楊明潔，張曉曼，趙 蔓

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071000)

【研究意義】土壤生態(tài)系統(tǒng)中重金屬水平的持續(xù)上升是全世界關(guān)注的主要問題。技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致在環(huán)境中引入重金屬污染物[1-2]，重金屬污染具有隱蔽性或潛伏性[3]，是一個相當(dāng)長的逐步積累的過程，且不易被發(fā)現(xiàn)，土壤一旦遭到污染后極難恢復(fù)[4]。重金屬污染是一個不可逆過程且具有長期性。為了解決有毒重金屬的毒性威脅，清除土壤中有毒重金屬，利用植物—微生物聯(lián)合去除、破壞或隔離污染環(huán)境中的重金屬是一種高效、安全、廉價和環(huán)境友好的方式[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根際促生菌(PGPR)促進(jìn)重金屬土壤中植物的生長，因為根際土壤中存在有效的微生物活性，接種PGPR可以活化重金屬，提高金屬提取效率[6]。耐鎘菌株通過細(xì)胞壁表面的化學(xué)集團(tuán)吸附重金屬離子，形成絡(luò)合物降低重金屬遷移率，進(jìn)行胞外沉淀從而達(dá)到去除土壤中重金屬的目的[7]，研究表明銅綠假單胞菌和芽孢桿菌可以修復(fù)Zn和Cu土壤[8]。芽孢桿菌對重金屬Cd也有較好的吸附效果，在土壤鎘修復(fù)具有較大的研究價值?？莶菅挎邨U菌分泌的碳水化合物、脂質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)可以提高菌體對鎘的耐受性，目前研究人員多關(guān)注不同培養(yǎng)條件下枯草芽孢桿菌的鎘吸附效果[9]。枯草芽孢桿菌澆灌到無菌土中定殖菌體數(shù)逐漸升高并趨于穩(wěn)定[10]，使植物的根長、地上部長度、植株鮮重和干重的增加[11]。銅綠假單胞菌對重金屬去除效果良好[12]，尤其對鎘具有較高的耐性，Lin等[13]分離得到的銅綠假單胞菌對鎘的耐受性濃度高達(dá)2200 mg/L。【本研究切入點】大部分重金屬在土壤中的生物有效性較低，能被植物利用的部分很少[14]，超富集植物能夠強(qiáng)烈活化和溶解根際環(huán)境的難溶態(tài)重金屬，具有超常的吸收轉(zhuǎn)運和富集重金屬的能力[15]，但超富集植物大多觀賞性較差，栽培管理受到一定限制。紫花地丁作為早春開花植物，生長迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，栽培范圍廣，對栽培管理不嚴(yán)格，且具有良好的景觀效果，在Hg汞礦廢棄區(qū)具有一定的耐性[16]，具有一定的修復(fù)重金屬應(yīng)用潛能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過分析不同鎘濃度下，接種不同根際促生菌對紫花地丁的生物量、根系形態(tài)、氮磷鉀含量以及根系重金屬鎘的吸收等，研究重金屬鎘脅迫下促生菌對紫花地丁的交互影響，為重金屬污染下的園林綠地種植應(yīng)用草本花卉提供基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以堇菜科多年生草本植物紫花地丁(Violaphilippica)為供試材料，盆栽試驗中，以m(園土)∶m(沙)∶m(草炭土)=2∶2∶1混合，121 ℃高壓滅菌1 h，將滅菌土壤與CdCl2溶液混合，直至與土壤均勻混合達(dá)到1、10、100 mg/kg，放置7 d進(jìn)行重金屬穩(wěn)定。供試菌株P(guān)ACC6633枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、PACC9027銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由北京生物保藏中心提供，采用Nutrient Broth(NB)培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h后于4 ℃保藏備用。

