趙柏霞，閆建芳，潘鳳榮

(1.大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116036；2.大連民族大學(xué)，遼寧 大連 116600)

【研究意義】大連市依托其得天獨(dú)厚的地理位置和氣候條件，作為中國(guó)為數(shù)不多甜櫻桃(Cerasusavium)適栽區(qū)之一，栽培歷史悠久。近年來，在櫻桃栽培面積迅速增加，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大的同時(shí)，果園土壤肥力下降、水土流失等問題也逐漸顯現(xiàn)出來[1]。果園生草栽培在19世紀(jì)始于西方發(fā)達(dá)國(guó)家，近些年，在諸多發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)得到了廣泛的運(yùn)用，據(jù)報(bào)道，55%～70%的果園都采用了生草栽培模式，有的國(guó)家甚至達(dá)到95%左右。我國(guó)從20世紀(jì)80、90年代才開始推行果園生草模式，目前的普及率僅有10%左右[2-3]。果園生草具有改善土壤的物理性狀、降低土壤容重[4-5]、增加土壤滲水性和持水能力[6-7]、提高土壤肥力[8-10]、調(diào)節(jié)果樹根系周圍的溫濕度等作用[11-12]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，我國(guó)科研工作者在果園生草方面做了大量的工作，主要集中在蘋果園、橘園、梨園等，研究方向主要是果園土壤理化性質(zhì)和土壤肥力[13-15]、微生物群落變化[16-17]、果實(shí)品質(zhì)[18-19]、草種選擇[20-21]、葉片特性[22-23]等方面。目前，關(guān)于在櫻桃果園進(jìn)行生草栽培研究則較少，李芳東等[24]研究發(fā)現(xiàn)，甜櫻桃果園生草可以降低0～30 cm土壤日最高溫度和晝夜溫差，增大土壤含水量，谷巖[8]研究發(fā)現(xiàn)，甜櫻桃園間作紫花苜?？梢杂行岣咄寥烙行юB(yǎng)分含量，增加團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，使土壤肥力顯著提高。但是，甜櫻桃果園行間生草對(duì)土壤微生物群落動(dòng)態(tài)的影響鮮有報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)在甜櫻桃果園行間種植鼠茅草(Vulpiamyuros)、黑麥草(Loliumperenne)、鋪設(shè)園藝地布，并以清耕為對(duì)照，開展不同處理方式對(duì)土壤養(yǎng)分和細(xì)菌群落特性影響的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探明甜櫻桃果園生草后土壤養(yǎng)分結(jié)構(gòu)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，篩選出適宜種植的生草品種，以期為甜櫻桃果園生草栽培奠定基礎(chǔ)，為構(gòu)建合理的甜櫻桃果園土壤管理模式提供理論依據(jù)，推動(dòng)果園種植業(yè)的綠色健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)櫻桃園位于遼寧省大連市甘井子區(qū)大連農(nóng)科院櫻桃園，該園地位于121° E，39° N，屬暖溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫10 ℃，年降雨量550～800 mm，無霜期180～200 d，年平均日照時(shí)數(shù)2500～2800 h。地塊平整，土壤為砂壤土。2013年建園，株行距3.0 m×4.0 m。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018年9月開始播種試驗(yàn)，采取果樹行間種草，條播種植。果樹株行距為4 m×3 m，試驗(yàn)設(shè)種植鼠茅草(S)、種植黑麥草(H)、鋪設(shè)園藝地布(D)和清耕對(duì)照(Q)4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)處理小區(qū)面積為100 m2，共12個(gè)處理小區(qū)。各處理管理措施基本一致，常規(guī)管理。

1.3 土壤溫濕度測(cè)定

試驗(yàn)與2020年4—7月進(jìn)行，使用土壤溫濕度記錄儀(型號(hào)為T2S-2X，浙江托普云科技有限公司生產(chǎn))測(cè)定土壤的溫度、水分。分別在4月和7月兩次測(cè)定土壤的溫濕度。

1.4 樣品采集

2020年6月下旬在各處理小區(qū)按5點(diǎn)法采集土壤樣品，清除表層凋落物后，采集取5～15 cm 土層土樣，帶回實(shí)驗(yàn)室，將每個(gè)處理的土樣充分混勻、去除根系等雜質(zhì)后分成2份，1份干冰保存用于微生物群落測(cè)定，另一份自然風(fēng)干，過60目篩后用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定。

1.5 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

采用重鉻酸鉀容量法—外加熱法測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量，采用凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮含量，采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測(cè)定有效磷含量，采用醋酸銨浸提—原子吸收分光光度計(jì)(火焰)法測(cè)定速效鉀含量[25]。

