方 宇，白 濤，劉冬梅，韓小女，劉 舜，王瑞寶，郭永升，陳小龍，王柄權(quán)，程凌寒，黃飛燕，余 磊，蔡永占，劉佳妮

(1.昆明學(xué)院/云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，昆明 650214；2.云南省煙草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655002；3.宣威市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 宣威 655499；4.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司原料采購中心，鄭州 450000)

【研究意義】煙草作為一種重要的經(jīng)濟作物在全國各省份均有所種植。然而，近年來由于土地資源匱乏，土地流轉(zhuǎn)困難等原因?qū)е聼煵葸B作障礙問題突出，病害發(fā)生日趨嚴(yán)重[1]。其中，煙草黑脛病煙草整個生育期均有發(fā)生，近年來呈加重流行趨勢且分布廣泛，目前煙草黑脛病在中國除黑龍江省外其余各省份均有發(fā)生，且在云、貴、川等省份煙區(qū)尤為嚴(yán)重，發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)發(fā)病率可達(dá)到75%以上，已成為制約煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要影響因子[2-3]?！厩叭搜芯窟M展】微生物是土壤的重要組成，其在土壤中的分布特征和功能多樣性在一定程度上反映了土壤質(zhì)量好壞，有研究指出土壤中微生物菌群結(jié)構(gòu)的失衡將會極大地增加作物感病幾率[4]。植物土傳病害的發(fā)生受到土壤理化性質(zhì)、微生態(tài)環(huán)境等諸多因素影響，其中土壤微生物通過產(chǎn)生具有促進作物生長的植物生長激素和產(chǎn)生具有抑制病原菌生長作用的抗病活性物質(zhì)在一定程度上提高植物的抗病性，因此根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)組成、多樣性以及微生物營養(yǎng)獲取方式等是植物土傳病害發(fā)生的重要影響因素。Wang等[5]通過在種植蘋果的土壤中添加生物炭改變了其土壤中的真菌群落結(jié)構(gòu)，增加了真菌的相對豐度，同時降低了病原菌茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)在土壤中的相對豐度。童文杰等[6]發(fā)現(xiàn)深耕、深松措施對提高根際土壤真菌群落多樣性、改善土壤真菌群落結(jié)構(gòu)具有一定的促進作用，并能夠抑制潛在土傳病原真菌的生長，減少相關(guān)病害的發(fā)生。與此同時，根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也會隨著植株的感病而發(fā)生改變，羅路云等[7]研究發(fā)現(xiàn)，南瓜白粉病病菌能夠改變南瓜葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。張仁軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，健康與根結(jié)線蟲病田根際土壤真菌和細(xì)菌微生物群落在門和屬水平上組成相似，但物種豐度存在顯著差異。煙草黑脛病為真菌性土傳病害，土壤是其重要的傳播途徑。該病原菌與眾多微生物共同生存于煙株根際周圍，煙株感病后勢必會引起其根際微生物種群發(fā)生變化。張笑宇等[9]研究發(fā)現(xiàn)，煙草患黑脛病后其根際土壤微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，多樣性明顯降低，且相關(guān)病原菌呈現(xiàn)出積累趨勢。向立剛等[10-11]發(fā)現(xiàn)，健康土壤中細(xì)菌群落的豐富度與多樣性均比感青枯病和黑脛病的土壤要高?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，隨著綠色優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)和綠色防控體系總要求的提出，通過采用不同措施優(yōu)化作物根際土壤微生物的群落分布從而達(dá)到抑制病原菌的生長已成為防治土傳病害的新視角。本研究以云南煙區(qū)為背景，從煙株根際土壤微生物為出發(fā)點，利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對健康與患黑脛病植株的根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進行檢測，并進一步分析根際土壤真菌與環(huán)境理化因子的相關(guān)性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以期探明煙株感染煙草黑脛病對煙株根際土壤真菌群落的影響，揭示根際土壤真菌在黑脛病發(fā)生過程中的微生態(tài)理論機制，為從生態(tài)角度預(yù)防煙草黑脛病的發(fā)生提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2019年7月在云南省曲靖市宣威市熱水關(guān)營試驗地進行樣品采集，品種為云煙100。在同一地塊隨機選取煙草黑脛病發(fā)病嚴(yán)重的煙株3株及其周邊的健康煙株3株，將植株連根拔起并去除植株根系主土壤，收集根系表面2 mm根際土壤，帶回實驗室分裝于50 mL離心管中，置于-80 ℃中冷凍保存，待用；感染黑脛病煙株根際土樣編號為HJTY(XW-RS-P1、XW-RS-P2、XW-RS-P3)；健康煙株根際土樣編號為ZCTY(XW-RS-H1、XW-RS-H2、XW-RS-H3)。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH采用2.5∶1.0的水土比，用電位計法測定；有機質(zhì)采用重鉻酸鉀—硫酸外加熱法測定；堿解氮采用擴散法進行測定；有效磷采用NaHCO3浸提，鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用醋酸銨浸提，火焰光度計法測定，具體試驗方法依照NY/T 1377—2007、NY/T 1121.6—2006、DB51/T 1975—2014、NY/T 1121.7—2014、NY/T889—2004進行。

