李 婷,鄒秋萍,毛澤偉,吳石麗,何紅平,李艷平

(云南中醫(yī)藥大學中藥學院,昆明 650500)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種發(fā)生在直腸和結腸黏膜的慢性炎癥性疾病,病因未明,反復發(fā)作是其典型特征,對患者的生活造成極大的困擾,被WTO 列為難治癥之一,近年來UC 的發(fā)病率呈顯著上升趨勢[1-3]。UC 發(fā)病機制復雜,涉及患者的遺傳、免疫系統(tǒng)和環(huán)境因素之間的相互作用[4]。其中,慢性炎癥反應和免疫應答紊亂是造成UC 的關鍵病理環(huán)節(jié),而腸道內菌群紊亂又是造成炎癥反應和免疫應答改變的重要因素[5]。近年來,越來越多的研究表明腸道菌群失調與UC 的發(fā)生密切相關[6-7],主要表現(xiàn)為患者局部微脈管系統(tǒng)損傷,產生趨化因子,引起白細胞游出,從而擴大炎癥反應,這使得上皮屏障破壞,腸道中有害菌產物進入血液系統(tǒng)導致發(fā)病[8]。

三點金(Desmodium triflorum(L.)DC.)為豆科山螞蝗屬多年生植物,又名斑鳩窩,遍地金錢,在多種少數(shù)民族醫(yī)學著作中記載它的全草可以用來治療各種炎癥包括急性腸炎、大葉性肺炎、感冒發(fā)燒、咳嗽和肝炎[9]。本課題組前期的研究從云南省昆明市嵩明縣的豆科山螞蝗屬植物三點金中分離純化得到12 個化合物,包括牡荊素、異牡荊素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮等一系列黃酮及其苷類化合物。這些黃酮類化合物在抗炎方面表現(xiàn)出顯著的作用。如Yang 等[10]發(fā)現(xiàn)刺芒柄花素是通過上調Nrf2 的表達而起到抑制潰瘍性結腸炎的作用。Chao 等[11]發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮可通過抑制NF-κB 通路和JNK 通路活化抑制小鼠巨噬細胞炎性因子的產生。上述研究表明刺芒柄花素和毛蕊異黃酮可能對UC 也有一定的治療作用。因此,本研究探討了是否是通過三點金總黃酮及其兩個單體化合物的干預起到了對UC 小鼠的改善作用及腸道菌群失衡的調節(jié)作用,為民族藥三點金總黃酮及其兩個單體化合物作為UC 治療藥物提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 雄性小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(30 只,6 周齡,體重18～20 g)[SCXK(湘)2019-0004]。在SPF 級動物房飼養(yǎng),晝夜節(jié)律12 h/12 h,實驗前適應性飼養(yǎng)1 周。動物飼養(yǎng)使用標準鼠飼料和水,飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學動物房[SYXK(滇)K2017-0005]。所有動物實驗均經云南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審查通過(IACUC-06202006)并遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

刺芒柄花素(南京源植生物科技有限公司,批號:20180801)；毛蕊異黃酮(南京源植生物科技有限公司,批號:20170926),純度均大于95%；DSS(美國MP 公司,批號SR01606)；IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司,批號A201B90612 和A20600643)；DNA 提取試劑盒(美國Omega Bio-Tek 公司)；GeneJET 膠回收試劑盒(美 國 Thermo Scientific 公 司)；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(美國New England Biolabs 公司)。分析天平AR224CN(常州奧豪斯儀器有限公司)；超低溫冰箱(美國Thermo Scientific 公司)；酶標儀SPARK 10M(瑞士TECAN公司)；Ion S5TMXL(美國Thermo Fisher Scientific 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

將動物隨機分為正常組(N1)、模型組(M1)、三點金總黃酮組(TF1)(500 mg/kg)、毛蕊異黃酮組(F1)(100 mg/kg)和刺芒柄花素組(F2)(100 mg/kg),每組6 只。

1.3.2 三點金總黃酮的制備

在課題組前期工作的基礎,將民族藥用植物三點金的地上部分(1 kg)干燥后粉碎,用70%丙酮在室溫下超聲提取,提取液減壓濃縮得到總浸膏。所得浸膏用蒸餾水混懸,用石油醚萃取除去葉綠素,水相經乙酸乙酯萃取,萃取物濃縮后經大孔吸附樹脂柱,依此用水,90%,100%甲醇-水進行洗脫,90%甲醇-水洗脫部分減壓濃縮,經三氯化鐵反應鑒定90%甲醇-水洗脫部分富含黃酮類成分,即為三點金總黃酮。