1.6 土壤微生物多樣性測(cè)定

1.6.1 測(cè)序處理 此部分試驗(yàn)由北京百邁客生物科技有限公司完成。采用DNA提取試劑盒PowerSoil?DNA Isolation kit提取土壤樣品基因組DNA。以此為模板，根據(jù)16S 全長(zhǎng)引物27F 和1492R，合成帶有Barcode 的特異引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物根據(jù)電泳結(jié)果用ImageJ軟件)定量，經(jīng)過混樣、純化后使用PacBio 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.6.2 信息分析處理 對(duì)原始數(shù)據(jù)中導(dǎo)出 CCS 序列，進(jìn)行 Barcode 識(shí)別，長(zhǎng)度過濾，去除嵌合體，得到 Optimization-CCS；將 Optimization-CCS 序列進(jìn)行聚類，將97%一致的序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類。基于OTU分析結(jié)果，對(duì)樣品在各個(gè)分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析和Alpha多樣性指數(shù)分析；使用QIIME軟件進(jìn)行 Beta 多樣性(Beta diversity)分析，通過NMDS分析、樣品聚類熱圖及樣品PCA、PCoA圖比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。并通過組間差異顯著性分析在不同組間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的 Biomarker。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生草處理對(duì)土壤溫濕度日變化的影響

在春季，與清耕相比，生草及覆蓋地布對(duì)土壤溫度、濕度都有一定的增加作用。生草區(qū)域的土壤溫濕度均高于清耕對(duì)照，土壤最高溫分別增加15.4% 和23.2%，土壤最高濕度分別增加24.1% 和23.9%。鼠茅草和黑麥草對(duì)土壤增溫的效應(yīng)相差不多。種植鼠茅草和黑麥草區(qū)域土層達(dá)到最高溫的時(shí)間滯后于清耕對(duì)照區(qū)2～4 h(圖1)。

圖1 生草對(duì)土壤溫濕度的影響(春季)

在夏季，生草和覆蓋地布處理則都降低了土壤溫度(圖2)，提高了土壤濕度，降溫提濕效果順序?yàn)槭竺┎?黑麥草>地布。種植鼠茅草區(qū)域的土壤最高溫度比對(duì)照降低了5.9%，土壤濕度則比對(duì)照提高了43.7%。究其原因可能是由于生草和覆蓋阻擋了土壤與外界之間的能量交換，阻擋了水分的蒸發(fā)，因而影響了土壤的溫濕度。

圖2 生草對(duì)土壤溫濕度的影響(夏季)

2.2 不同生草處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可以看出，生草和鋪設(shè)園藝地布處理后的pH均有所提高，其中鼠茅草和黑麥草處理的pH顯著高于清耕對(duì)照和地布覆蓋。生草處理的土壤養(yǎng)分含量高于地布覆蓋和清耕處理，土壤的全氮、速效鉀、有效磷以及有機(jī)質(zhì)含量與清耕相比差異顯著，但是鼠茅草、黑麥草處理的土壤養(yǎng)分含量沒有明顯差異。全氮和有效磷含量中，園藝地布處理均低于清耕對(duì)照?？梢姡菰耘嗄茉谝欢ǔ潭壬咸岣邫烟夜麍@土壤的有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀含量。而鋪設(shè)園藝地布提高速效鉀、有機(jī)質(zhì)的含量，降低土壤中全氮、有效磷的含量。

表1 不同處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

2.3 生草對(duì)土壤微生物群落的影響

2.3.1 多樣性指數(shù)和OTU豐度 4組樣品測(cè)序后通過Barcode識(shí)別，共獲得223 507條CCS序列(Circular Consensus Sequencing)，通過長(zhǎng)度過濾、去除嵌合體后獲得219 858條有效序列，鼠茅草、黑麥草、園藝地布及清耕的有效序列分別為12 506、9686、12 213和9565。使用Mothur軟件，對(duì)樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估(表2)。所有序列按97%的相似度進(jìn)行OTU分類，共得到2203個(gè)OTUs，其中鼠茅草OTUs數(shù)目最高，其次是園藝地布，清耕處理的OTUs數(shù)目最低。Shanon、Chao 1及ACE指數(shù)呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，即，鼠茅草>黑麥草>清耕>園藝地布，說明鼠茅草處理的樣品中細(xì)菌的多樣性和豐富度最高，其次是黑麥草，園藝地布處理的最低。

表2 各組樣品OTU數(shù)目及多樣性指數(shù)

