嚴 琳,李亞萍,王 冬,賈文琴,閻文軍

(甘肅省人民醫(yī)院麻醉手術(shù)科,蘭州 730000)

心肌缺血是世界上最常見圍術(shù)期死亡的原因。目前心肌缺血的主要治療方法是及時再灌注。然而,再灌注方法使心肌更容易受到嚴重損傷,稱為心肌缺血再灌注損傷(I/R),這限制了再灌注治療的發(fā)展[1]。芬太尼(fentanyl)作為阿片受體激動劑,作用于邊緣系統(tǒng)與情緒有關(guān)的阿片類受體,有消除緊張和焦慮的作用。由于具有鎮(zhèn)痛效價高、降低心肌氧耗及無組胺釋放的優(yōu)勢,目前已廣泛應用于手術(shù)前誘導、術(shù)中維持以及術(shù)后的鎮(zhèn)靜與鎮(zhèn)痛,已基本取代嗎啡。丙泊酚(propofol)具有起效快、蘇醒迅速的特點,目前已是臨床上常用的靜脈麻醉藥物。研究表明,芬太尼及丙泊酚可抑制NF-κB 的過度產(chǎn)生,從而減輕組織器官缺血/再灌注損傷的作用[2]。自噬在心肌I/R 中是把雙刃劍:在缺血時,自噬保護心肌,但過度自噬在再灌注時損害心肌[3]。然而目前關(guān)于芬太尼以及丙泊酚二者單獨使用對心肌缺血再灌注損傷的保護效果如何以及聯(lián)合應用在心肌缺血再灌注損傷中是否優(yōu)于單純使用芬太尼或丙泊酚尚不清楚。因此,本研究基于自噬作用,探究芬太尼、丙泊酚及其聯(lián)合使用對心肌缺血再灌注損傷的治療作用,為進一步明確其具體機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF 級SD 大鼠30 只,8 周齡,(250±20)g,購于成都達碩生物有限公司[SCXK(川)2020-030]。實驗在甘肅中醫(yī)藥大學[SYXK(甘)2021-0004]進行,整個實驗飼養(yǎng)條件為自由采食及飲水,12 h/12 h 光照/黑暗條件下正常飼養(yǎng),溫度約(22±2)℃。本研究的動物實驗經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(IACUC-2021-248),并遵守審批內(nèi)容實施,實驗符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

TUNEL 試劑盒(Vazyme,南京,中國,No.A112-01)；TTC 試劑(Sangon,上海,中國,No.298-96-4)；LC3B (ab192890)、Beclin1 (ab210498)、ATG5(ab108327)、β-actin(ab8226)抗體均購自Abcam 公司(Cambridge,美國)。CKX41 光學顯微鏡(170 Olympus,Tokyo,日本)；EM-1400PLUS 透射電鏡(JEOL,Tokyo,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組與造模

(1)I/R 造模

造模方法根據(jù)已有報道進行造模[4],具體步驟為:各組大鼠均腹腔注射l%戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉,固定于實驗臺。胸部剃毛、常規(guī)消毒。然后將氣管插管后接入動物呼吸機通氣,通氣頻率為每分鐘60～80 次,潮氣量5 mL。于左鎖骨中線第4 肋間開胸,暴露心臟,用尼龍線結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min,后松開結(jié)扎線再灌注2 h,建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型。

(2)實驗分組

將30 只大鼠隨機分為5 組,每組6 只大鼠:假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、芬太尼治療組(Fentanyl)、丙泊酚治療組(Propofol)和芬太尼+丙泊酚治療組(Fentanyl+propofol)。模型組只行左冠狀動脈前降支結(jié)扎30 min,芬太尼治療組結(jié)扎前給予20 μg/kg 芬太尼,之后結(jié)扎30 min；丙泊酚治療組結(jié)扎前給予50 mg/kg 丙泊酚,芬太尼+丙泊酚治療組給予20 μg/kg 芬太尼以及50 mg/kg 丙泊酚后結(jié)扎30 min。假手術(shù)組按照I/R 造模中同樣的方式打開胸腔,不進行左冠狀動脈前降支結(jié)扎和藥物治療,其余處理與I/R 造模處理方法一致(與其余4組時間相同)。實驗完成后,處死,迅速取出大鼠心臟用于后續(xù)檢測。