1.2 菌種菌懸液的制備

取1 mL枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌菌液接種于經(jīng)過高溫高壓滅菌的100 mL NB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中37 ℃，200 r/min下擴(kuò)大培養(yǎng)24 h。取10 mL菌懸液在5000 r/min 下離心10 min，棄上清液，用10 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液洗滌、沉淀多次以除去殘余的培養(yǎng)基[17]。用10 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋為波長 600 nm、吸光度0.8的菌懸液(菌液濃度約為108CFU/mL)備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設(shè)計 試驗于2020年10—12月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與旅游學(xué)院智能溫室進(jìn)行。試驗為雙因素處理，因素一為Cd濃度，包括0(CK)、1(L)、10(M)、100 mg/kg(H)4個水平；因素二是促生菌的不同接種種類，設(shè)置接種枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌混合菌以及不接菌4個水平，播種在含有1.5 kg滅菌基質(zhì)的花盆(直徑21 cm，高16 cm)中, 間苗至3 株每盆，每個處理重復(fù)5次，共80 盆?；ㄅ璧紫聣|上細(xì)砂網(wǎng)防止土壤以及重金屬的淋失，托盤下面再放一層塑料薄膜。接菌形式采用灌根法，在植物根際接入20 mL菌懸液(108CFU/mL)，不接菌的施入20 mL經(jīng)高溫滅菌處理的菌液，在自然光照溫度25 ℃下進(jìn)行，生長過程用去離子水每天澆灌(水中未檢測出其它重金屬)。

1.3.2 株高、生物量的測量 鎘脅迫處理60 d試驗結(jié)束，在收獲前測量紫花地丁的株高，在收獲時，用自來水徹底沖洗植物體，去離子水漂洗吸干水分后，將地上和地下部分開，用于生物量的測定。

1.3.3 根系形態(tài)的觀察和測定 采用LA-S植物根系分析儀對紫花地丁的根系圖像掃描，使用LA-S根系生長監(jiān)測系統(tǒng)圖像分析系統(tǒng)測定根長、根系表面積、根尖數(shù)、根系分叉數(shù)和根直徑。

1.3.4 植物N、P、K含量的測定 將分開的地上和地下部分自然晾干后放入恒溫干燥箱于105 ℃下殺青20～40 min，然后在80 ℃下烘至恒重。取烘干后的植物樣品放入研缽中進(jìn)行研磨處理得到植物樣粉末，過100目篩，采用濃H2SO4消解。全氮用全自動凱氏定氮儀測定；全磷含量用鉬銻鈧比色法測定，全鉀采用原子吸收分光光度計測定(津島AA-6800)。

1.3.5 植物地上和根系鎘吸收量的測定 烘干并過篩的植物粉末，采用濃HNO3-HClO4法(HNO3、HClO4均為優(yōu)級純，二者體積比(4∶1)消解，并用原子吸收分光光度計(津島AA-6800)測定鎘含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所測數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用 SPSS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)、雙因素方差分析(ANOVA)、鄧肯多重極差檢驗比較處理間的差異，P<0.05 差異顯著，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Canoco 5 進(jìn)行PCA主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Cd對紫花地丁株高和生物量的影響

由圖1可看出，Cd脅迫顯著抑制了紫花地丁株高的增加、地上生物量和地下生物量的積累，接種菌促進(jìn)了紫花地丁的生長。隨著Cd濃度升高，對紫花地丁株高增幅的抑制也隨之增加；不接菌的處理下，Cd濃度為100 mg/L時株高增加量最低，比CK降低了17.6%。接菌后，當(dāng)Cd濃度為0、1、10 mg/L時比CK高1.3%、5.1%、6.4%，Cd濃度為10 mg/L時對株高增加量影響最顯著。原因可能是接種后的菌株對Cd有一定的耐性，根際土壤微生物存在有效的微生物活性，激發(fā)ACC脫氨酶活性，水解合成乙烯前體ACC，降低乙烯水平，減輕了重金屬對植物的毒性[18]。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=5；CK，對照；不同小寫字母分別表示不同鎘濃度處理間在0.05水平存在顯著性差異(P<0.05)

不同濃度的Cd處理下，地上生物量比CK的降幅依次為31.1%、32.5%、69.2%，各處理均顯著低于CK，當(dāng)Cd濃度為100 mg/L時，地上生物量降幅最大，生長受到明顯的抑制，接種處理后地上生物量在0、1、10 mg/L分別增加3.4%、12.5%、20.2%，Cd濃度為100 mg/L時增加量最低，且與其他處理存在顯著差異。這與Zhang等[19]研究結(jié)果一致，原因是重金屬的存在對促生菌生長存在一定的毒性，重金屬濃度越高抑制越強(qiáng)烈。研究表明，當(dāng)Cd脅迫達(dá)到200 mg/L時，幾乎沒有微生物，接菌后重金屬毒性強(qiáng)，促生菌活性降低，緩解重金屬對植物的危害效果不明顯。

