李夢(mèng)媛,張文龍,楊星九,朱紫薇,張國(guó)新,魏育敏,高 苒

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,國(guó)家人類疾病動(dòng)物模型資源庫(kù),國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021)

核不均一核糖核蛋白 K (heterogeneous nuclearribonucleoprotein K,HNRNPK)是一種能夠在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中穿梭的高度保守的RNA 結(jié)合蛋白,屬于hnRNPKs 家族成員。HNRNPK 在人類基因中廣譜表達(dá),能夠作用于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯、染色體重塑等多種生理功能[1-2]。HNRNPK 能夠參與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等調(diào)控,多種腫瘤的形成和發(fā)展都與HNRNPK 密切相關(guān)[1-4]。當(dāng)前研究顯示,HNRNPK在人肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等多種腫瘤中異常表達(dá),其表達(dá)增多通常與惡性腫瘤患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)[3-4]。原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是世界最高發(fā)的惡性腫瘤之一,在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位居第5 位,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,死亡率高,且發(fā)病率逐年上升[5]。已有研究證實(shí)HNRNPK 在肝癌組織細(xì)胞核中表達(dá)上調(diào),并且隨著肝癌細(xì)胞密度的增加,表達(dá)逐漸增強(qiáng),乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染還有可能會(huì)促進(jìn)HNRNPK 的表達(dá)[6]。目前,HNPNPK在肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制尚未完全明確。本研究構(gòu)建了通過強(qiáng)力霉素(doxycycline,DOX)誘導(dǎo)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)時(shí)間可控性HNRNPK 沉默的HepG2 細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株,為研究肝癌發(fā)病機(jī)制與治療手段提供了實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

HepG2 細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo 公司；SYBR green 熒光染料購(gòu)自Toyobo 公司；HNRNPK抗體、HRP 標(biāo)記的二抗購(gòu)自Abcam 公司；c-Myc、c-Jun 等抗體購(gòu)自CST 公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技有限公司；定量PCR 專用96 孔板購(gòu)自Life公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwell 嵌套24 孔板等購(gòu)自Corning 公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀和酶標(biāo)儀購(gòu)自BIO RAD 公司；拍照顯微鏡為Zeiss Axio Imager Z2光學(xué)顯微鏡。

PCR 實(shí)驗(yàn)所用引物由英濰捷基公司合成。HNRNPK 的siRNA 序列為5’-GAGCTTCGATCAAAA TTGA-3’,由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并提供給吉?jiǎng)P基因進(jìn)行慢病毒載體的構(gòu)建。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建

按吉?jiǎng)P基因操作手冊(cè)進(jìn)行HepG2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板,18 h 后,加入MOI=10 的病毒,8 h 后更換新鮮的培養(yǎng)基。并在72 h 后,用工作濃度為2 μg/mL 的嘌呤霉素繼續(xù)篩選48 h。觀察細(xì)胞狀態(tài),用含有1 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基維持并擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.2 HNRNPK 下調(diào)的HepG2 細(xì)胞的形態(tài)觀察

將構(gòu)建的HepG2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板,用DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào)。48 h 后觀察HNRNPK 下調(diào)后HepG2 細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.3 Real time PCR 檢測(cè)HNRNPK 的下調(diào)水平

將構(gòu)建的HepG2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞接種于12 孔板,分別用0、1、2、5、10 μg/mL 濃度的DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào)。48 h 后,使用TRIzol 試劑裂解細(xì)胞并提取RNA,并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用Real-time PCR檢測(cè)HNRNPK mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。HNRNPK 與GAPDH 基因的上下游引物以及PCR 反應(yīng)體系參考本課題組前期研究[7]。通過HNRNPK mRNA 的相對(duì)表達(dá)量確定DOX 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞HNRNPK 下調(diào)的最適濃度。

1.3.4 Western blot 檢測(cè)HNRNPK 的表達(dá)

接種構(gòu)建的HepG2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞,通過DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào),48 h 后收集細(xì)胞。通過RIPA 裂解液冰上裂解并提取蛋白,加入5×loading buffer 煮沸制成蛋白樣品,進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳結(jié)束后按300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜90 min,用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉1 h 后,用HNRNPK 一抗(1 ∶1000 稀釋)4℃孵育過夜。次日,用HRP 標(biāo)記的二抗(1 ∶10000 稀釋)室溫孵育1 h,顯影檢測(cè)目的蛋白。

1.3.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

于96 孔板按3×103個(gè)/孔的密度接種穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞,用DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào)。接種當(dāng)天取1 組培養(yǎng)上清,加入CCK-8 試劑(1 ∶100 稀釋),按照CCK-8 檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)OD450,隨后每24 h檢測(cè)1 次,直至96 h。

1.3.6 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

按1×103個(gè)/孔的密度將穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞接種于6孔板。DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào)后,在顯微鏡下觀察克隆大小。待孔中大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50 時(shí)終止實(shí)驗(yàn),用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,洗滌細(xì)胞后用0.1%的結(jié)晶紫染色,洗去多余的結(jié)晶紫后,在顯微鏡下觀察計(jì)算單克隆數(shù)并拍照。

