張沁麗,王玉芬,劉 紅,劉博雯

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山西 長(zhǎng)治 046000)

多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的一種慢性自身免疫性和退行性疾病,其病理改變包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)中的多發(fā)性脫髓鞘斑塊,并伴有反應(yīng)性膠質(zhì)增生和軸突損傷[1]。盡管對(duì)MS 的病因、發(fā)病機(jī)制和治療的研究越來(lái)越多,但目前對(duì)MS 的治療方案尚相對(duì)有限,MS 仍然是世界范圍內(nèi)的治療挑戰(zhàn)[2]。雖然MS 的病因和機(jī)制仍不清楚,但神經(jīng)炎癥被證明在MS 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,過(guò)度的炎癥會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織損傷,如脫髓鞘損傷和軸突損傷[3]。在成人CNS 中,受損神經(jīng)元軸突再生不良的部分原因是髓鞘相關(guān)軸突生長(zhǎng)抑制劑的存在,如髓鞘相關(guān)糖蛋白、Nogo、少突膠質(zhì)細(xì)胞-髓鞘糖蛋白等,這些抑制劑可以激活RhoA[4]。研究表明RhoA 的激活會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)錐的塌陷和軸突生長(zhǎng)的抑制,而RhoA 的失活可以促進(jìn)受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)的軸突再生和功能恢復(fù),RhoA 的下游效應(yīng)因子是Rho 相關(guān)激酶(Rock),包括Rock1 和Rock2,Rock 活化可促進(jìn)肌球蛋白輕鏈磷酸酶的磷酸化[5]。因此,我們推測(cè)RhoA/Rock 信號(hào)通路可能參與自身免疫性腦脊髓炎。他汀類(lèi)藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,廣泛用于降低膽固醇,以減少動(dòng)脈粥樣硬化和心血管發(fā)病率[6]。最近在自身免疫性疾病動(dòng)物模型中的研究表明,他汀類(lèi)藥物的抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性可能有益于神經(jīng)退行性疾病的治療[7]。目前關(guān)于阿托伐他汀在治療MS 中的作用機(jī)制的研究主要集中在免疫調(diào)節(jié)方面,關(guān)于其是否可通過(guò)調(diào)節(jié)髓鞘修復(fù)及RhoA/Rock 通路來(lái)改善MS 進(jìn)展的研究尚少。因此,本研究旨在探討阿托伐他汀對(duì)自身免疫性腦脊髓炎小鼠髓鞘修復(fù)及RhoA/Rock1 通路的影響,以期為MS 的治療提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用30 只SPF 級(jí)C57BL/6 雌性近交系小鼠,6～8 周,18～20 g,購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(川)2020-030],飼養(yǎng)于長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房[SYXK(晉)2022-0001],飼養(yǎng)條件為室溫(24±2)℃的環(huán)境中,維持光-暗12 h 循環(huán)交替,并予以充足的飼料和潔凈飲水。研究方案經(jīng)長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC 2019072A),并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 菌株

結(jié)核桿菌H37Ra(批號(hào):RNCC263834)購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司。

1.2 主要試劑與儀器

阿托伐他汀(批號(hào):20141008)購(gòu)自輝瑞制藥；MOG35-55 購(gòu)自西安聯(lián)美生物,純度＞95%桿菌；百日咳素(PTX,批號(hào):C7897)、完全弗氏佐劑(CFA,批號(hào):F5881)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；蘇木素染液(批號(hào):R20568)、伊紅染液(批號(hào):R24044)購(gòu)yuanye Bio-Technology Co.,Ltd(上海)；IL-6(貨號(hào):ZC-36404)、TNF-α(貨號(hào):ZC-37624)、NO(貨號(hào):ZCS0647)ELISA 試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物；相關(guān)一抗NG2(貨號(hào):#52635)、MBP(貨號(hào):#2396)、RhoA(貨號(hào):#2117)、Rock1(貨號(hào):# 4035)、生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(貨號(hào):#32935)購(gòu)自CST；RNA TRIzol Reagent(批號(hào):15596026)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(貨 號(hào):A44662) 購(gòu) 自 ThermoFisher SCIENTIFIC(上海)；Western blot 細(xì)胞裂解液(貨號(hào):P0013)、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):P0009)購(gòu)自上海碧云天生物；ECL 發(fā)光試劑盒(貨號(hào):E-IR-R307)、Immobilon-PSQ PVDF 膜(貨號(hào):EBC-R266) 購(gòu)自武漢Elabscience。實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀(型號(hào)PIKORed 96)和全功能酶標(biāo)儀MK3 均為美國(guó)ThermoFisher 儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型制備及分組

