周銀麗，韋福翠，張德剛，楊 偉，胡先奇

(1.紅河學(xué)院云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 蒙自 661100; 2.紅河學(xué)院商學(xué)院，云南 蒙自 661100; 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

【研究意義】蒙自享有石榴之鄉(xiāng)的美名[1]，但是隨著果樹年齡的增長(zhǎng)，病害危害的程度也大幅度增加，傳統(tǒng)耕作輪換制度對(duì)于多年生的果樹不切實(shí)際，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用與產(chǎn)品的品質(zhì)和土壤微生態(tài)平衡又相矛盾[2]，嚴(yán)重限制了石榴產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】傳統(tǒng)的間作、套作方式在調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，提高經(jīng)濟(jì)效益等方面的作用得到廣泛認(rèn)可[3]，可以起到增產(chǎn)、提高養(yǎng)分資源利用率、增加農(nóng)田生物多樣性的作用[4]，間作可提高石榴枯萎病土壤的微生物群落碳代謝的能力，對(duì)石榴枯萎病害土壤有一定的修復(fù)作用[5]，并且向著高肥力的方向發(fā)展[6]，同時(shí)大量的研究表明間作可以改變土壤真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)[7]，促進(jìn)微生物群落向更好的趨勢(shì)發(fā)展[8]。已有研究表明石榴枯萎病病菌主要從傷口侵入石榴根部[9]，進(jìn)而在木質(zhì)部擴(kuò)展危害，所以石榴根際微生物對(duì)枯萎病的傳播蔓延影響尤為重要。石榴枯萎病是一種土傳真菌病害，病原菌甘薯長(zhǎng)喙殼菌(Ceratocystisfimbriata)在土壤中分布廣泛，主要引起甘薯黑斑病、石榴枯萎病[10]。自1999年在中國(guó)云南省蒙自縣爆發(fā)石榴枯萎病以來(lái)[11]，相關(guān)的防治研究就在不斷探索中[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能是影響連作障礙的重要因素，石榴園土壤微生物群落及其功能是解析石榴連作障礙的關(guān)鍵因素。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用高通量測(cè)序的方法研究蒙自石榴枯萎病土壤樣品(MZD)、間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)、蒙自健康石榴土壤樣品(MZ)的真菌多樣性，比較健康石榴根際真菌與石榴枯萎病根際真菌及間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際真菌多樣性的差異，初步探索通過(guò)間作桃樹改變石榴園的真菌生物多樣性控制石榴枯萎病的機(jī)理，為開展微生態(tài)調(diào)控土傳病害的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 石榴根際土樣的采集

石榴根際土樣采集方法同文獻(xiàn)[12]。

1.2 石榴根際土壤基因組DNA的提取及文庫(kù)構(gòu)建

用OMEGA試劑盒提取土壤基因組DNA，PCR擴(kuò)增土壤真菌 ITS1區(qū)，引物ITS5-1737F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；ITS2-2043R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR產(chǎn)物用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)并回收。構(gòu)建好的文庫(kù)檢測(cè)合格后使用MiSeq進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

對(duì)Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，除去干擾分析的低質(zhì)量數(shù)據(jù)，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)[14-16]?；谟行?shù)據(jù)(Clean Data)進(jìn)行系列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種類型根際土壤真菌的OTU分析及物種注釋

基于OTUs中的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋分析[17]，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品在各分類水平上的序列數(shù)目，3種土壤MZD、MZ、MZP在界水平上的平均序列數(shù)目分別為35 697、37 048、34 888；MZD、MZ、MZP在門水平上的平均序列數(shù)目分別為32 865、34 698、28 714；MZD、MZ、MZP在綱水平上的平均序列數(shù)目分別為31 119、30 723、27 622；MZD、MZ、MZP在目水平上的平均序列數(shù)目分別為31 117、30 722、27 622；MZD、MZ、MZP在科水平上的平均序列數(shù)目分別為30 996、30 617、27 051；MZD、MZ、MZP在屬水平上的平均序列數(shù)目分別為30 901、30 514、27002。

基于物種注釋結(jié)果，最大相對(duì)豐度排名前十的科(Family)分別是：叢赤殼科(Nectriaceae)，Un--s-Fungi sp，Un--s-Ascomycota sp MA5351，毛殼菌科(Chaetomiaceae)，肉座菌科(Hypocreaceae)，發(fā)菌科(Trichocomaceae)，被孢霉科(Mortierellaceae)，Un--s-Trechisporales sp，Un--s-Ascomycota sp，Un--s-Xylariales sp。生成的物種相對(duì)豐度分布柱形圖見(jiàn)圖1，其中豐度較高的是叢赤殼科，約占25%。