1.3.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

按2.5×105個(gè)/孔的密度將穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞接種于12 孔板。細(xì)胞貼壁后用200 μL 槍頭豎直劃線。除去孔中漂浮的細(xì)胞,用含DOX 與1%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。在劃痕后第48 h 拍照記錄細(xì)胞遷移狀態(tài)。

1.3.8 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

將穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞接種于6 孔板,用DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào)。次日,用胰酶消化重懸細(xì)胞,并用無(wú)血清培養(yǎng)基離心洗滌兩次除去血清,隨后用含DOX 的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸并制備細(xì)胞懸液。在24孔板(下室)中加入500 μL 含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,在Transwell 小室(上室)中加入含有DOX的150 μL 細(xì)胞懸液。將Transwell 小室浸入24 孔板中,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。除去Transwell 小室中的培養(yǎng)基,PBS 洗滌后用甲醇于室溫固定細(xì)胞。用PBS 洗去多余的甲醇后,用0.1%的結(jié)晶紫染色。最后用ddH2O 洗去多余的結(jié)晶紫,并用棉簽小心除去Transwell 小室腔內(nèi)多余的細(xì)胞,揭下基底膜固定于載玻片,用中性樹脂封片,晾干后在顯微鏡下觀察并計(jì)算遷移細(xì)胞的數(shù)量。

1.3.9 Western blot 檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路

檢測(cè)步驟同1.3.4,通過Western blot 方法檢測(cè)β-Catenin、c-Myc、c-Jun、MMP7、CCND1、Cyclin-D1等蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過GraphPad Prism V.5.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HNRNPK 沉默不影響HepG2 細(xì)胞的形態(tài)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示,DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào)后,HepG2 細(xì)胞在形態(tài)上無(wú)明顯變化,但與對(duì)照病毒組比較,細(xì)胞密度稍有不同,可能是增殖能力受到影響,具體差異需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。

圖1 HNRNPK 下調(diào)的HepG2 細(xì)胞形態(tài)Figure 1 Cellular morphology of HepG2 cells after HNRNPK downregulation

2.2 HepG2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株中HNRNPK 的表達(dá)顯著下調(diào)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A 所示,DOX 誘導(dǎo)后HepG2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株中HNRNPK mRNA 顯著下調(diào)。在DOX 的濃度為5、10 μg/mL 時(shí),HNRNPK 均能下調(diào)約60%,且二者之間無(wú)顯著差異,顯示5 μg/mL 是DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào)的最適濃度。進(jìn)一步檢測(cè)HNRNPK蛋白水平的表達(dá),如圖2B、圖2C 所示,用工作濃度為5、10 μg/mL 的DOX 誘導(dǎo)細(xì)胞,HNRNPK 表達(dá)同樣下調(diào)。

圖2 不同濃度DOX 誘導(dǎo)HNRNPK 下調(diào)(n=3)Note.A,qPCR.B,Western blot.C,Relative protein expression of HNRNPK.Compared with the control group,*P＜0.05,***P＜0.001.Figure 2 HNRNPK downregulated by different doses of DOX

2.3 HNRNPK 下調(diào)抑制了HepG2 細(xì)胞的增殖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示,檢測(cè)HepG2 細(xì)胞的增殖能力,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,與對(duì)照組比較,HNRNPK 下調(diào)的HepG2 細(xì)胞增殖能力明顯減弱,并且單克隆數(shù)量明顯減少,表明HNRNPK 下調(diào)顯著抑制了HepG2細(xì)胞的增殖。

圖3 HNRNPK 下調(diào)抑制HepG2 細(xì)胞的增殖(n=3)Note.A,CCK-8 assay.B,Colony formation assay.C,Colony number.Compared with the control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 3 HNRNPK downregulation inhibited the proliferation of HepG2 cells

2.4 HNRNPK 下調(diào)抑制了HepG2 細(xì)胞的遷移

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示,通過劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2 細(xì)胞的遷移能力,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,HNRNPK 下調(diào)的HepG2 細(xì)胞的遷移距離明顯減小,并且穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,表明HNRNPK 下調(diào)顯著抑制了HepG2 細(xì)胞的遷移。

圖4 HNRNPK 下調(diào)抑制HepG2 細(xì)胞的遷移(n=3)Note.A,Wound healing assay.B,Transwell assay.Compared with the control group,***P＜0.001.Figure 4 HNRNPK downregulation inhibited the migration of HepG2 cells

2.5 HNRNPK 下調(diào)對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖與遷移相關(guān)的信號(hào)通路的抑制

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示,檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞中增殖與遷移相關(guān)的信號(hào)通路的蛋白表達(dá)。HNRNPK 下調(diào)后,HepG2 細(xì)胞中的 Cyclin-D1、CCND1、β-Catenin、c-Myc、c-Jun、MMP7 等蛋白表達(dá)均降低。