1.3 土壤DNA的提取與擴增

參照PowerSoil?DNA土壤基因組DNA提取試劑盒，對健康煙株和感黑脛病煙株根際土壤進行DNA的提取。以1 ng/μL DNA作為模板，選用特異性引物ITS1F和ITS2R進行PCR擴增，擴增程序為預(yù)變性，95 ℃ 3 min；變性，95 ℃ 30 s；退火，55 ℃ 30 s；延伸，72 ℃ 45 s；再延伸，72 ℃，10 min，共36個循環(huán)，擴增體系為20 μL(表1)。

表1 PCR擴增反應(yīng)體系

擴增后產(chǎn)物進行質(zhì)量檢測后，按照AxyPrepDNA試劑盒方法進行純化回收，并委托上海美吉生物進行MiSeq測序。

1.4 下機數(shù)據(jù)的質(zhì)控與分析

剔除下機數(shù)據(jù)中的標(biāo)簽及引物序列，進行序列拼接得到原始數(shù)據(jù)；使用軟件Usearch(version 7.0)進行過濾、去嵌合體序列得到有效序列；利用軟件Mothur繪制稀釋度曲線，判定此次測序量能否較為真實的反映樣品中微生物實際情況；同時計算文庫覆蓋率、Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)，對根際土壤微生物群落中的物種多樣性和豐富度進行評價；在97%相似性水平上用軟件Uparse進行OTUs聚類分析；利用SILVA數(shù)據(jù)庫和軟件RDP classifier對物種進行注釋，并運用Student’s T檢驗對排名前10各菌屬的相對豐度數(shù)據(jù)進行假設(shè)檢驗；使用軟件Qiime進行主成分分析，并利用R語言中的Vegan軟件作圖進行RDA冗余分析，檢測環(huán)境因子、樣本、菌群三者間的關(guān)系；通過Spearman相關(guān)系數(shù)計算不同環(huán)境因子與微生物物種組成的關(guān)系，利用相關(guān)性Heatmap圖評估微生物分類與環(huán)境變量之間的相關(guān)性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Excel 2017進行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 23.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤理化性質(zhì)

患病煙株與健康煙株根際土壤理化性質(zhì)差異性分析如表2所示，pH、有機質(zhì)、堿解氮、有效磷和速效鉀含量在兩根際土壤中存在一定差異。其中pH在兩者間存在顯著差異，患病煙株根際土中pH較低；而有機質(zhì)、堿解氮和有效磷在兩處理中無顯著差異，均表現(xiàn)出HJTY>ZCTY的規(guī)律，且HJTY較ZCTY分別增加了8.29%、18.38%和19.76%，而速效鉀含量則在ZCTY中較高，相對HJTY增加了19.74%。