圖1 科水平上豐度前10的物種相對(duì)豐度

根據(jù)OTUs聚類分析結(jié)果，3種不同土壤樣品之間OTUs的特有、共有信息用韋恩圖展示(圖2)。枯萎病石榴土壤(MZD)、健康石榴土壤(MZ)、間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)的OTUs數(shù)分別為1174、1076、1007個(gè)，健康石榴土壤(MZ)特有OTUs數(shù)為47個(gè)，間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)特有OTUs數(shù)為94個(gè)，枯萎病石榴土壤(MZD)特有OTUs數(shù)為152個(gè)，枯萎病石榴土壤(MZD)、健康石榴土壤(MZ)、間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)共有的OTUs數(shù)為635個(gè)。

圖2 不同類型土壤真菌的韋恩圖

2.2 3種類型根際土壤真菌微生物多樣性及物種豐度聚類

2.2.1 門水平上3種類型根際土壤真菌多樣性 MZP、MZD、MZ 3種根際土壤真菌多樣性在門水平上的豐度比較見(jiàn)圖3，MZP3中Un--s-fungal_endophyte sp AP853、Un--s-Fungi_sp、球囊菌門(Glomeromycota)相對(duì)豐度較高，Un--s-fungal_endophyte、子囊菌門(Ascomycota)、Un--s-fungal_sp 7 RU025相對(duì)豐度較低；MZP1中擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、Un--s-fungal_endophyte sp AP853、Un--s-fungal_sp WEF9相對(duì)豐度較高，子囊菌門(Ascomycota)、Un--s-fungal_sp 7 RU025、Un--s-fungal_sp F490a相對(duì)豐度較低；MZP2中Un--s-fungal_endophyte sp ECD_2008、Un--s-fungal_endophyte、Un--s-fungal_endophyte sp AP053相對(duì)豐度較高，Un--s-fungal_sp 7 RU025、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)相對(duì)豐度較低；MZ3中Un--s-fungal_sp ARIZ AZ0515、Un--s-fungal_sp F174、Un--s-fungal_sp TRN436相對(duì)豐度較高，Un--s-fungal_sp F308、Un--s-fungal_endophyte、Un--s-fungal_sp KRP24相對(duì)豐度較低；MZD3中Un--s-fungal_sp NLR_2013、Un--s-fungal_sp FF_2011、Un--s-fungal_endophyte相對(duì)豐度較高，Un--s-fungal_sp F490a、Un--s-fungal_sp F174、Un--s-fungal_sp TRN436相對(duì)豐度較低；MZD2中Un--s-fungal_sp KRP24、Un--s-root_associated_fungal sp EP1_6、Un--s-fungal_endophyte sp SS_1519相對(duì)豐度較高，Un--s-fungal_sp F490a、Un--s-fungal_sp WEF9、Un--s-fungal_sp TRN436相對(duì)豐度較低；MZD1中Un--s-fungal_sp F308、Un--s-fungal_sp ASR_213、Un--s-fungal_sp F490a相對(duì)豐度較高，Un--s-fungal_sp F174、Un--s-fungal_endophyte sp AP853、Un--s-Fungi_sp相對(duì)豐度較低；MZ2中Un--s-Rickiella_edulis、Un--s-fungal_sp ARIZ L453、Un--s-fungal_sp ASR_213相對(duì)豐度較高，Un--s-fungal_sp FF_2011、Un--s-fungal_sp F308、Un--s-fungal_sp F174相對(duì)豐度較低；MZ1中子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、Un--s-fungal_sp 7 RU025相對(duì)豐度較高，Un--s-fungal_sp KRP24、Un--s-fungal_endophyte sp AP053、Un--s-fungal_sp WEF9相對(duì)豐度較低。

圖3 門水平上3種類型根際土壤真菌的物種豐度聚類圖

2.2.2 屬水平上3種類型根際土壤真菌多樣性 在屬的分類水平，共鑒定到481屬真菌，對(duì)3種類型土壤鑒定到的真菌屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，3種類型土壤的真菌在屬的分類水平上存在顯著差異性：石榴枯萎病根際土壤(MZD)與間作桃樹修復(fù)枯萎病石榴土壤(MZP)差異顯著的真菌屬有47個(gè):包括Un--s-Fungisp.，Un--s-Chaetomiaceaesp.，F(xiàn)usicolla，Un--s-Mortierellalessp.，Un--s-Hypocrealessp.，Un--s-Lasiosphaeriaceaesp.，Remersonia，Un--s-Herpotrichiellaceaesp.，Un--s-Microascalessp.，翅孢殼屬(Emericellopsis)，殼針孢屬(Septoria)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，葡萄穗霉屬(Stachybotrys)，Wardomycopsis，透孢黑團(tuán)殼屬(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉屬(Mortierella)等;間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病土壤(MZP)與蒙自健康石榴土壤樣品(MZ)真菌差異顯著的屬有21個(gè)：Fusicolla，Un--s-Hypocrealessp.，Un--s-Cordycipitaceaesp.，Un--s-Microascalessp.，殼針孢屬(Septoria)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，葡萄穗霉屬(Stachybotrys)，透孢黑團(tuán)殼屬(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉屬(Mortierella)等(表1)。