1.3.3 造模方法及藥物干預

參照參考文獻[12]的造模方法及通過預實驗實踐后,將小鼠適應性飼養(yǎng)1 周,正常組和模型組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液、3 個給藥組TF1、F1 及F2 組灌胃給予相應濃度的藥物,連續(xù)給藥11 d,從第1 天開始,除正常組外,其余各組小鼠的飲用水更換為3% DSS 水溶液連續(xù)8 d,第9 天將3% DSS 水溶液更換為飲用水至實驗結束。

1.3.4 檢測指標與方法

(1)UC 小鼠的觀察與評分

參照參考文獻[13]中的方法,在實驗期間,每天觀察小鼠的體征狀態(tài)并記錄體重。通過小鼠的腹瀉及便血情況得出小鼠DAI 評分,判斷潰瘍性結腸炎模型是否構建成功。DAI 評分=(體重下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù))/3。DAI 的具體評分標準如表1。

表1 DAI 評分標準Table 1 Score criteria of DAI

(2)結腸病理切片觀察腸黏膜損傷程度

造模結束后,頸椎脫臼法處死小鼠,立即解剖,取小鼠結腸中段約1 cm 左右,于4%多聚甲醛中浸泡48 h 固定,脫水,石蠟包埋,制片(4 μm 厚),HE染色。參照參考文獻[14]中的方法進行組織病理學評分,如表2 所示。

表2 病理切片評分Table 2 Score of pathological section

(3)動物取血及血清處理

實驗結束當天,取眼眶血,3000 r/min,4℃離心10 min,收集上清。于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩０碋LISA 試劑盒說明書測定各組血清中IL-1β、IL-6含量。

1.3.5 小鼠糞便樣本采集

在實驗結束前1 d,確認模型成功后,用左手抓取小鼠,促使小鼠應激性排便,右手持無菌EP 管保證相對無菌環(huán)境下收集小鼠糞便。糞便收集結束后標記樣本,置于冰盒中,及時放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?避免反復凍融。

1.3.6 糞便DNA 提取和PCR 擴增純化

用DNA 提取試劑盒提取糞便中的總DNA 并檢測其提取質量。以帶有barcode 序列的515F 和806R 為引物,以細菌16S rRNA 基因的V4 可變區(qū)序列為靶標進行PCR 擴增,使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產物,剪切回收目標條帶,使用GeneJET 膠回收試劑盒回收產物。

1.3.7 文庫構建和上機測序

使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 試劑盒進行文庫的構建,經Qubit 定量和文庫檢測合格后,使用Ion S5TMXL 進行上機測序。測序分析內容包括:測序數(shù)據處理、OTU 聚類和物種注釋、樣品復雜度分析、多樣品比較分析及評估樣品中細菌菌群的豐富度和均勻度。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據。結果用平均數(shù)±標準差()表示,采用單因素方差分析方法(ANOYA)分析,以P＜0.05 表示統(tǒng)計學差異。使用Graphpad Prism7 軟件制圖。

2 結果

2.1 一般體征及DAI 評分結果

正常組小鼠精神狀態(tài),毛發(fā)色澤,進食及大便性狀均正常；模型組小鼠造模后第3 天,開始出現(xiàn)體重下降,精神萎靡,稀便并夾帶膿血,第5 天體重明顯下降,便血嚴重；TF1、F1 及F2 組在給藥后,雖然也有稀便,血便情況,體重也呈下降趨勢,但相比于模型組,均有不同程度的改善(圖1A)。

從實驗開始至結束,每天固定時間觀察小鼠糞便以進行DAI 評分。TF1、F1 及F2 組的小鼠在給藥后的第5 天,稀便,血便情況有所改善,第8 天出現(xiàn)活動增加,食量增加,其毛發(fā)、腹瀉、大便性狀等情況均有所改善,DAI 評分顯著降低(圖1B)。

圖1 各組小鼠體重變化和DAI 評分的影響(,n=6)Notes.N1,Control group.M1,Model group.F1,Calycosin group.F2,Formononetin group.TF1,Total flavones of Desmodium triflorum group.Compared with control group,## P ＜0.01.Compared with model group,*P ＜0.05,**P＜0.01.Figure 1 Effect of weight change and DAI score in each group

