陳麗萍，周慧，張信，尤興田

（揚州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 揚州 225127）

黃體酮是孕激素類藥物，生理效應(yīng)及臨床治療作用廣泛，應(yīng)用歷史悠久。目前，黃體酮在《中國藥典》2015年版二部中已有收載，高效液相色譜法測定其含量與有關(guān)物質(zhì)的檢測波長為241 nm[1-2]。鑒于黃體酮在生產(chǎn)中引入的中間體氫化物（5-孕甾烯-3β-醇-20-酮 3-醋酸酯）和水化物（5-孕甾烯-3β-醇-20-酮）在藥典條件下不能檢測，為保證各有關(guān)物質(zhì)快速準(zhǔn)確的測定，本文創(chuàng)建了高效液相色譜法波長200 nm 的檢測方法，有利于更好地提高黃體酮質(zhì)量和生產(chǎn)的穩(wěn)定性，該方法未見藥典收載，也未見文獻報道。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

Agilent 1260 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）。黃體酮對照品，批號100027-201209，純度99.7%，中國藥品生物制品鑒定所；黃體酮供試品，批號HT-p201806001，江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)有限公司；水解物工作對照品（精制品），批號HT-a20180201，AR，上海青析化工科技有限公司；氫化物工作對照品（中間體），批號20180201，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，天津康科德科技有限公司；水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件色譜柱為Kromasill00-5 C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈-水（25∶35∶40）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測波長200 nm；進樣體積10 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取黃體酮對照品約40 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃體酮對照品儲備液。精密吸取黃體酮儲備液1.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃體酮對照品溶液。

取水解物工作對照品（精制品）約10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為氫化物工作對照品儲備溶液。精密吸取1.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為水解物工作對照品溶液。

取氫化物工作對照品（中間體）約10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中,加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為氫化物工作對照品儲備溶液。精密吸取1.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為氫化物工作對照品溶液。

1.2.3 黃體酮堿破壞溶液

取本品黃體酮對照品約25 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉甲醇溶液10 mL 使溶解，置60 ℃水浴4 h，放冷；用1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻。

1.2.4 黃體酮系統(tǒng)適用性溶液

精密吸取氫化物、水解物工作對照品儲備溶液各1.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加黃體酮堿破壞溶液稀釋至刻度，搖勻，作為黃體酮（粗品）系統(tǒng)適用性溶液。

1.2.5 黃體酮試驗溶液

取本品約10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加少量稀釋液溶解，精密吸取氫化物、水解物工作對照品儲備溶液各1.0 mL，加稀釋液至刻度，搖勻，作為黃體酮系統(tǒng)適用性溶液。

2 實驗結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 專屬性考察

在1.2.1 節(jié)色譜條件下進樣，記錄色譜圖如圖1所示，黃體酮主要雜質(zhì)分離結(jié)果如表1所示。黃體酮在241 nm 有吸收，而已知雜質(zhì)在241 nm 無吸收（圖1A），在波長200 nm 下黃體酮和已知雜質(zhì)水解物、氫化物以及堿破壞降解雜質(zhì)有吸收（圖1B）。由表1的結(jié)果可以看出，黃體酮和已知雜質(zhì)水解物、氫化物以及堿破壞降解雜質(zhì)的均可達到有效分離，表明該法的專屬性好，可以有效檢測黃體酮生產(chǎn)過程中在各苛刻條件下（堿水解）的降解產(chǎn)物及中間產(chǎn)物。

圖1 專屬性試驗色譜圖

表1 黃體酮主要雜質(zhì)分離結(jié)果

2.1.2 線性范圍

2.1.2.1 黃體酮的線性范圍

分別精密量取黃體酮儲備液適量，加稀釋溶劑稀釋制成1 200、1 000、500、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1的溶液，搖勻。按上述色譜系統(tǒng)（1.2.1），將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進樣，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得線性回歸方程及關(guān)系，結(jié)果如表2所示。由表2可知，黃體酮（200 nm 波長）在0.25～1 200 μg·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2為1.000 0 和0.999 93，n=7）。