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5 組,空白組、模型組(實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎)、阿托伐他汀組、高脂飲食組、高脂飲食+阿托伐他汀組,每組6 只。建模步驟[8]:將抗原MOG35-55 用生理鹽水稀釋成5 mg/mL,并按1 ∶1 等體積加入CFA,加入結(jié)核桿菌H37Ra 使其終濃度為4 mg/mL,充分混合乳化。乳化后按每只0.1 mL 于小鼠脊柱兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射,0、48 h 每只小鼠腹腔注射0.5 mL PTX(百日咳毒素500 ng)?？瞻捉M以等量生理鹽水代替MOG多肽,其余步驟和方法相同。

1.3.2 給藥方法

高脂飲食組、高脂飲食+阿托伐他汀組均給予高脂飼料喂養(yǎng)3 周后開(kāi)始免疫、干預(yù),空白組、模型組、阿托伐他汀組給予普通飼料喂養(yǎng)3 周后開(kāi)始免疫、干預(yù)。阿托伐他汀給藥劑量為8 mg/(kg·d),將40 mg 阿托伐他汀溶于125 mL 的0.1 mol/L PBS溶液中形成混懸液,其終濃度為0.32 mg/mL。免疫后第3 天開(kāi)始應(yīng)用小鼠灌胃針每只小鼠每天灌服0.5 mL 混懸液,連續(xù)28 d。其中,高脂飼料配比為:膽固醇1%、蛋黃粉10%、豬油10%、普通飼料79%。阿托伐他汀給藥劑量參考Zeyghami 等[9]的報(bào)道。

1.3.3 神經(jīng)功能評(píng)分

采用Knoz 評(píng)分法[10]評(píng)估小鼠病情變化,連續(xù)觀察直至動(dòng)物處死,具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0 分:無(wú)癥狀；1 分:尾部失去張力；2 分:后肢力弱；3 分:后肢癱瘓；4 分:后肢及前肢癱瘓；5 分:瀕臨死亡或死亡。

1.3.4 HE 染色和LFB 染色觀察

蘇木精-伊紅(HE)染色:取小鼠腦脊髓,用4%多聚甲醛固定24 h 后,將組織標(biāo)本放入含30%蔗糖的4%多聚甲醛中保存,腦脊髓組織石蠟包埋,連續(xù)切片,厚度5 μm,用HE 染色評(píng)價(jià)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。并采用雙盲法進(jìn)行炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分:0 分,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；1 分,腦膜細(xì)胞浸潤(rùn)；2 分,血管周細(xì)胞浸潤(rùn)最多4 個(gè)小區(qū)域；3 分,血管周細(xì)胞浸潤(rùn)5 個(gè)或5 個(gè)以上小區(qū)域,和/或1 個(gè)以上大型細(xì)胞浸潤(rùn)；4 分,大量細(xì)胞浸潤(rùn),累及20%以上的白質(zhì)。

固藍(lán)(LFB)染色:為了評(píng)估脫髓鞘,切片按上述方法處理,并用LFB 染色。將組織切片在60℃的0.1% LFB 溶液中孵育過(guò)夜,然后在0.05%的碳酸鋰溶液中進(jìn)行區(qū)分,以區(qū)分白質(zhì)和灰質(zhì),最后在光學(xué)顯微鏡下觀察切片。采用以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠的脫髓鞘情況進(jìn)行雙盲法評(píng)估:0 分,無(wú)髓鞘丟失；1 分,小范圍髓鞘丟失；2 分,2 個(gè)或3 個(gè)小范圍髓鞘丟失；3 分,最多2 個(gè)大規(guī)模髓鞘丟失；4 分,大范圍髓鞘丟失,累及超過(guò)20%的白質(zhì)。

