAZ1/2與DAZ3/4，二者拷貝數(shù)差異可導(dǎo)致不同程度的生精障礙[12]。本研究結(jié)果顯示，無(wú)精子組、嚴(yán)重少精組、少精組、對(duì)照組研究對(duì)象的DAZ1/2基因拷貝缺失率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無(wú)精子組、嚴(yán)重少精組、少精組患者的DAZ3/4基因拷貝缺失率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示DAZ3/4基因缺失與男性生精障礙的關(guān)系要比DAZ1/2基因缺失與男性生精障礙的關(guān)系更為密切。在本研究中，DAZ3/4基因拷貝缺失均出現(xiàn)在無(wú)精子癥、嚴(yán)重少精子癥及少精癥患者中，而DAZ1/2拷貝缺失則在少精組、正常對(duì)照組中發(fā)生的概率較高，與既往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[13-15]存在一定差異，這可能是因研究對(duì)象的種族及地域差異所致。導(dǎo)致男性原發(fā)性生精障礙發(fā)生的遺傳原因有多種，DAZ基因缺失只是其中之一，在一些DAZ基因缺失的生精障礙患者中還可能同時(shí)存在基因倒位或重復(fù)的情況，需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，AZFc缺失率越高廣西地區(qū)男性生精障礙患者的生精障礙越嚴(yán)重，但AZFc部分缺失并不會(huì)導(dǎo)致絕對(duì)不育，及早檢測(cè)AZFc缺失有助于指導(dǎo)患者治療，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育具有重要的意義。