2.2 土壤樣品測序深度驗證

如圖1所示，通過稀釋曲線可以判斷本次測序是否合理，稀釋曲線雖未最終到達(dá)平臺期，當(dāng)測序深度達(dá)到50 000時，曲線趨于平緩，說明序列數(shù)的進一步增加不會引起較多新OTU的出現(xiàn)。由此可見，本次對煙株根際土壤的測序深度合理，真菌群落置信度較高，能夠較為全面的反映根際土壤樣品真菌群落與結(jié)構(gòu)的真實情況，具有一定的研究意義，為后續(xù)的進一步分析奠定了基礎(chǔ)。

圖1 健康與患病煙株根際土壤樣品真菌物種豐富度稀釋曲線

2.3 真菌的OTU豐度和Alpha多樣性

在97%相似水平上感黑脛病與健康煙株根際土壤真菌OTU豐度和Alpha多樣性如表2所示，感黑脛病和健康根際土壤真菌測序覆蓋度均在99%以上，表明各土壤樣品中的絕大多數(shù)序列均被檢出，測序讀長能夠進行后續(xù)的相關(guān)分析。

表2 健康煙株與患病煙株根際土壤理化性狀

由表3可知，健康根際土(ZCTY)與感黑脛病根際土(HJTY)兩者的真菌OTU豐度存在明顯差異，ZCTY是HJTY的1.22倍；對兩根際土壤的OTU數(shù)進一步分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，ZCTY與HJTY共有的真菌OTU 943個，從各自特有物種OTU進行分析發(fā)現(xiàn)，ZCTY中特有OTU 866個，占物種總量的36.93%；HJTY中特有OTU 536個，占物種總量的22.86%，ZCTY中特有OTU 是患病煙株的1.62倍，兩根際土壤特有物種量存在顯著差異。此外，煙株感染黑脛病后還會對其根際土壤真菌的多樣性和豐富度存在一定的影響，HJTY中ACE、Chao1指數(shù)較ZCTY相比，分別降低了31.87%、30.47%，表明煙株感染黑脛病后能夠降低根際土壤真菌的豐富度；Shannon、Simpson指數(shù)是反映微生物群落多樣性高低的重要指數(shù)，在此次測序中發(fā)現(xiàn)兩指數(shù)之間無顯著差異，表明煙株感染黑脛病后對其根際土壤真菌的多樣性影響較小。

表3 健康與患病煙株根際土壤真菌OTU豐度和Alpha多樣性

圖2 根際土壤真菌OTUs韋恩圖

2.4 真菌群落組成與結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 門水平真菌群落分布 如圖3所示，二者根際土壤微生物區(qū)系在門水平上組成差異明顯，其中ZCTY中優(yōu)勢菌門為子囊菌門(Ascomycota，60.08%)、油壺菌門(Olpidiomycota，16.86%)、被孢霉門(Mortierellomycota，13.03%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota，6.05%)、壺菌門(Chytridiomycota，2.27%)；HJTY中優(yōu)勢菌門為子囊菌門(68.89%)、擔(dān)子菌門(14.37%)、被孢霉門(13.24%)、壺菌門(1.58%)，其中子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉門為煙株土壤的優(yōu)勢菌門，且其在HJTY中的相對豐度較ZCTY分別增加了14.66%、137.52%、1.61%，而壺菌門的則降低了30.39%，另外，油壺菌門為ZCTY中特有的菌門。

圖3 各樣品中真菌的相對豐度(門水平)