1.3.5 ELISA 法檢測(cè)

按照ELISA 試劑盒說(shuō)明操作,檢測(cè)小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的表達(dá)。

1.3.6 透射電鏡觀察

取腦組織,切取胼胝體區(qū)域組織,組織塊切成1 mm3×1 mm3×3 mm3大小轉(zhuǎn)入2.5%戊二醛固定液中4℃固定24 h。組織塊用1%鋨酸后固定2 h,然后梯度丙酮脫水,組織塊用環(huán)氧樹(shù)脂包被,切取半薄切片1%甲苯胺藍(lán)染色后,超薄切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色,在透射電鏡下觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)胼胝體區(qū)髓鞘超微結(jié)構(gòu)改變。

1.3.7 免疫組織化學(xué)染色觀察

腦脊髓組織切片脫蠟復(fù)水,用3% H2O2室溫孵育30 min,加正常山羊血清后37℃孵育30 min,滴加一抗(NG2、MBP(1 ∶300))37℃孵育1 h。用山羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶(1 ∶200)室溫孵育2 h。用DAB 試劑顯示陽(yáng)性細(xì)胞,蘇木精復(fù)染、酒精鹽酸分化、脫水、中性樹(shù)膠封片,顯微鏡觀察,用Image Pro Plus 6.0 軟件對(duì)NG2、MBP 進(jìn)行定量分析。

1.3.8 qRT-PCR 檢測(cè)

根據(jù)制造商的說(shuō)明,采用TRIzol 試劑從腦組織或脊髓組織中提取總RNA,然后對(duì)RNA 進(jìn)行量化,將一定量的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后使用TaKaRa TB GreenTMPreMix Ex TaqTM的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量,用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因表達(dá)水平,并用內(nèi)源性參考GAPDH 值進(jìn)行歸一化。本研究中使用的引物序列如表1 所示。qRT-PCR 反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30 s,變性95℃5 s,退火55℃30 s,延伸72℃30 s,45 個(gè)循環(huán),記錄CT 值。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.9 Western blot 分析

腦組織用冷PBS 洗滌2 次,用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液從腦組織提取蛋白質(zhì),冰上孵育,裂解產(chǎn)物在12000 r/min 下離心15 min,收集上清液,并通過(guò)BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒分析蛋白濃度。然后,將上清液與12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠樣品加載緩沖液混合,并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜(微孔)上,根據(jù)制造商的說(shuō)明,轉(zhuǎn)移的印跡與封閉劑(5%脫脂牛奶在Tris 緩沖鹽水中)室溫封閉2 h 后,將膜與抗RhoA(1 ∶500)、Rock1(1 ∶500)或β-actin(1 ∶2500)的抗體在4 抗下一起孵育過(guò)夜。然后,在搖床上用TBST 緩沖液(含0.1%Tween 20 的Tris 緩沖液,pH=7.6)和生物素化山羊抗兔IgG 抗體孵育2 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)熒光檢測(cè)試劑盒(ECL)進(jìn)行顯影,使用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)化學(xué)發(fā)光膜的免疫反應(yīng)性,并通過(guò)使用Image-ProPlus 分析光密度,以β-actin 為內(nèi)參,對(duì)蛋白進(jìn)行量化,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 軟件(IBM Corp.)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(),采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較分析,方差齊性時(shí)用LSD 檢驗(yàn),方差不齊時(shí)用Tamhane’sT2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀對(duì)自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

與空白組比較,模型組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分于給藥前、給藥15 d、給藥28 d 時(shí)均明顯升高(P＜0.01),與模型組比較,阿托伐他汀組和高脂飲食+阿托伐他汀組于給藥15 d 和給藥28 d 明顯降低神經(jīng)功能評(píng)分,且28 d 時(shí)降低更明顯(P＜0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分Table 2 Neurological function scores of mice in each group

2.2 阿托伐他汀對(duì)自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎性腦浸潤(rùn)和脊髓脫髓鞘的影響