由圖3 可看出，各處理的稀釋曲線末端基本趨于平緩，表明測(cè)序基本飽和，說明取樣基本合理，能夠較為真實(shí)地體現(xiàn)樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)組成。盡管會(huì)忽略樣品中某些含量較少的微生物群落，但樣品中主要優(yōu)勢(shì)的微生物均已得到分析。

圖3 土壤樣品的稀釋曲線

2.3.2 不同生草處理土壤細(xì)菌類群組成 本研究獲得的微生物序列可分21個(gè)門，39個(gè)綱，85個(gè)目，119個(gè)科，221個(gè)屬，263個(gè)種?；贠TU分析結(jié)果，對(duì)樣品在各個(gè)分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析，獲得各樣品在門、綱、目、科、屬、種分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)圖。如圖4所示，在已分類的門中，變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetota)、放線菌門(Actinobacteria)的豐度較高。各樣品中細(xì)菌門類組成基本一致，其中變形菌門是各個(gè)處理樣品中最優(yōu)勢(shì)的類群。黑麥草樣地中變形菌門相對(duì)豐度最高，為39.64%，鼠茅草、園藝地布及清耕樣地中分別為29.21%、32.78%及34.08%。酸桿菌門在鼠茅草樣地中相對(duì)豐度最高，為19.64%，其他3個(gè)樣地中豐度差異不明顯。

圖4 4個(gè)處理土壤細(xì)菌在門、屬水平的分布

對(duì)屬水平豐度分析發(fā)現(xiàn)，鼠茅草樣地中Vicinamibacter屬和Brevitalea屬相對(duì)豐度最高，分別為8.89%、5.46%；這2個(gè)屬在黑麥草樣地中豐度分別為6.49%、3.27%，在園藝地布樣地中豐度為5.56%、2.92%；在清耕樣地中豐度為6.33%、4.18%。在清耕樣地中Sphingomonas屬的豐度為4.83%，是4組樣品中最高的，而鼠茅草樣地中Sphingomonas屬豐度僅為1.83%。以上結(jié)果顯示，在細(xì)菌不同分類等級(jí)水平上，鼠茅草處理與其他3個(gè)處理樣地均呈現(xiàn)出了較大的差異。

2.3.3 不同生草處理間細(xì)菌群落關(guān)系 用非度量多維標(biāo)定法(Non-Metric Multi-Dimensional Scaling，NMDS)對(duì)各處理所包含的物種信息進(jìn)行分析，基于OTU水平的NMDS分析結(jié)果(圖5)顯示，Q和 D組中的點(diǎn)較分散，說明取樣時(shí)造成了重復(fù)之間的誤差，但是脅強(qiáng)系數(shù)為0.1262，說明該NMDS分析具有一定的可靠性，可以解釋各樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。代表鼠茅草和黑麥草樣品的點(diǎn)距離較近，說明這兩組樣品中所含的細(xì)菌群落較相似，與園藝地布覆蓋和清耕樣地里的所含的細(xì)菌群落差異較大。

圖5 各樣品的NMDS分析圖

為了進(jìn)一步分析尋找各組樣品之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種，對(duì)供試樣品進(jìn)行了Line Discriminant Analysis Effect Size(LEfSe)分析(圖6)。在鼠茅草樣品中豐度顯著高于清耕樣品的細(xì)菌主要是Acidobacteria門細(xì)菌，主要是Vicinamibacteraceae、Vicinamibacter、Silvestris。而清耕樣品中Sphingomonas、Sphingomonadaceae、Sphingomonadales、Alphaproteobacteria 細(xì)菌則顯著高于鼠茅草樣品。

圖6 各樣品細(xì)菌差異LEfSe分析

另外，對(duì)黑麥草和清耕樣品進(jìn)行LEfSe比較分析發(fā)現(xiàn)，Gammaproteobacteria綱中Burkholderiales 目細(xì)菌豐度明顯高于清耕樣品。鼠茅草和黑麥草樣品對(duì)比，鼠茅草樣品中Actinobacteria的細(xì)菌豐度具有顯著優(yōu)勢(shì)，而黑麥草樣品中Gammaproteobacteria綱樣品則豐度較高。

由此可見，櫻桃果園內(nèi)生草能明顯改變土壤中細(xì)菌群落和優(yōu)勢(shì)種群。而這些細(xì)菌種群的變化，則會(huì)在一定程度上影響果園土壤的理化性質(zhì)。