2.4.2 屬水平真菌群落分布 進一步分析感黑脛病與健康根際土壤屬水平上的差異(圖4)發(fā)現(xiàn)，二者屬水平的物種相對豐度差異較大。ZCTY中主要真菌有被孢霉屬(Mortierella，12.41%)、油壺菌屬(Olpidium，16.84%)、Soilcoccozyma(4.36%)、鐮刀菌屬(Fusarium，5.56%)、綠僵菌屬(Metarhizium，5.59%)、毛殼菌屬(Chaetomium，5.37%)、赤霉菌屬(Gibberella，4.19%)、青霉屬(Penicillium，1.31%)、新赤殼屬(Neocosmospora，1.68%)、Plectosphaerella(2.48%)、曲霉菌屬(Aspergillus，1.53%)、枝孢屬(Cladosporium，1%)、籃狀菌屬(Talaromyces，0.54%)；HJTY中優(yōu)勢菌屬為被孢霉屬(13.17%)、油壺菌屬(0.07%)、Soilcoccozyma(12.08%)、鐮刀菌屬(8.58%)、綠僵菌屬(6.53%)、毛殼菌屬(5%)、赤霉菌屬(2.71%)、Spiromastix(4.48%)、青霉屬(3.2%)、新赤殼屬(1.95%)、Papulaspora(2.8%)、Plectosphaerella(0.86%)、Aspergillus(1.63%)、外瓶柄霉屬(Exophiala，1.63%)、枝孢屬(1.1%)、籃狀菌屬(1.39%)，其中HJTY中的被孢霉屬、Soilcoccozyma、鐮刀菌屬、綠僵菌屬、青霉屬、新赤殼屬、Aspergillus、枝孢屬、籃狀菌屬較ZCTY均有所增加，分別增加了6.12%、177.06%、54.32%、16.82%、144.27%、16.07%、6.54%、10%、157.41%，其中Soilcoccozyma、鐮刀菌屬、青霉屬、籃狀菌屬增加幅度較大，而油壺菌屬、毛殼菌屬、赤霉菌屬、Plectosphaerella相對豐度在一定程度上有所降低，分別降低了99.58%、6.89%、35.32%、65.32%。另外Spiromastix、Papulaspora、外瓶柄霉屬為HJTY特有菌屬，進一步說明了煙株感染黑脛病后對其根際土壤真菌群落豐度存在一定的影響。

圖4 各樣品中真菌的相對豐度(屬水平)

使用R軟件，選取感黑脛病與健康煙株根際土壤真菌菌群豐度排名前30的菌屬進行聚類分析，并根據(jù)聚類分析結(jié)果對分類單元進行排序繪制真菌群落分布熱圖。如圖5所示，排名前30的菌屬可聚類為兩大類，而后又進一步聚類成4類，從上至下依次為菌群Ⅰ、菌群Ⅱ、菌群Ⅲ、菌群Ⅳ，30個屬中有2個壺菌門、1個油壺菌門、1個被孢霉門、1個擔(dān)子菌門和1個未知真菌，其余皆為子囊菌門。菌群Ⅰ在HJTY中相對豐度較高，主要聚集了Spiromastix、青霉屬和Plectosphaerella；菌群Ⅱ聚類的菌屬較多，其中Plectosphaerella和unclassified_f_Microascaeae在ZCTY相對豐度較高，而新赤殼屬、Aspergillus、籃狀菌屬和外瓶柄霉屬在HJTY中的相對豐度較高；菌群Ⅲ只有油壺菌屬1種，主要集中分布在ZCTY中；菌群Ⅳ中主要聚集了被孢霉屬、Soilcoccozyma、赤霉菌屬、毛殼菌屬、鐮刀菌屬和綠僵菌屬，其中Soilcoccozyma、鐮刀菌屬和綠僵菌屬在HJTY中的豐度較高，而赤霉菌屬、毛殼菌屬則在ZCTY中豐度較高。