2.1.2.2 有關(guān)物質(zhì)的線性范圍

分別精密量取適量水解物對照品儲備溶液，加稀釋溶劑稀釋制成100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1的溶液，搖勻。

分別精密量取適量氫化物工作對照品儲備溶液，加稀釋溶劑稀釋制成100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1的溶液，搖勻。

按上述色譜系統(tǒng)（1.2.1）將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進樣，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表2所示。水解物在0.26～104 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2=1.000 0，n=6），氫化物在 0.26～105 μg·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2=1.000 0，n=6）。

表2 線性關(guān)系測定結(jié)果

2.1.3 定量限與檢測限

黃體酮、水解物、氫化物定量限溶液：精密吸取黃體酮對照品溶液0.4 mL、水解物工作對照品溶液5.0 mL、氫化物工作對照品溶液6.0 mL，置100 mL 容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為黃體酮、水解物、氫化物定量限溶液。

黃體酮、水解物、氫化物檢測限溶液：精密吸取黃體酮、水解物、氫化物定量限溶液3.0 mL，置10 mL 容量瓶中,加稀釋液6.0 mL，搖勻，作為黃體酮、水解物、氫化物檢測限溶液

按本法測定，精密量取上述定量限溶液、檢測限溶液分別進樣10 μL，當(dāng)信噪比S/N≥10 時，作為定量限溶液；當(dāng)信噪比S/N≥3 時，作為檢測限溶液。同時取各定量限溶液連續(xù)進樣6 針，記錄色譜圖。結(jié)果表明，黃體酮、水解物和氫化物的定量限分別為0.040、0.517、0.640 μg·mL-1，均小于限度質(zhì)量濃度（1.0 μg·mL-1）；檢測限質(zhì)量濃度分別為0.013、0.172、0.213 μg·mL-1，均小于限度質(zhì)量濃度（0.5 μg·mL-1）。

2.1.4 精密度試驗

2.1.4.1 重復(fù)性

取6 份樣品溶液檢測，黃體酮、水解物、氫化物、未知雜質(zhì)含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.02%、0、7.81%、0.37%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性好。

2.1.4.2 中間精密度

2 位操作人員于2 天內(nèi)分別按1.2.2 方法配制6份樣品溶液進行分析，記錄峰面積。2 位人員于2天內(nèi)測得的黃體酮、水解物、氫化物、未知雜質(zhì)含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.24%、0、0.39%、0.5%，結(jié)果表明方法的中間精密度符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.5 方法耐用性

固定其他色譜條件不變，將上述色譜條件分別改變流速（0.95、1.05 mL·min-1）、色譜柱溫度（28、32 ℃）后進樣，對水解物、黃體酮、堿降解物、氫化物分離度進行考察，實驗結(jié)果表明，在上述色譜條件下，黃體酮與3 種雜質(zhì)的分離度好，3 種雜質(zhì)與黃體酮的相對保留時間（RRT）沒有顯著變化，各組分的含量基本恒定。因此，色譜條件的細(xì)微變化對測定結(jié)果沒有影響。

2.2 樣品測定

按 1.2.2 方法分別配制混合對照品溶液和樣品溶液，按色譜系統(tǒng)1.2.1 色譜條件分別進樣分析，按外標(biāo)法計算黃體酮及各已知雜質(zhì)的含量，其他未知雜質(zhì)含量按不加校正因子的主成分自身對照法計算。樣品測定結(jié)果見表3。

表3 黃體酮樣品的測定結(jié)果

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜法200 nm 波長下測定黃體酮及有關(guān)物質(zhì)的含量，本方法具有一定專屬性、靈敏度、準(zhǔn)確性、耐用性，可以作為黃體酮粗品、精制品質(zhì)量的有效檢驗、監(jiān)控。在黃體酮粗品波長200 nm 檢測試驗中，除了已知雜質(zhì)水解物、氫化物等峰外，還檢測出未知雜質(zhì)峰。雜質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、來源有待進一步分析研究，生產(chǎn)中暫歸化法檢測監(jiān)控。