空白組:未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分為0 分)及未發(fā)生脫髓鞘改變(脫髓鞘評(píng)分0分)。模型組:小鼠腦組織白質(zhì)區(qū)神經(jīng)纖維束間見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以核呈圓形深染的淋巴細(xì)胞為主,部分炎性細(xì)胞圍繞在血管周?chē)?；脊髓組織LFB染色可見(jiàn)髓鞘藍(lán)染區(qū)域的面積顯著減少,可見(jiàn)大面積髓鞘脫失后著色為白色的區(qū)域,即發(fā)生明顯脫髓鞘改變。阿托伐他汀組和高脂飲食組:小鼠腦組織白質(zhì)區(qū)神經(jīng)纖維束間見(jiàn)極少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以及少量小膠質(zhì)細(xì)胞增生；脫髓鞘程度較模型組好轉(zhuǎn)。高脂飲食+阿托伐他汀組:小鼠腦組織白質(zhì)區(qū)神經(jīng)纖維束間見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),少量小膠質(zhì)細(xì)胞增生；脫髓鞘程度較模型組好轉(zhuǎn)。進(jìn)一步量化分析,與模型組比較,阿托伐他汀組、高脂飲食+阿托伐他汀組小鼠炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分及脫髓鞘評(píng)分明顯降低(P＜0.01)(圖1)。

圖1 小鼠炎性腦浸潤(rùn)和脊髓脫髓鞘變化Note.A,HE staining and quantitative analysis.B,LFB staining and quantitative analysis.Compared with control group,**P＜0.01.Compared with model group,##P＜0.01.Figure 1 Changes of inflammatory brain infiltration and spinal cord demyelination in mice

2.3 阿托伐他汀對(duì)自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎性細(xì)胞因子的影響

與空白組比較,模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量明顯升高(P＜0.01),與模型組比較,阿托伐他汀可明顯降低小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO的含量(P＜0.05),見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量Table 3 Contents of TNF-α,IL-6 and NO in serum of mice in each group

2.4 阿托伐他汀對(duì)自身免疫性腦脊髓炎小鼠髓鞘再生修復(fù)的影響

透射電鏡觀察結(jié)果顯示,空白組小鼠的軸突間距、髓鞘板層結(jié)構(gòu)正常。模型組髓鞘呈松散的層狀結(jié)構(gòu),排列極為松散,部分髓鞘崩解、斷裂、脫失,軸索萎縮變性,結(jié)構(gòu)不清晰。阿托伐他汀組和高脂飲食+阿托伐他汀組可見(jiàn)髓鞘排列松散,少量髓鞘崩解脫失及軸索萎縮,結(jié)構(gòu)尚清晰。高脂飲食組髓鞘呈松散的層狀結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)不清晰(圖2A)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組較空白組NG2、MBP 表達(dá)明顯降低(P＜0.01),與模型組比較,阿托伐他汀組NG2、MBP 表達(dá)明顯升高(P＜0.01)(圖2B～2E)。qRT-PCR 檢測(cè)表明,與空白組比較,模型組MBP、NG2 mRNA 表達(dá)明顯降低(P＜0.01),與模型組比較,阿托伐他汀可明顯升高M(jìn)BP、NG2 mRNA 表達(dá)(P＜0.05)(圖2F)。

圖2 各組小鼠髓鞘再生修復(fù)情況Note.A,Transmission electron microscope observation.B,MBP immunohistochemical staining.C,NG2 immunohistochemical staining.D,MBP average optical density.E,NG2 average optical density.F,MBP and NG2 mRNA expression.Compared with control group,**P＜0.01.Compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01.Figure 2 Remyelination and repair of mice in each group

2.5 阿托伐他汀對(duì)自身免疫性腦脊髓炎小鼠RhoA/ROCK-1 通路的影響

與空白組比較,模型組小鼠腦組織RhoA、Rock1 mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯升高(P＜0.01),與模型組比較,僅阿托伐他汀可明顯降低小鼠腦組織RhoA、Rock1 mRNA 和蛋白表達(dá)(P＜0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠RhoA/ROCK-1 通路相關(guān)因子的表達(dá)Note.A,RhoA and Rock1 mRNA expression.B,RhoA and Rock1 protein expression bands.C,RhoA and Rock1 protein expression.Compared with control group,**P＜0.01.Compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01.Figure 3 Expression of RhoA/ROCK-1 pathway related factors in each group of mice