2.2 HE 染色及病理組織學評分

正常組小鼠上皮組織完整,可見明顯的隱窩及杯狀細胞,無炎癥細胞侵入。模型組小鼠上皮組織損傷嚴重,隱窩變形,杯狀細胞丟失,黏膜及黏膜下層有炎性細胞浸潤。而三點金總黃酮組、毛蕊異黃酮組及刺芒柄花素組組織學炎癥程度減輕,結腸隱窩結構變形不明顯。病理組織學評分顯示,與模型組相比,三點金總黃酮組和毛蕊異黃酮組評分顯著降低(P＜0.01)且改善效果優(yōu)于刺芒柄花素組(P＜0.05)(見圖2A、2B)。

圖2 各組小鼠結腸HE 染色及評分結果(HE 染色)(,n=6)Notes.(A),Control group.(B),Model group.(C),Calycosin group.(D),Formononetin group.(E),Total flavones of Desmodium triflorum group.Compared with control group,##P＜0.01.Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 2 Colon HE staining and scoring results of mice in each group(HE staining)

2.3 血清炎癥因子檢測結果

模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6 水平相較于正常組顯著升高(P＜0.01),給藥組IL-1β、IL-6 的水平有不同程度的降低,且毛蕊異黃酮組的效果優(yōu)于三點金總黃酮組和刺芒柄花素組(見圖3)。

圖3 各組小鼠血清中IL-1β、IL-6 水平比較(,n=6)Notes.Compared with control group,##P＜0.01.Compared with model group,**P＜0.01.Figure 3 Comparison of IL-1β and IL-6 levels in serum of mice in each group

2.4 小鼠腸道菌群測序結果

2.4.1 測序樣本質量檢測

由圖4A 可見小鼠糞便中OTU 數(shù)隨測序量不斷增加,最后趨于平穩(wěn),達到飽和狀態(tài),表明樣品測序質量符合要求。等級豐度曲線能夠反映物種的豐富度和均勻度。結果表明,5 組樣品的曲線最后都趨于平穩(wěn),表明物種分布均勻(圖4B)。其中正常組的等級豐度在400～580 之間,經DSS 誘導后,各組小鼠腸道菌群的物種總數(shù)降低,模型組的等級豐度在350～450 左右,經給藥治療后,TF1 組的等級豐度在500～750 之間,表明其腸道菌群的多樣性明顯提高；F1 組的等級豐度在400～550 之間,其微生物種群豐度趨向正常組,然而單體F2 組的等級豐度在300～400 之間,并未有顯著提高,且略低于模型組。

圖4 樣品稀釋曲線和豐度分布曲線Notes.N1,Control group.M1,Model group.F1,Calycosin group.F2,Formononetin group.TF1,Total flavones of Desmodium triflorum group.Figure 4 Sample dilution curve and rank abundance curve

2.4.2 小鼠腸道菌群多樣性分析

Observed species 和Shannon 指數(shù)是評價結腸菌群多樣性的重要指數(shù),其數(shù)值越高表明樣品物種豐富度越高。由圖5A 可見,相比于模型組,F1、F2 組觀察到的物種差異顯著,表明毛蕊異黃酮和刺芒柄花素顯著改變了小鼠的腸道微生物的多樣性。由圖5B 可見,相比于正常組,模型組腸道菌群多樣性降低。相較于模型組,TF1 組腸道菌群多樣性明顯升高,且恢復到正常組水平；F1 組呈略微升高的狀態(tài),但是F2 組對于腸道菌群多樣性沒有起到改善作用,表明三點金總黃酮對于腸道菌群多樣性的改善作用優(yōu)于其兩個單體化合物。

圖5 各組菌群多樣性情況Notes.N1,Control group.M1,Model group.F1,Calycosin group.F2,Formononetin group.TF1,Total flavones of Desmodium triflorum group.Figure 5 Diversity of each group

2.4.3 小鼠腸道菌群的整體變化

韋恩圖分析可提供各組間菌群OTU 數(shù)量及其種類交叉情況,主成分分析(PCA)檢測樣本間菌群豐度整體差異。結果表明,正常組、模型組、F1、F2以及TF1 組共有的OTU 數(shù)為453 個(圖6A)。與模型組相比,F1 處理組顯著性增加了OTU 數(shù)量但仍然略低正常組；F2 組減少了OTU 數(shù)量；TF1 組顯著性增加OTU 的數(shù)量且比正常組的更為豐富。由PCA 結果表明,各組間樣本均能明顯區(qū)分,說明小鼠腸道菌群的結構產生了一定的變化。給藥組腸道菌群結構與模型組相比發(fā)生了一定偏移,值得注意的是F1 和TF1 組有向正常組回歸的趨勢,然而刺芒柄花素并沒有這個趨勢(圖6B)。說明毛蕊異黃酮和三點金總黃酮能一定程度上促進腸道菌群多樣性及結構的恢復,而刺芒柄花素對于腸道菌群多樣性及結構沒有起到恢復的作用,則可能主要是通過降低致病菌的數(shù)量而起到治療UC 的作用。