圖5 屬水平上根際土壤真菌群落分布熱圖

2.4.3 真菌物種差異分析 為找出感黑脛病與健康煙株根際土壤之間的差異真菌物種，以兩根際土壤屬水平上的物種注釋結(jié)果及相對豐度數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，選取相對豐度前10的菌屬，運用Student’s T檢驗對其相對豐度數(shù)據(jù)進行假設(shè)檢驗，以此評估排名前10各菌屬的相對豐度差異顯著性水平。如圖6所示，在排名前10的菌屬中除油壺菌屬、毛殼菌屬和赤霉菌屬外，其余菌屬在感黑脛病根際土中的相對豐度均高于健康煙株根際土，且Soilcoccozyma、鐮刀菌屬、Spiromastix、青霉屬在二者間差異顯著，其中Soilcoccozyma在感黑脛病與健康煙株根際土壤之間差異最為明顯，該菌在感黑脛根際土中的相對豐度是健康根際土的2.77倍，可能是影響煙草黑脛病發(fā)病的重要屬；此外，鐮刀菌屬是植物相關(guān)病害的主要菌屬，在感黑脛病根際土中的豐度顯著高于健康根際土。

圖6 屬水平上真菌群落差異

2.5 真菌群落組成的層級聚類及PCoA分析

在OTU水平上對感黑脛病土壤和正常健康根際土壤真菌群落進行樣本層級聚類。如圖7所示，ZCTY的所有樣品均能聚成1支，說明ZCTY中3個土壤樣品中微生物結(jié)構(gòu)相似，而HJTY中XW-RS-P2與XW-RS-P3能聚成1支，但XW-RS-P1獨自聚成1支，說明其與XW-RS-P2、XW-RS-P3的微生物結(jié)構(gòu)存在一定差異。

圖7 OTU水平上樣本層級聚類分析

另外，在OTU水平上對ZCTY和HJTY進行PCoA分析，如圖8所示，PC1和PC2對樣品解釋度依次為49.15%和21.97%，二者合計解釋度為71.12%，圖中可以看出第二、三象限主要聚集了ZCTY中的真菌群落，而HJTY中的真菌群落除XW-RS-P1外均聚集在第一象限，且ZCTY中的3個樣品間的距離較小，表明組間真菌群落組成差異較??；并在PC1的作用下，將ZCTY分在PC1的負(fù)值區(qū)域而將HJTY分在正值區(qū)域，進一步闡明了健康土樣與患黑脛病根際土壤中真菌群落組成及分布差異顯著。

圖8 OTU水平樣品PCoA分析

2.6 真菌群落組成與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

將感黑脛病和健康植株根際土壤的pH、有機質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀作為土壤理化因子與土壤屬水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)進行冗余分析，如圖9所示，RDA1和RDA2對各樣品的解釋度分別為76.55%和12.45%，兩軸共計對樣品的解釋度達(dá)到89%。有機質(zhì)(OC)、堿解氮(N)、有效磷(EP)、pH對煙株根際土壤真菌的影響程度大于速效鉀(AP)，且ZCTY與有機質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀間的夾角均為鈍角呈負(fù)相關(guān)，與pH間的夾角為銳角呈正相關(guān)，而HJTY反之。

圖9 不同處理根際土壤細(xì)菌組成與環(huán)境因子間的RDA冗余分析

與此同時，利用Spearman相關(guān)性系數(shù)進一步對Top 20真菌菌屬進行分析并構(gòu)建Spearman相關(guān)性熱圖，各土壤環(huán)境因子對土壤Top 20真菌菌屬分布存在一定的影響。如圖10 所示，油壺菌屬與有機質(zhì)、堿解氮均呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.886、-0.943，鐮刀菌屬與堿解氮呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.886；Soilcoccozyma與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，而與速效鉀呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.841、0.829；Plectosphaerella與堿解氮、有效磷呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.829、-0.943，而青霉菌屬與堿解氮、有效磷呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.943、0.829；外瓶柄霉屬與有機質(zhì)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)性指數(shù)為0.829。