1.3.2 檢測指標

(1)HE 染色

將心臟組織用4%多聚甲醛固定后,石蠟塊包埋、脫水、切片,然后分別用蘇木精和伊紅染色,通過光學顯微鏡觀察染色結(jié)果。

(2)TUNEL 染色

采用TUNEL 試劑盒對心臟組織凋亡進行檢測。Proteinase K 和2%過氧化氫修復后,將心臟切片與50 μL 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應混合物在37℃黑暗環(huán)境中覆蓋60 min。然后用SSC 溶液停止15 min,最后用DAPI 染色對細胞核進行染色,在488 nm 的激發(fā)光照射下可視化。

(3)TTC 染色

收集新鮮心臟,其切成2～3 mm 的切片,將切片在1% 2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)溶液中于37℃避光孵育20 min。使用Image J 軟件拍攝和分析圖像。

(4)電鏡

將新鮮心臟組織用PBS 清洗后,先固定在冰冷3%戊二醛溶液中,然后用1%四氧化鋨再固定。脫水切片后,先用醋酸鈾染色10 min,再用枸櫞酸鉛染色1 min,室溫下染色,JEM-1400PLUS 透射電鏡觀察。

(5)Western blot

使用蛋白提取試劑盒提取心臟組織中總蛋白,通過BCA 蛋白試劑盒測定總蛋白含量。接下來采用SDS-PAGE 分離蛋白,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)PVDF 膜上,置于4℃下添加一抗LC3B、Beclin1、ATG5 與β-actin抗體(1 ∶500),孵育過夜。洗滌后添加對應的二抗(1 ∶5000),常溫下孵育2 h。以β-actin 為內(nèi)參,對LC3B、Beclin1、ATG5 蛋白水平進行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用GraphPAD 8 軟件進行處理,結(jié)果用平均數(shù)±標準差()表示兩組之間比較采用非配對T檢驗,3 組及以上比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD 方法檢驗,P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 芬太尼復合丙泊酚對心臟缺血再灌注大鼠心臟組織病理損傷的作用

假手術(shù)組大鼠心臟組織結(jié)構(gòu)清晰,心肌纖維形態(tài)正常,間質(zhì)內(nèi)無炎性細胞浸潤,細胞凋亡數(shù)目極少；跟假手術(shù)組相比,模型組大鼠出現(xiàn)多量心肌纖維壞死,胞核溶解消失,壞死區(qū)域或間質(zhì)見炎性細胞浸潤,亦見出血,少量紅細胞溢出,此外還見細胞大量凋亡。與模型組相比,芬太尼治療組、丙泊酚治療組和芬太尼+丙泊酚治療組均減少了模型大鼠的心肌纖維壞死、炎性細胞浸潤、出血及細胞凋亡,其中芬太尼+丙泊酚治療在3 個治療組中表現(xiàn)了最好的治療效果,芬太尼治療與丙泊酚治療之間沒有顯著差異,見圖1。

圖1 通過HE 和TUNEL 染色觀察大鼠心臟組織病理損傷Note.Compared with model group,***P＜0.001.Compared with fentanyl+propofol group,&P＜0.05.Figure 1 HE and TUNEL staining were used to observe the pathological damage of rat heart tissue

2.2 TTC 染色觀察大鼠心肌梗塞面積

TTC 染色結(jié)果表明,假手術(shù)組大鼠未發(fā)生心肌梗塞,而通過缺血再灌注造模后,模型組大鼠心臟出現(xiàn)心肌梗塞；與模型組相比,芬太尼治療組、丙泊酚治療組和芬太尼+丙泊酚治療組大鼠心肌梗塞面積顯著減少,并且3 個治療組中,芬太尼+丙泊酚治療組大鼠心肌梗塞面積減少最顯著,而芬太尼治療組與丙泊酚治療組之間沒有顯著差異,見圖2。