3 討 論

果園生草后可以調(diào)節(jié)果園溫濕度、改善土壤理化性質(zhì)，在行間生草后，改變了果園小氣候環(huán)境，土壤和近地層的光、熱、水、氣等生態(tài)因子都發(fā)生了一定的變化，形成了有利于果樹生長(zhǎng)發(fā)育的微域下氣候環(huán)境，為果樹生長(zhǎng)發(fā)育創(chuàng)造良好的環(huán)境條件。而對(duì)于果園微環(huán)境具體的影響程度則取決于生草的種類。本研究以種植鼠茅草、黑麥草、鋪設(shè)園藝地布以及清耕的櫻桃果園土壤為研究對(duì)象，研究了不同處理情況下土壤溫濕度、理化性質(zhì)變化情況。結(jié)果表明，櫻桃果園生草區(qū)域在春季提高了土壤溫濕度，而在夏季，生草處理則降低了土壤溫度，提高了土壤濕度。這一結(jié)果與相關(guān)學(xué)者的報(bào)道相一致，李國(guó)懷等[26]和梅立新等[27]研究發(fā)現(xiàn)生草具有提高土壤含水量、調(diào)節(jié)地溫的作用。李祥彬[28]研究發(fā)現(xiàn)蜜柚果園人工種草后，改善了土壤的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，增加了土壤的滲水性和持水能力，進(jìn)而增加了土壤含水量。通過果園生草可以避免因溫度過高影響果實(shí)生長(zhǎng)和日灼，還可以避免因?yàn)闇囟冗^低造成果樹凍害、抽條、霜凍等。

土壤pH是土壤的酸堿度，可以影響土壤性質(zhì)和肥力，進(jìn)而直接或間接影響植物的生長(zhǎng)。在本試驗(yàn)中，土壤pH為弱酸性，生草可以提高土壤的pH，蔣小軍[29]、黃毅斌[30]、段舜山[31]等的研究結(jié)果為生草能夠提高南方酸性土壤的pH，這個(gè)結(jié)果與本文的試驗(yàn)結(jié)果相一致，都是提高了酸性土壤的pH。而朱先波等[32]研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草可以降低獼猴桃果園堿性土壤的pH，安建軍[33]研究報(bào)道，在大櫻桃果園種植10種草種，均降低了堿性土壤的pH，綜上結(jié)果說明果園生草可以調(diào)節(jié)土壤的酸堿度，使其向pH中性方向發(fā)展。

氮、磷、鉀是果樹生長(zhǎng)發(fā)育必須的營(yíng)養(yǎng)元素，也是土壤肥力的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量及存在狀態(tài)，影響著果樹的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)。在本試驗(yàn)中，各生草處理區(qū)與清耕對(duì)照區(qū)相比，生草栽培能在一定程度上提高櫻桃果園土壤的有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀含量，鼠茅草和黑麥草的效果差異不顯著。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，它在調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分循環(huán)和能量流方面發(fā)揮著重要作用。本文通過高通量測(cè)序技術(shù)分析顯示，櫻桃果園土壤中優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)等。生草后明顯的改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，多樣性指數(shù)分析表明，種植鼠茅草后，土壤中細(xì)菌的豐富度和多樣性顯著提高，OTU數(shù)量明顯增加。這主要是因?yàn)樯莺螅蟠筇岣吡送寥乐械酿B(yǎng)分含量，為微生物提供了豐富的碳源、氮源和其它所需養(yǎng)分，有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖。種植鼠茅草后，降低了土壤中Proteobacteria的豐度，而Acidobacteria細(xì)菌的豐度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在屬水平上，Vicinamibacter和Brevitalea的豐度明顯增加，Sphingomonas的豐度呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。魏倩倩等[34]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果園中種植白三葉后明顯的改善了土壤微生物群落，微生物多樣性顯著增加。姜莉莉等[35]研究報(bào)道，在蘋果園行間種植鼠茅草處理的土壤細(xì)菌OTU、Chao1、ACE 和Shannon 指數(shù)均低于其他處理，表明其細(xì)菌群落豐度和多樣性較低，種植黑麥草處理后，土壤中的土壤鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)含量較高，本試驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)櫻桃果園行間種植鼠茅草后土壤細(xì)菌多樣性升高，而種植黑麥草后，土壤中Terrimonas屬的細(xì)菌豐度升高，這個(gè)結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果不同，其具體原因有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究測(cè)定了大連地區(qū)櫻桃果園行間生草后土壤溫濕度、理化性質(zhì)變化，并采用高通量測(cè)序技術(shù)研究了細(xì)菌群落組成及變化。結(jié)果顯示，行間生草后，春季可以提高土壤溫濕度，夏季則降低了土壤溫度，提高了土壤濕度；土壤的有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀含量均顯著高于對(duì)照；土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、放線菌門，生草后土壤中細(xì)菌多樣性和豐富度提高，種植鼠茅草后使酸桿菌門細(xì)菌豐度增加，種植黑麥草則富集了γ-proteobacteria綱細(xì)菌。