不同濃度的Cd對紫花地丁地下生物量的影響表現(xiàn)出雙重性，1 mg/L Cd脅迫降低了紫花地丁的株高和地上生物量增幅，但提高了地下生物量增幅，說明在低濃度的Cd脅迫下紫花地丁在生長過程中表現(xiàn)出一定的耐受性，能夠促進(jìn)紫花地丁地下部分生長，但隨著Cd濃度升高，地下生物量逐漸受到抑制。不接種的地下生物量降幅均存在顯著差異。接種處理后地下生物量增幅依次為10.2%、33.5%、66.6%、31.1%，Cd濃度為10 mg/L時增幅最高。

表1 鎘脅迫下促生根際菌對根長、根表面積和根直徑的交互作用

表2 交互作用對紫花地丁根系形態(tài)的影響

2.2 交互作用對紫花地丁根系形態(tài)的影響

Cd脅迫和接種促生菌對根系長度、根系表面積和根直徑存在交互影響(表1～2)。與對照相比，總體上Cd處理對PA接菌中根系表面積和根長有顯著的促進(jìn)作用，混合接菌對根直徑?jīng)]有顯著影響。隨著Cd濃度的增大，根系表面積呈現(xiàn)下降趨勢。在不受Cd脅迫條件下，根長由大到小排序為PA接菌、BS接菌、不接菌、混合接菌(P<0.05)，根系表面積和根直徑由大到小排序為PA接菌、混合接菌、BS接菌、不接菌(P<0.05)，根系表面積的接菌處理顯著高于未接菌且PA接菌顯著高于BS接菌(P<0.05)。在不同濃度Cd處理組中，根長由大到小排序為混合接菌、PA接菌、不接菌、BS接菌，根系表面積和根長在H組由大到小排序為PA接菌、混合接菌、不接菌、BS接菌(P<0.05)，根系表面積在處理組下也呈現(xiàn)接菌處理顯著高于未接菌處理。

Cd處理對PA接菌中根系表面積和根長有顯著的促進(jìn)作用，說明接種銅綠假單胞菌可促進(jìn)植物在重金屬脅迫環(huán)境下增加紫花地丁根系生長和表面積，從而增加吸收水分與營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而增強(qiáng)植物抗性[20]，且在高濃度鎘脅迫下也有同樣作用。隨著Cd濃度的增加，混合接菌對根系長度的促進(jìn)效果最好，也能增加重金屬的有效根表面積，促進(jìn)重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運和積累。

Cd脅迫和接種促生菌對根尖數(shù)和根分叉數(shù)交互作用不顯著，因此對差異顯著的主效應(yīng)進(jìn)行分析，接種促生菌對根尖影響顯著。如圖2所示，不接菌處理的根尖數(shù)為530，BS接菌的根尖數(shù)為498，PA接菌的根尖數(shù)為822，混合接菌處理的根尖數(shù)為632。PA菌接菌顯著高于BS菌接菌。不同濃度的Cd處理對根分叉數(shù)影響顯著。不受鎘脅迫的條件下根分叉數(shù)為717，L處理下根分叉數(shù)為898，M處理下根分叉數(shù)為680，H處理下根分叉數(shù)為669。促生菌接種對根尖影響顯著，接種后的促生菌存在于植物根系周圍，并與植物結(jié)合，改善了根系在土壤中的分布從而有更多的根系定殖點[21]。100 mg/L的Cd處理時根分叉數(shù)顯著降低，說明高濃度的鎘易被植物吸收并積累，超過一定程度時會對植物產(chǎn)生毒害作用[22]。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=5；不同小寫字母分別表示不同接菌處理間在0.05水平存在顯著性差異(P<0.05)，不同大寫字母分別表示不同鎘濃度處理間在0.05水平存在顯著性差異(P<0.05)