圖2 TTC 染色觀察大鼠心肌梗塞Note.Compared with model group,***P＜0.001.Compared with fentanyl+propofol group,&&&P＜0.001.Figure 2 TTC staining was used to observe myocardial infarction in rats

2.3 透射電鏡觀察大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)

透射電鏡結(jié)果表明,假手術(shù)組大鼠心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較正常,肌原纖維排列整齊,暗帶、Z 線及M線清晰平直,線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠心肌細胞的多數(shù)線粒體發(fā)生腫脹,嵴斷裂、溶解,甚至消失。與模型組相比,芬太尼治療組、丙泊酚治療組和芬太尼+丙泊酚治療組大鼠心肌細胞的線粒體腫脹程度減輕,其中芬太尼+丙泊酚治療組的線粒體腫脹改善程度最顯著,芬太尼治療組和丙泊酚治療組之間沒有顯著差異,見圖3。

圖3 透射電鏡觀察心肌線粒體結(jié)構(gòu)Note.Black arrow,Mitochondrial swelling.Figure 3 Structure of myocardial mitochondria and the formation of autophagy vacuoles were observed by transmission electron microscopy

2.4 Western blot 檢測大鼠心臟組織自噬相關(guān)蛋白的表達

Western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白的結(jié)果如圖4所示,與假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠心臟組織Beclin1、ATG5 和LC3B-Ⅱ的蛋白表達以及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值顯著升高,LC3B-Ⅰ蛋白表達顯著減少,表明缺血再灌注激活了大鼠心臟組織的自噬；與模型組相比,芬太尼治療組、丙泊酚治療組和芬太尼+丙泊酚治療組大鼠心臟組織Beclin1、ATG5 和LC3B-Ⅱ的蛋白表達以及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值顯著降低,LC3B-Ⅰ蛋白表達顯著增加,表明芬太尼治療、丙泊酚治療和芬太尼+丙泊酚治療均有效降低I/R 大鼠的心臟組織自噬,其中芬太尼+丙泊酚治療表現(xiàn)最好,芬太尼治療與丙泊酚治療之間沒有顯著差異。

圖4 Western blot 檢測大鼠心臟組織自噬相關(guān)蛋白的表達Note.Compared with model group,***P＜0.001.Compared with fentanyl+propofol group,&&&P＜0.001.Figure 4 Expression of autophagy related proteins were detected by western blot in rat heart tissue

3 討論

盡管對I/R 損傷的研究歷史悠久,但研究人員仍在不斷嘗試進一步研究這一現(xiàn)象。目前認為細胞凋亡是缺血再灌注損傷引起細胞死亡的主要原因[5-6]。有報道表明芬太尼、丙泊酚可通過抑制細胞凋亡作用進而減輕大鼠的I/R 損傷[7-8]。我們研究發(fā)現(xiàn),單獨使用20 μg/kg 芬太尼、50 mg/kg 丙泊酚及其聯(lián)合使用均能有效減少缺血再灌注引起的心臟細胞凋亡,減輕心臟組織的損傷；其中,20 μg/kg 芬太尼和50 mg/kg 丙泊酚對I/R 損傷的治療效果之間沒有顯著差異,而20 μg/kg 芬太尼與50 mg/kg 丙泊酚聯(lián)合使用比他們的單獨使用療效更好,說明芬太尼與丙泊酚對抑制I/R 損傷有協(xié)同作用。

心肌梗死面積大小也是評價I/R 損傷療效的重要指標之一。已有研究表明,20 mg/kg,40 mg/kg和60 mg/kg 丙泊酚能有效減少I/R 大鼠心肌梗死面積、心臟內(nèi)膜出血和炎性細胞浸潤,提示丙泊酚可一定程度改善大鼠心肌再灌注心肌病理損傷[9]。此外,李方江等[10]研究表明5 μg/kg 芬太尼能有效減少兔I/R 損傷心肌梗死面積,并有效減少心率失常的發(fā)生率。然而,丙泊酚與芬太尼聯(lián)合使用是否對I/R 損傷心肌梗死有更好的治療效果尚不清楚。我們研究表明,20 μg/kg 芬太尼和50 mg/kg 丙泊酚均對I/R 大鼠心肌梗死有顯著的治療效果,但兩者的治療效果并沒有顯著差異；進一步地,我們研究還發(fā)現(xiàn)20 μg/kg 芬太尼和50 mg/kg 丙泊酚聯(lián)合使用對I/R 大鼠心肌梗死的治療效果優(yōu)于它們的單獨使用,說明芬太尼與丙泊酚對I/R 損傷心肌梗死的治療有協(xié)同作用。