表1 屬水平上3種類型根際土壤真菌多樣性部分統(tǒng)計(jì)

2.3 3種類型土壤根際真菌群落組成的主成分分析

為了能夠更加直觀地揭示在石榴園枯萎病發(fā)生區(qū)間作桃樹對(duì)土壤真菌群落組成結(jié)構(gòu)的影響，用PCA(Principal Component Analysis，PCA)分析了3種類型土壤根際真菌群落組成[18]，結(jié)果見(jiàn)圖4，對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值第一主成分為24.54%，第二主成分為15.71%，栽種桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP1、MZP2、MZP3)的真菌微生物群落組成基本聚在了一起，群落組成較相似；健康石榴根際土壤樣品(MZ1、MZ2、MZ3)的真菌微生物群落組成距離較近，也基本聚在了一起；3個(gè)石榴枯萎病根際土壤樣品(MZD1、MZD2、MZD3)的真菌微生物群落組成差異相對(duì)較大，在PC2軸上的距離相對(duì)較遠(yuǎn)，分析原因可能與3個(gè)土壤樣品采樣地域跨度較大有關(guān)。土壤真菌群落組成在石榴枯萎病根際與栽種桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際組成差異較大，在PC1軸上距離相對(duì)較遠(yuǎn)。PCA的分析結(jié)果說(shuō)明，間作桃樹能較大程度改變石榴枯萎病根際土壤真菌的群落組成。

圖4 3種土壤真菌的 PCA 分析

3 討 論

已有的研究表明，病害發(fā)生在一定程度上受土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響[19]，病菌侵染甚至可通過(guò)改變相對(duì)豐度和菌種組成影響根系內(nèi)生菌根真菌群落結(jié)構(gòu)[20]。利用高通量測(cè)序方法研究土壤根際真菌多樣性近年來(lái)有較多報(bào)道，楊光柱等[21]分析了蘋果樹土壤根際真菌多樣性，結(jié)果表明患病土樣中部分有益菌低于健康土壤，蘋果根腐病病原菌高于健康土壤，說(shuō)明根際土壤真菌群落的平衡被打破會(huì)影響土壤的健康。王琪等[22]分析了間作蠶豆與單作羌活根際土壤微生物活性，結(jié)果表明蠶豆間作有效改善土壤微環(huán)境，促進(jìn)羌活次生代謝產(chǎn)物的積累，提高羌活藥材產(chǎn)量和質(zhì)量，有研究表明小麥蠶豆間作能不同程度增加小麥、蠶豆生物量和磷素吸收累積[23]，提高土壤微生物代謝活性[24]，甘蔗玉米間作可提高土壤微生物多樣性[25]，西瓜套作大蒜對(duì)西瓜有一定的促生作用，且減少了西瓜枯萎病發(fā)病率[26]，玉米大豆帶狀套作體系中，植株氮、磷、鉀養(yǎng)分吸收總量比相應(yīng)單作提高，帶狀套作提高了玉米大豆對(duì)養(yǎng)分的吸收利用，有套作產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)[27]，間作能改善梔子根際微生物群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)提高土壤綜合肥力[28]。之前的研究表明石榴根際細(xì)菌的多樣性間作桃樹之后也得到了改善[12]，本文的研究表明真菌群落組成在間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)與石榴枯萎病根際土壤樣品(MZD)之間差異較大，在屬的分類水平上，2種類型土壤有47個(gè)屬的真菌存在顯著差異，說(shuō)明石榴枯萎病根際的真菌多樣性及土壤微生態(tài)平衡能通過(guò)間作桃樹得到改善。

4 結(jié) 論

真菌群落組成在間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤(MZP)與石榴枯萎病根際土壤(MZD)之間有差異較大，石榴枯萎病根際土壤真菌的群落組成通過(guò)間作桃樹能較大程度改變。3種類型根際土壤共鑒定到481種真菌屬，間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病土壤(MZP)與蒙自健康石榴土壤樣品(MZ)真菌差異顯著的屬有21個(gè):殼針孢屬(Septoria)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，葡萄穗霉屬(Stachybotrys)，透孢黑團(tuán)殼屬(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉屬(Mortierella)等。石榴石榴枯萎病根際土壤(MZD)與間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病土壤(MZP)差異顯著的真菌屬有47個(gè):翅孢殼屬(Emericellopsis)，殼針孢屬(Septoria)，腐質(zhì)霉屬(Humicola)，葡萄穗霉屬(Stachybotrys)，Wardomycopsis，透孢黑團(tuán)殼屬(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉屬(Mortierella)等。2種根際土壤中的真菌差異顯著，說(shuō)明在石榴枯萎病發(fā)生園區(qū)土壤真菌的群落組成及多樣性能通過(guò)間作桃樹得到改善，為應(yīng)用間作桃樹改善石榴枯萎病土壤的真菌多樣性控制石榴枯萎病的發(fā)生及擴(kuò)散提供的參考。