2.3 交互作用對紫花地丁全氮、全磷、全鉀的影響

如表3所示，不同接菌處理對紫花地丁地上部分的全氮、全磷、全鉀影響不同。全氮由大到小排序為混合接菌、PA接菌、BS接菌，全磷和全鉀由大到小排序為PA接菌、BS接菌、混合接菌，隨著Cd處理濃度的增加，與不受鎘脅迫處理相比，接菌處理后紫花地丁地上部分全氮先增后降，平均增幅L處理為8.60%，M處理為12.58%，H處理為10.39%。地上部分的全磷下降，平均降幅L處理為11.15%，M處理為12.85%，H處理為9.63%。地上部分的全鉀先增后降，平均增幅L處理為2.57%，M處理為0.28%，H處理為9.63%。

表3 交互作用對紫花地丁全氮、全磷、全鉀的影響

接菌處理后紫花地丁地下部分全氮大致增加，平均增幅L處理為3.81%，M處理為17.60%，H處理為16.58%。地下部分的全磷先增后降，平均增幅L處理為1.21%，M處理為8.18%，H處理為7.60%。地下部分的全鉀先增后降，平均增幅L處理為2.60%，M處理為9.42%，H處理為8.98%。

總的來說，L和M處理中混合接菌地上部分全氮最高，而H處理的PA接菌地上部分全氮最高。在L、M、H處理下PA接菌的地下部分全磷最高。表明銅綠假單胞菌可以通過將土壤中難以利用的物質(zhì)轉(zhuǎn)換為植物可利用的形態(tài)，提高植物可利用的磷元素水平[23]，且在土壤高濃度Cd脅迫下依舊產(chǎn)生作用。

根際促生菌提高植物對重金屬的抗性，促進(jìn)植物對氮等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高植物的生物量，增加植物從土壤中吸收重金屬的總量。本試驗中，接種枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌混合菌對植物地上和地下部分全氮影響最大，提高了紫花地丁的營養(yǎng)元素的含量，特別是顯著地提高紫花地丁植株的固氮能力[24]。由此可以得出，接種促生菌之后在植物對抗鎘脅迫的過程中，混合菌起到至關(guān)重要的作用。

2.4 紫花地丁重金屬鎘含量

如圖3所示，不同接菌種類對Cd脅迫下對紫花地丁鎘含量的影響。當(dāng)Cd濃度為1 mg/L時，接菌處理對紫花地丁地上部分的鎘含量無顯著差異，說明低濃度鎘脅迫下的3種接菌處理對紫花地丁地上部分鎘含量有相似的作用。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=5；不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

隨著Cd處理濃度的增加，BS接菌、PA接菌以及混合接菌的根系鎘含量均高于地上部分鎘含量，且在10 和100 mg/L Cd濃度處理下，BS接菌和PA接菌根系鎘含量增幅最大分別為16.10%、23.09%，2種Cd濃度處理下根系鎘含量大小排序為混合接菌>PA接菌>BS接菌。由此得出高濃度Cd處理，混合接菌比單接一種菌更能促進(jìn)紫花地丁根系對鎘的吸收，從而減少土壤中重金屬含量。接種促生菌通過改變重金屬的價態(tài)或形態(tài)增強(qiáng)重金屬的可溶性，促進(jìn)植物對重金屬的吸收和富集[25]。接種不同的菌種，植物對重金屬所產(chǎn)生累積機(jī)制不同，地上和根系的鎘含量隨著Cd處理濃度的增加而增加，可以得出紫花地丁在單接菌及混合接菌后同時增加了植物地下根系對土壤中鎘的吸收和積累。接種混合菌后，2種菌協(xié)同促進(jìn)植物對重金屬吸收積累?？莶菅挎邨U菌和銅綠假單胞菌之間的相互作用機(jī)制仍有待驗證。

2.5 紫花地丁生長生理性狀與鎘含量的相關(guān)性分析

利用Canoco 5 進(jìn)行主成分分析(PCA)，為了探討紫花地丁的生長生理指標(biāo)、根系和地上部分鎘含量13個指標(biāo)之間關(guān)系。如圖4所示，在PCA排序軸中，第一排序軸解釋了86.15%, 主要解釋了紫花地丁的營養(yǎng)元素，第二排序軸解釋了10.21%，主要解釋了地上生物量和地下生物量，前2個排序軸共解釋了96.36%，這兩軸為主成分軸。全氮(r=0.963，P<0.01)、全鉀(r=0.885，P<0.01)和全磷(r=0.786，P<0.01)與第一主成分軸呈極顯著正相關(guān)，地上生物量(r=0.794，P<0.05)和地下生物量(r=0.686，P<0.05)與第二主成分軸呈顯著正相關(guān)。