圖6 腸道菌群整體輪廓變化韋恩圖和PCA 分析Notes.N1,Control group.M1,Model group.F1,Calycosin group.F2,Formononetin group.TF1,Total flavones of Desmodium triflorum group.Figure 6 Venn and PCA analysis of changes in the overall profile of intestinal flora

2.4.4 小鼠腸道菌群物種差異分析

在科水平上,Muribaculaceae和毛螺菌科(Lachnospiraceae)是正常組的優(yōu)勢菌株,其相對豐度分別為28.52%和19.35%；模型組中擬桿菌科(Bacteroidaceae),韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae),瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)以及毛螺菌科系優(yōu)勢菌株,相對豐度分別為22.84%,16.39%,11.48%和10.74%。與正常組相比,模型組中Muribaculaceae(7.66%)和毛螺菌科(10.74%)的相對豐度顯著的降低,而條件致病菌擬桿菌科的豐度(22.84%)比正常組(2.26%) 極大地升高。F1 組中桿菌科(Enterobacteriaceae),擬桿菌科以及毛螺菌科則為主要的優(yōu)勢菌株,其相對豐度分別為23.54%,18.80%,以及12.46%,其中毛螺菌科的相對豐度較模型組非常接近,但致病菌群螺桿菌科(Helicobacteraceae)的相對豐度(0.78%)相較于正常組(2.49%)和模型組(2.09%)發(fā)生了顯著性地降低。F2 組桿菌科和擬桿菌科為其優(yōu)勢菌群,相對豐度分別為43.50%和13.53%,其中擬桿菌科的豐度與F1 處理組較為接近,且致病菌群螺桿菌科的相對豐度(0.43%)相較于F1 組進一步的降低。TF1組中Muribaculaceae,毛螺菌科以及擬桿菌科為其優(yōu)勢菌群,相對豐度分別為13.81%,20.18%以及11.12%,與以上各組相比,Muribaculaceae和毛螺菌科再次成為優(yōu)勢菌群(與正常組一致),這表明總黃酮對于結腸炎小鼠腸道微生物的調節(jié)和恢復有較好的作用(見圖7A)。

屬水平上,有益菌乳酸菌屬(Lactobacillus)為正常組優(yōu)勢菌群,相對豐度為15.55%,而模型組該屬則降低為1.97%,取而代之的條件致病菌擬桿菌(Bacteroides)的豐度則極為提升,為22.84%,說明在結腸炎模型組中,有益菌極大的減少,機會致病菌大量增殖。通過F1、F2、TF1 處理后,條件致病菌擬桿菌雖然仍然為3 個組中的優(yōu)勢菌群,但是其相對豐度(18.80,13.52,11.12)相比模型組均有顯著性地降低,同時F1 與TF1 處理組中,乳酸菌屬的相對豐度也比模型組(1.97%)分別提升了約2～3 倍(4.06%和6.28%)(見圖7B)。

圖7 科水平和屬水平小鼠腸道微生物的富集Notes.N1,Control group.M1,Model group.F1,Calycosin group.F2,Formononetin group.TF1,Total flavones of Desmodium triflorum group.Figure 7 Enrichment of intestinal microflora in mice at family level and genus level

進一步對種水平上對機會致病菌擬桿菌和大腸桿菌的分析發(fā)現(xiàn)F1、F2 以及TF1 處理組可以顯著降低其豐度(見圖8)。

圖8 機會致病菌擬桿菌在小鼠腸道微生物中的富集Notes.N1,Control group.M1,Model group.F1,Calycosin group.F2,Formononetin group.TF1,Total flavones of Desmodium triflorum group.Figure 8 Enrichment of Bacteroides acidifaciens in intestinal microflora of mice

2.4.5 LefSe 分析

LefSe 分析可結合非參數(shù)檢驗和線性判別來確定豐度較高的微生物。由圖9 可看出,正常組顯著最高的是Muribaculaceae科和厚壁菌門(Firmicutes),模型組是擬桿菌科和擬桿菌屬,F1 處理組顯著最高的是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和大腸桿菌(Escherichia coli),F2 處理組顯著最高的是變形菌門 (Proteobacteria)、變形菌(Gammaproteobacteria)、腸桿菌科和腸桿菌目(Enterobacterales)；TF1 處理組顯著最高的是梭菌綱(Clostridia)和梭菌目(Clostridiales)。結果表明,經三點金總黃酮、毛蕊異黃酮和刺芒柄花素可能是通過改變菌群的結構組成而發(fā)揮作用。