3 討論

MS 是一種以自身免疫性炎癥、脫髓鞘和軸突損傷為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病[11]。文獻(xiàn)[12]顯示脂質(zhì)代謝和炎癥途徑在許多點(diǎn)相互交叉調(diào)節(jié),并通過(guò)局部機(jī)制參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)功能。不僅如此,Mandoj 等[13]認(rèn)為與膽固醇異常穩(wěn)態(tài)相關(guān)的血栓形成和神經(jīng)退行性機(jī)制可能有助于MS 進(jìn)展。Tettey 等[14]進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究亦表明高膽固醇水平對(duì)于MS 患者產(chǎn)生不利影響,與殘疾及疾病的進(jìn)展相關(guān)。故高脂與MS 之間存在一定聯(lián)系。阿托伐他汀作為臨床常用的降血脂藥物,其安全性已經(jīng)得到肯定,但目前關(guān)于其是否可改善MS 髓鞘修復(fù)及是否可通過(guò)調(diào)節(jié)降脂水平來(lái)改善MS 的研究尚少。EAE 可較好的模擬MS 臨床表現(xiàn)及病理特征,由此,本研究選用MOG35-55 多肽片段誘導(dǎo)EAE 小鼠模型作為研究對(duì)象,設(shè)置阿托伐他汀組的同時(shí)設(shè)置高脂飲食組、高脂飲食+阿托伐他汀組,觀察其對(duì)髓鞘再生修復(fù)情況及對(duì)RhoA/Rock-1 通路的影響,為他汀在MS 治療中的應(yīng)用提供更多依據(jù),為MS 的治療提供更多契機(jī)。

神經(jīng)炎癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最基本的保護(hù)性反應(yīng)之一,在許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[15]。大腦和脊髓作為一種自我防御機(jī)制,可以對(duì)損傷產(chǎn)生免疫反應(yīng),這些反應(yīng)包括消除侵襲性病原體,清除受損細(xì)胞,促進(jìn)組織修復(fù)[16]。然而,神經(jīng)炎癥過(guò)程是一把雙刃劍,在不平衡的條件下,可能導(dǎo)致不同程度的組織損傷和功能障礙[17]。過(guò)度的神經(jīng)炎性反應(yīng)已被認(rèn)為是MS 的病因之一,控制炎癥是該病早期的主要治療目標(biāo)[18]。在EAE 模型小鼠連續(xù)給予阿托伐他汀、高脂飲食+阿托伐他汀后,我們觀察到與未治療的小鼠相比,神經(jīng)學(xué)評(píng)分被明顯改善,而高脂飲食組小鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分未見(jiàn)明顯變化。此外,腦部炎癥浸潤(rùn)以及脊髓脫髓鞘程度也有所減輕。EAE 模型小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量明顯高于空白組,阿托伐他汀可明顯降低EAE 模型小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量,高脂飲食+阿托伐他汀干預(yù)后EAE 模型小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量無(wú)明顯變化,但有降低趨勢(shì)。在正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)條件下,NO 調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程,如血流、免疫反應(yīng)和突觸傳遞。然而,越來(lái)越多的證據(jù)表明iNOS 誘導(dǎo)的高NO 水平與MS的許多病理表現(xiàn)有關(guān)[19]。同樣,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)EAE模型小鼠的NO 含量明顯升高。根據(jù)阿托伐他汀緩解EAE 癥狀的功能,阿托伐他汀可下調(diào)NO 的產(chǎn)生,高脂飲食+阿托伐他汀組可下調(diào)NO 的水平,但無(wú)明顯改善。因此,中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗炎能力的明顯提高可能歸因于阿托伐他汀的神經(jīng)保護(hù)作用,飼喂高脂飼料的EAE 小鼠給予阿托伐他汀后TNF-α、IL-6、NO 含量較EAE 模型小鼠有降低趨勢(shì),提示阿托伐他汀可能通過(guò)降脂改善MS 病理學(xué)特征和促炎因子的表達(dá)等。