A1，株高；A2，地上生物量；A3，地下生物量；RL，根系長度；RSA，根系表面積；RB，根分叉數(shù)；RD，根直徑；RT，根尖數(shù)；TN，全氮；TP，全磷；TK，全鉀，SCd，地上鎘含量；RCd，地下鎘含量

3 討 論

鎘脅迫處理顯著抑制了紫花地丁株高的生長、地上生物量和地下生物量的積累。接種菌后促進(jìn)了紫花地丁的生長。鎘濃度達(dá)到100 mg/L表現(xiàn)出敏感性，其生長受到明顯的抑制作用，原因是重金屬鎘易被植物吸收并積累，超過一定程度時會對植物產(chǎn)生毒害作用[26]，加入菌劑后緩解效果不明顯。低濃度鎘脅迫下紫花地丁在生長過程中表現(xiàn)出一定的耐受性，銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌在植物根表自然成膜分泌EPS產(chǎn)物，有毒微量重金屬的存在可以促進(jìn)EPS的產(chǎn)生[27]，進(jìn)而能夠促進(jìn)紫花地丁地下部分生長，但隨著鎘脅迫濃度的升高，重金屬鎘對細(xì)菌生長存在一定的毒性且濃度越高對細(xì)菌抑制越強(qiáng)烈，地下生物量逐漸受到抑制。楊璐等[28]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌菌劑對冬小麥的生長有一定的促進(jìn)作用，鎘脅迫下，添加銅綠假單胞菌菌液及菌劑處理顯著促進(jìn)了水稻的生長與干物質(zhì)積累,降低了水稻各部位的鎘含量與富集量[29]。

鎘脅迫下接種PA菌對根系表面積和根長有顯著的促進(jìn)作用，根系表面積接菌處理顯著高于未接菌。銅綠假單胞菌可促進(jìn)植物在重金屬脅迫環(huán)境下增加根的生長和根系表面積，從而增加吸收水分與營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而增強(qiáng)植物抗性，也能增加重金屬的有效根表面積，促進(jìn)重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運和積累[30]。促生菌接種情況對根尖影響顯著，接種菌與根系周圍存在并與植物結(jié)合，改善了根系在土壤中的分布從而有更多的根系定殖點。100 mg/L的鎘處理對根分叉數(shù)影響顯著，說明高濃度的鎘對紫花地丁根系造成了嚴(yán)重的毒害作用，嚴(yán)重影響了植物對重金屬的吸收[31]。

根際促生菌提高植物對重金屬的抗性，使其生長不受到影響促進(jìn)植物對氮營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高植物的生物量增加植物從土壤中吸收重金屬的總量。本試驗中，接種處理的地上全氮占比均增長，接種不同菌劑中混合接種全氮占比均增長且增幅最大。不同接種PGPR對植物氮磷占比影響結(jié)果有很大差異，接種BS和PA混合菌對植物地上和地下部分全氮占比影響最大，提高了紫花地丁的營養(yǎng)元素的含量[32]。

根際促生菌對不同鎘濃度處理的鎘含量影響不同。低濃度鎘脅迫下，接菌處理對紫花地丁地上部分的鎘含量無顯著差異，說明低濃度鎘脅迫下的3種接菌處理對紫花地丁地上部分鎘含量有相似的作用。高濃度鎘處理，混合接菌比單接一種菌更能促進(jìn)紫花地丁根系對鎘的吸收。不同的細(xì)菌可能會競爭或抑制聯(lián)合植物修復(fù)，枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌之間的相互作用機(jī)制仍有待驗證。

4 結(jié) 論

Cd脅迫抑制了紫花地丁株高的增加、地上生物量和地下生物量的積累，接種菌促進(jìn)了紫花地丁的生長。鎘脅迫下PGPR對紫花地丁交互作用表明，接種銅綠假單胞菌對根系表面積有顯著的促進(jìn)作用，接種混合菌對根長促進(jìn)效果最好?；旌辖泳逆k含量比單一接菌后鎘含量多，紫花地丁在單接菌及混合接菌后增加了植物地下根系對土壤中鎘的吸收和積累。