圖10 屬水平上不同土壤環(huán)境因子與細(xì)菌群落組成相關(guān)性分析

3 討 論

大量研究指出，土壤質(zhì)量的優(yōu)劣與其微生物群落的豐富度、多樣性息息相關(guān)[12]，多樣性、豐富度越高土壤穩(wěn)定性越高，抵御病原菌侵染的能力也就越強，反之則會引起土傳病害的增加[13-14]。本研究結(jié)果顯示，ZCTY中ACE、Chao1和Shannon指數(shù)均比感黑脛病根際土壤要高，而Simpson指數(shù)要低于感黑脛病根際土壤，表明煙株感染黑脛病后降低了其根際土壤真菌的多樣性與豐富度；此外，其真菌群落OTU數(shù)降低了18.24%，進一步說明了煙株感染黑脛病后，其根際土壤微生物數(shù)量有所降低，這與向立剛等人研究煙株感染黑脛病后其根際土壤真菌中豐富度與多樣性的變化規(guī)律相一致[15]。土壤微生物的多樣性對維持土壤質(zhì)量和抵御病害的發(fā)生具有重要影響，多樣性的降低可能是病害發(fā)生的重要因子；同時植物病害發(fā)生后隨著病原菌的大量積累，有益菌群的數(shù)量逐漸降低，土壤微生物逐漸單一化，最終導(dǎo)致群落整體水平的降低[9, 16-17]，這與本研究中感染煙草黑脛病后根際土壤真菌的種類與數(shù)量顯著低于ZCTY的結(jié)論一致。

根際土壤微生物分布在植物根系的周圍，其土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)與組成易受到作物種類、根系分泌物質(zhì)、施肥方式、耕作方式等因素的影響[18-19]。植株感染病害后會對其根際土壤微生物及優(yōu)勢菌群產(chǎn)生一定的影響。陳巧環(huán)等[20]研究表明，菊花枯萎病導(dǎo)致根際土壤中大量富集了鐮刀菌屬致病菌和積累菊迪基氏菌屬(Dickeya)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)致病細(xì)菌。伍文憲等[21]研究發(fā)現(xiàn)，根腫病能夠引起十字花科作物根際土壤微生物中擬桿菌門的豐度顯著升高，放線菌門的顯著降低。本研究分析發(fā)現(xiàn)兩根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，也進一步證實了煙株感染煙草黑脛病后會引起土壤微生物群落組成發(fā)生改變。在門分類水平上，子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉門、壺菌門為兩根際土壤中的優(yōu)勢菌門，前人研究表明，上述菌門是根際土壤中主要的優(yōu)勢菌門，廣泛分布于各根際土壤中[22-24]，這與本研究的結(jié)論一致。進一步分析發(fā)現(xiàn)，煙草黑脛侵染的煙株根際土壤中子囊菌門、被孢霉門、擔(dān)子菌門的相對豐度較ZCTY分別增加了14.66%、1.61%、137.52%。子囊菌門和擔(dān)子菌門分布著眾多的腐生菌群，其中大部分腐生菌能夠分解有機質(zhì)，對土壤肥力的提高具有一定的促進作用，進而對作物的生長產(chǎn)生著重要的影響[25]。而被孢霉菌門中較多的屬為植物病害的主要屬，其豐度的增加打破了土壤微生物的平衡為黑脛病菌的侵入提供了有利條件，增加了植株患病的幾率[26]。屬水平上，感染黑脛病后，被孢霉屬、Soilcoccozyma、鐮刀菌屬、綠僵菌屬、青霉屬、新赤殼屬、Aspergillus、枝孢屬、籃狀菌屬相對豐度有所增加，此外Student’s T檢驗結(jié)果表明，Soilcoccozyma、鐮刀菌屬、Spiromastix、青霉屬在健康與感黑脛病煙株二者間具有顯著差異，而Soilcoccozyma差異極顯著(P<0.01)，其相對豐度是ZCTY中2.77倍，可能是引起煙株患黑脛病的重要微生物因素；而鐮刀菌為自然界中常見的病原菌與作物的生長密切相關(guān)[27]。其中，尖孢鐮刀菌(F.oxysporium)和茄病鐮刀菌侵染煙株能引起煙草根腐病發(fā)生[28]，本研究中發(fā)現(xiàn)感染黑脛病后其根際土壤中鐮刀菌豐度大幅升高，可能是由于田間根腐病與黑脛病混合發(fā)生造成該菌相對豐度的上升，同時感病植株凋萎死亡腐爛也會產(chǎn)生較多的腐生型鐮刀菌；此外，青霉屬是土壤真菌群落的主要菌群，廣泛存在于根際土壤中，能夠在干旱、貧瘠的土地中，且多數(shù)青霉菌為有益真菌，分泌活性物質(zhì)，降低土壤中有毒物質(zhì)的危害，促進作物生長，本研究該菌在感黑脛根際土壤中豐度大幅升高，可能是患病煙株為了防止黑脛病菌的進一步侵染其根際微生態(tài)做出的防御響應(yīng)[29]。而油壺菌屬、毛殼菌屬、赤霉菌屬、Plectosphaerella在ZCTY中的相對豐度明顯高于HJTY，其中油壺菌屬是一種重要的病毒病傳播介體，在煙草上能夠傳播煙草壞死病毒、矮化病毒和壞死衛(wèi)星病毒等病毒，其豐度的增高可能與周圍患病毒病的煙株有關(guān)；而毛殼菌屬對致病疫霉、辣椒疫霉、尖孢鐮刀等病原菌具有較好的抑制效果[30]，本研究在ZCTY中發(fā)現(xiàn)該菌豐度顯著高于HJTY，可能是由于其對煙草疫霉具有一定的抑制作用，進而抑制了煙草黑脛病的發(fā)生。