線粒體是急性I/R 發(fā)作后心肌細胞命運的關(guān)鍵決定因素。特別是,急性I/R 會誘導線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開放,這是一種通過解偶聯(lián)氧化磷酸化并導致線粒體腫脹來介導心肌細胞凋亡的事件[11-12]。因此我們推測芬太尼和丙泊酚通過改善線粒體損傷減少心肌細胞凋亡。本研究結(jié)果表明:20 μg/kg 芬太尼和50 mg/kg 丙泊酚均顯著抑制了I/R 大鼠的心肌細胞線粒體腫脹,兩者之間并沒有顯著差異；此外20 μg/kg 芬太尼和50 mg/kg 丙泊酚聯(lián)合使用對抑制I/R 大鼠心肌細胞線粒體腫脹比它們單獨使用有更好的作用。這些結(jié)果表明,芬太尼和丙泊酚均可以抑制I/R 損傷引起的心肌細胞線粒體腫脹,從而減少細胞凋亡,并且芬太尼和丙泊酚對抑制I/R 損傷引起的心肌細胞線粒體腫脹有協(xié)同作用。

自噬是一種生理過程,細胞中受損的蛋白質(zhì)或細胞器會被隔離在自噬體內(nèi),然后與溶酶體融合進行降解[13]。研究表明,腫脹的線粒體失去線粒體膜電位(ΔΨm),啟動PINK1-PRKN 通路進行自噬[14]。然而,過度的自噬會促進細胞死亡和凋亡[15-17],尤其是心肌細胞和內(nèi)皮細胞。在某些情況下,自噬失調(diào)和持續(xù)的自噬會抑制細胞增殖,甚至加速心肌細胞死亡和凋亡[18-19],而心肌再灌注損傷是過度自噬的結(jié)果[20]。同時,功能失調(diào)的自噬也會加重線粒體氧化應激和損傷[21]。此前有研究表明,異丙酚通過調(diào)控自噬相關(guān)基因抑制心肌凋亡,減輕I/R 損傷[22-23]。為進一步地探究芬太尼、丙泊酚及其聯(lián)合使用對I/R 損傷心肌自噬的調(diào)節(jié)作用,我們對自噬相關(guān)蛋白進行了檢測。ATG5 作為ATG12-ATG5-ATG16 復合物的一部分,在自噬囊泡形成中必不可少[24-25]。ATG12-ATG5-ATG16 復合物定位于膜外表面,使ATG8(LC3)與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合形成ATG8-PE 復合物,促進自噬膜的伸長、閉合并形成自噬體和溶酶體[24],而自噬體與溶酶體的融合需要Beclin1 介導[26-27]。我們的研究顯示,20 μg/kg芬太尼和50 mg/kg 丙泊酚抑制了I/R 中心臟組織Beclin1、ATG5 和LC3B-Ⅱ的蛋白表達,降低了LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值,增加了LC3B-Ⅰ蛋白的表達,表明芬太尼與丙泊酚對I/R心肌細胞自噬有抑制作用,此外,本研究也表明了芬太尼與丙泊酚對I/R 心肌細胞自噬抑制的協(xié)同作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)芬太尼和丙泊酚都能抑制自噬,同時減輕線粒體腫脹改善I/R 大鼠心肌細胞損傷,其中芬太尼與丙泊酚有協(xié)同作用,但芬太尼與丙泊酚對改善I/R 心肌細胞損傷的協(xié)同作用僅做了一個初步探索,其具體機制及最佳配比還需進一步研究。