圖9 線性判別分析效應大小識別細菌的不同豐度Notes.N1,Control group.M1,Model group.F1,Calycosin group.F2,Formononetin group.TF1,Total flavones of Desmodium triflorum group.Figure 9 Linear discriminant analysis effect size to identify different abundances of bacteria

3 討論

近年來,隨著膳食結構和環(huán)境的變化,UC 發(fā)病率在全球呈現(xiàn)逐年上升趨勢,以歐洲和北美最高,嚴重影響了患者的生活質量[15]。臨床上,雖然5-氨基水楊酸和皮質類固醇等藥物可抑制炎癥,一些免疫調節(jié)劑和抗生素可用于治療類固醇耐藥或依賴的患者,但價格昂貴及治療后的繼發(fā)感染、敏感性降低和副作用大等安全性問題使得醫(yī)生和UC 患者難以接受,嚴重影響UC 的治療效果[16]。近年來研究表明,多種黃酮類化合物如毛蕊異黃酮,黃芩素,刺芒柄花素等對炎性腸病有一定的改善作用[10,17-18]。本研究通過對DSS 誘導的UC 小鼠的體重、結腸組織病理及血清中IL-1β 和IL-6 因子水平的檢測,表明三點金總黃酮,毛蕊異黃酮及刺芒柄花素均可以抑制小鼠的體重下降、DAI 評分的增高；通過HE 染色及病理組織學評分得出三點金總黃酮和毛蕊異黃酮的改善效果優(yōu)于刺芒柄花素；然而對于IL-1β、IL-6 水平的抑制效果,則毛蕊異黃酮的效果優(yōu)于三點金總黃酮和刺芒柄花素,綜上結果表明毛蕊異黃酮對于UC 小鼠的治療作用優(yōu)于三點金總黃酮和刺芒柄花素。

腸道菌群與潰瘍性結腸炎的發(fā)生發(fā)展關系密切,越來越多的學者研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群紊亂可能是潰瘍性結腸炎發(fā)生、發(fā)展的始動因素[19]。腸道正常菌群在腸道免疫系統(tǒng)的組成和營養(yǎng)物質的代謝,腸道微生態(tài)平衡等多方面起到十分重要的作用。Nishikawa 等[20]和吳瑞麗等[21]發(fā)現(xiàn)UC 患者人群的腸道菌群數(shù)量和結構多樣性明顯低于健康人群。梁淑文等[22]通過比較UC 與健康組的腸道菌群,發(fā)現(xiàn)UC 活動期優(yōu)勢菌乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌、真桿菌、消化球菌的菌群數(shù)量顯著減少,而條件致病菌如大腸桿菌,小梭菌菌群等數(shù)量顯著增加。以上研究表明腸道細菌多樣性降低、菌群結構的破壞以及致病菌的增加等導致的腸道菌群失衡在UC 中起著重要的作用。黃酮類天然產物被證明能夠抑制細菌生物膜的形成、抑制細菌的能量代謝,抑制或殺死某些共生菌和病原體,減少細菌產生的毒素如硫化氫和脂多糖,進而改善腸道的生態(tài)平衡,起到改善潰瘍性結腸炎的作用[23]。

本研究探討了三點金總黃酮,毛蕊異黃酮及刺芒柄花素對UC 小鼠腸道菌群的調節(jié)作用。結果顯示,三點金總黃酮和毛蕊異黃酮能夠改善和部分恢復菌群多樣性,但是刺芒柄花素對菌群多樣性卻沒有改善作用。徐豪明[24]的研究證實在TNBS 誘導腸炎小鼠腸道菌群中,條件致病菌擬桿菌和產酸擬桿菌的相對豐度明顯升高,而經5-氨基水楊酸干預之后均顯著下降。從目前的結果來看,總黃酮的效果總體上優(yōu)于其兩個單體化合物,這很可能系協(xié)同效果所致。刺芒柄花素沒有提高物種多樣性,但是可能從降低條件致病菌擬桿菌而發(fā)揮作用。

綜上所述,三點金總黃酮,毛蕊異黃酮以及刺芒柄花素對UC 有一定的治療作用且毛蕊異黃酮優(yōu)于三點金總黃酮和刺芒柄花素,然而對于恢復腸道菌群多樣性和改善腸道菌群結構來看,三點金總黃酮的效果總體上優(yōu)于其兩個單體化合物,這為UC治療藥物的研究提供了參考依據。