土傳病害的病原菌主要存活于土壤中，并從土壤環(huán)境獲取營養(yǎng)物質(zhì)滿足生長繁殖需要，因此土壤中環(huán)境理化因子含量的變化對植物病害的發(fā)生以及土壤微生物群落的分布產(chǎn)生重要的影響[14]。本研究中健康煙株與患病煙株兩者間的環(huán)境理化因子含量存在一定差異，且根際土壤中的主要菌屬與環(huán)境理化因子均有一定的正負(fù)相關(guān)性。其中，患病土壤中的有機質(zhì)和堿解氮和有效磷的含量高于健康土壤。有研究指出在土壤養(yǎng)分充足的環(huán)境下，病原菌更容易獲取營養(yǎng)物質(zhì)進行生長繁殖，并以此對抗具有拮抗作用的根際微生物，加劇病原菌的侵染進程[31]。而有機質(zhì)含量在20～40 g/kg時有利于烤煙的生長和品質(zhì)的形成，陳海念[32]在探究患青枯病和健康煙株土壤理化性質(zhì)時發(fā)現(xiàn)土壤中有機質(zhì)含量偏高可能會加劇青枯病病情的發(fā)展，這與本研究結(jié)果類似。而患病土壤中pH和速效鉀的含量則低于健康土壤，土壤中的鉀能夠誘導(dǎo)植株根系分泌抑制病原菌生長的分泌物增加植株抗病性，減少病害的發(fā)生[33-34]。其次，適宜的土壤酸堿度有利于植株根系養(yǎng)分的吸收和抗逆性的強化，作物長期生長在酸性的土壤中會加劇病害的發(fā)生[35]，而本研究中患病土壤的pH顯著低于健康土壤，在一定程度上表明煙株患病后土壤酸性增加，在農(nóng)業(yè)實踐中可通過移栽前進行土地翻耕、合理施肥和使用生石灰等土壤改良劑進行改善土壤質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本研究表明，煙株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的改變是煙草黑脛病感染煙株后造成根際土壤微生態(tài)環(huán)境變化的重要指征之一，鐮刀菌屬、被孢霉屬、青霉屬等相關(guān)病原菌及腐生菌在患黑脛病土壤中顯著增加，而毛殼菌屬等有益菌屬顯著減少；此外，健康煙株與患病煙株兩者間的環(huán)境理化因子含量存在一定差異，且根際土壤中的主要菌屬與環(huán)境理化因子具有一定的正負(fù)相關(guān)性。