髓鞘修復(fù)被認(rèn)為是MS 功能恢復(fù)的關(guān)鍵,然而,脫髓鞘給軸突帶來(lái)了巨大的新陳代謝負(fù)擔(dān),造成不可逆的損害,導(dǎo)致MS 的永久性神經(jīng)缺陷[20]。MS的脫髓鞘病變是由神經(jīng)炎癥和自身免疫機(jī)制引起的,然而,中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以在脫髓鞘事件后再生,特別是在MS 的初期。但隨著脫髓鞘攻擊次數(shù)的增加和時(shí)間的延長(zhǎng),再髓鞘形成的效果似乎降低,并導(dǎo)致具有神經(jīng)癥狀的損傷[21]。研究已表明IFN-γ誘導(dǎo)的炎癥和少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡被認(rèn)為是MS 病變髓鞘再生不良的主要因素[22]。EAE 中過(guò)多的IL-1β 產(chǎn)生會(huì)殺死神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞,但也會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)髓鞘再生[23]。此外TNF-α、IL-6 在EAE 小鼠的脫髓鞘免疫炎癥病變中驅(qū)動(dòng)脫髓鞘[24]。由此,探討髓鞘修復(fù)對(duì)于開(kāi)發(fā)抗MS 進(jìn)展的恢復(fù)性療法至關(guān)重要。NG2 是一種表達(dá)在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞膜上的糖蛋白,可作為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的特異性細(xì)胞標(biāo)志物[25]。MBP 是一種具有黏附作用并在髓鞘的形成中起到關(guān)鍵作用的一個(gè)重要的髓鞘組成成分[26],在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化過(guò)程中,有絲分裂后期的少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟階段,髓鞘抗原MBP 被合成,并在髓鞘外緣形成穩(wěn)定膜狀板層結(jié)構(gòu),從而保證了髓鞘的完整性[27]。RhoA/ROCK-1 信號(hào)通路是體內(nèi)普遍存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生、粘附、遷移和增殖等多種生物學(xué)過(guò)程[28]。在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,受損神經(jīng)元軸突再生不良的部分原因是髓鞘相關(guān)軸突生長(zhǎng)抑制劑的存在,如髓鞘相關(guān)糖蛋白、Nogo、少突膠質(zhì)細(xì)胞-髓鞘糖蛋白等,這些抑制劑可以激活RhoA[4]。激活的RhoA 會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)錐塌陷和軸突生長(zhǎng)抑制,而RhoA 的失活可以促進(jìn)受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)的軸突再生和功能恢復(fù),RhoA 的下游效應(yīng)因子Rock 活化可促進(jìn)肌球蛋白輕鏈磷酸酶的磷酸化[5]。本研究結(jié)果顯示,阿托伐他汀組和高脂飲食+阿托伐他汀組可見(jiàn)髓鞘排列松散,少量髓鞘崩解脫失,少量軸索萎縮,結(jié)構(gòu)尚清晰；模型組小鼠較空白組NG2、MBP 蛋白及mRNA 表達(dá)明顯降低,阿托伐他汀可明顯升高小鼠MBP、NG2 蛋白及mRNA 表達(dá)；且模型組小鼠腦組織RhoA、Rock1 蛋白和mRNA 表達(dá)均較空白組明顯升高,僅阿托伐他汀可明顯降低小鼠腦組織RhoA、Rock1 蛋白和mRNA 表達(dá)。揭示阿托伐他汀在自身免疫性脫髓鞘疾病中的有效保護(hù)作用,可能通過(guò)降脂改善MS 髓鞘崩解。

綜上所述,阿托伐他汀明顯緩解了EAE 疾病的進(jìn)展,促進(jìn)了EAE 髓鞘修復(fù),抑制炎癥因子的產(chǎn)生,并有降低高脂飲食EAE 小鼠神經(jīng)功能評(píng)分及髓鞘崩解的作用,是潛在的治療MS 的藥物,具有新的作用機(jī)制,RhoA/Rock-1 可能是治療MS 的一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)。