圖5 HNRNPK 下調(diào)抑制HepG2 細(xì)胞增殖與遷移相關(guān)的信號(hào)通路(n=3)Note.Compared with the control group,*P＜0.05,***P＜0.001.Figure 5 HNRNPK downregulation inhibited related signaling pathways of proliferation and migration in HepG2 cells

3 討論

與正常人比較,HNRNPK 在慢性HBV 性肝炎、肝炎后肝硬化及乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌患者的血清、尿液中表達(dá)上調(diào),表明其與乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌具有相關(guān)性[8]。并且,HNRNPK 同樣在肝癌組織細(xì)胞核中表達(dá)上調(diào),其表達(dá)隨著肝癌細(xì)胞密度的增加逐漸增強(qiáng),提示HNRNPK 的高表達(dá)可能與肝癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)展密切相關(guān)[6]。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA (long non-coding RNAs,lncRNAs) 是HNRNPK 的主要調(diào)節(jié)因子,二者相互作用能夠調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯[3]。Qin 等[9]通過研究證實(shí)一種名為p53 穩(wěn)定和激活RNA (p53-stabilizing and activating RNA,PSTAR)的lncRNA 能夠通過抑制HNRNPK 的去類泛素化促進(jìn)p53 信號(hào)傳導(dǎo),從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

Zhang 等[10]發(fā) 現(xiàn) lncRNA CASC11 能夠與HNRNPK 相互作用激活Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路,繼而促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。Liu 等[11]研究證實(shí)Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路能夠參與HNRNPK 驅(qū)動(dòng)的頭頸鱗癌增殖和遷移抑制過程。Wnt/β-Catenin 通路在肝臟發(fā)育、再生和肝癌發(fā)生過程中也起著重要作用[12],已有研究顯示激活Wnt/β-Catenin 通路能夠促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的增殖和遷移,因而該通路的激活能夠促進(jìn)肝癌的發(fā)展,是肝癌發(fā)生的重要分子機(jī)制[13]。當(dāng)Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路被激活時(shí),包括Cyclin-D1、c-Jun、c-Myc 和基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)在內(nèi)的下游靶向基因也被異常激活[14]。MMPs 能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞表面受體,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障,從而被認(rèn)為是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中主要的蛋白水解酶[15]。HNRNPK 能夠激活Ras-raf-MARK 信號(hào)通路,上調(diào)在腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用的相關(guān)基因,如MMP3、MMP10 等[16]。肝癌組織中β-Catenin 的異常表達(dá)通常與MMP-7 呈正相關(guān)[17]。本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)HNRNPK 下調(diào)時(shí),HepG2 細(xì)胞中的β-Catenin 表達(dá)水平也降低,同時(shí)其通路下游的Cyclin-D1、c-Jun、c-Myc、MMP7 表達(dá)受到抑制。表明HNRNPK 的下調(diào)抑制了Wnt/β-Catenin 通路的激活,因而抑制其下游MMP7 等一系列調(diào)控細(xì)胞遷移的靶基因表達(dá),最終導(dǎo)致HepG2 細(xì)胞的遷移受到抑制。此外,已有研究證實(shí)HNRNPK 能夠參與細(xì)胞周期G0/G1 期與調(diào)控Cyclin-D1 開關(guān)蛋白2,從而影響膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡[18]。原癌基因Cyclin-D1由CCND1 基因所編碼,是一種G1/S 期特異性周期蛋白。Cyclin-D1 在多種腫瘤中均被發(fā)現(xiàn)基因過表達(dá),過表達(dá)的Cyclin-D1 能夠?qū)е录?xì)胞癌變[19]。本實(shí)驗(yàn)中,HNRNPK 的下調(diào)抑制了CCND1 與Cyclin-D1 的表達(dá),可能導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯,抑制了HepG2細(xì)胞的增殖。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了由DOX 誘導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控HNRNPK穩(wěn)定下調(diào)的HepG2 細(xì)胞株,能夠?qū)崿F(xiàn)時(shí)間可控性HNRNPK 表達(dá),為進(jìn)一步研究HNRNPK 對(duì)腫瘤形成時(shí)間以及腫瘤轉(zhuǎn)移的影響及作用機(jī)制提供了更便利的條件與良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。當(dāng)前的研究報(bào)導(dǎo)顯示,雖然HNRNPK 在多種惡性腫瘤中均顯示出異常表達(dá)的現(xiàn)象,其在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的具體作用卻不甚相同[20-22],因此不能單純地將HNRNPK 劃分為癌基因或抑癌基因。HNRNPK 在腫瘤中發(fā)揮的具體生物學(xué)功能可能與其和不同蛋白、RNA 相互作用從而參與多種信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。綜上所述,HNRNPK 的下調(diào)抑制了肝癌細(xì)胞HepG2 的增殖與遷移,表明HNRNPK 的異常表達(dá)可能促進(jìn)了肝癌的發(fā)展、且對(duì)多種腫瘤都有著至關(guān)重要的影響,深入研究HNRNPK 的作用機(jī)制可能為臨床腫瘤治療和預(yù)后提供新的思路。