王鵬程，金光輝，張春雨，李 鑫

(黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江 大慶 163000)

【研究意義】馬鈴薯瘡痂病是一種由瘡痂鏈霉菌(Streptomycesscabies)引起的馬鈴薯世界性土傳病害，該病集中在塊莖形成期和膨大期侵染，塊莖感染后在表面產(chǎn)生棕色或深色的痂狀病變，嚴重時病斑聚結形成不規(guī)則的團塊，覆蓋塊莖表面大部分區(qū)域，降低塊莖品質，造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。瘡痂鏈霉菌是一種非特異性寄主病原體，發(fā)病機制復雜，在土壤中存活能力強，可通過風、水流或帶病種薯傳播，難以根除[2]。目前，主要采用化學藥劑處理種薯、輪作及選擇適宜抗性品種等方法對馬鈴薯瘡痂病進行防治[2]?；瘜W藥劑防效不佳，常年使用不僅容易產(chǎn)生抗藥性，還容易對環(huán)境造成污染；瘡痂鏈霉菌在土壤中存活時間長，間隔時間5年以上，輪作困難。由于目前對瘡痂鏈霉菌遺傳多樣性及不同馬鈴薯品種間的遺傳差異研究較少[2]，國內僅鑒定出墾薯1號[3]、鈴田紅美[4]2個表現(xiàn)出高抗的品種，尚未發(fā)現(xiàn)或培育出完全抗性的商業(yè)化品種。因此，尋找高效、安全防治馬鈴薯瘡痂病的方法具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，國內外關于有益微生物防治馬鈴薯瘡痂病已有報道。Han等[5]從馬鈴薯種植區(qū)土壤中分離出一株拮抗芽胞桿菌Bacillussp. Sunhua，在盆栽試驗中瘡痂病發(fā)病率從75%降至35%。St-Onge等[6]對Pseudomonassp.LBUM 223研究發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生的抗生素(PCA)能夠抑制S.scabies的生長及關鍵致病性基因的表達，具備生物防治潛力。郭鳳柳等[7]與李勇等[8]分別鑒定出枯草芽胞桿菌B.subtilisB1與B.subtilisZWQ-1，盆栽試驗明確其對馬鈴薯瘡痂病有較好的防效。申永瑞等[9]從采集的馬鈴薯瘡痂病的病害土壤中篩選出1株貝萊斯芽胞桿菌B.velezensisBU396，在盆栽試驗中，采用1×109CFU/mL生防菌灌根60 mL，對馬鈴薯瘡痂病的相對防效達到76.18%。目前有關馬鈴薯瘡痂病生物防治研究鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】本研究所選用的3株生防細菌均篩選自黑龍江省馬鈴薯根際土壤，平板對峙試驗表明，對馬鈴薯瘡痂病有較好的拮抗作用，2018年盆栽試驗篩選出幾個對瘡痂病有較好防治效果的生防菌復配組合?！緮M解決的關鍵問題】本試驗探究了生防菌的不同組合及拌種和土壤處理這2種施用方式對馬鈴薯瘡痂病防治的影響，同時對株高、莖粗及產(chǎn)量指標進行了測定，探究其對植株生長的影響，以期為3株生防菌應用于馬鈴薯瘡痂病的防治提供更多新的解決路徑和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試馬鈴薯品種：盆栽試驗與田間試驗均為感病品種‘尤金’，該品種對Stretpomycesscabies敏感，發(fā)病嚴重且表型明顯，由黑龍江八一農墾大學馬鈴薯研究所提供。

生防菌：枯草芽胞桿菌BacillussubtilisZD13-5、地衣芽胞桿菌B.licheniformisSD24-3及解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciensZD21-4由黑龍江八一農墾大學馬鈴薯研究所提供，生防菌粉由湖北中向生物工程有限公司提供，含量均為1011CFU/g。病原菌：馬鈴薯瘡痂病菌S.scabiesKS28-2由黑龍江省農業(yè)科學院馬鈴薯研究所提供，黑龍江八一農墾大學馬鈴薯研究所保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

酵母麥芽精瓊脂(YME)培養(yǎng)基：酵母提取物4 g，麥芽糖10 g，葡萄糖4 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.2。

1.3 生防菌組合對馬鈴薯瘡痂病的防治效果及促生作用

1.3.1 病原菌孢子懸浮液制備 采用劃線法將瘡痂病菌接種于YME培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)15 d后，向培養(yǎng)皿倒入適量無菌蒸餾水，輕刮菌絲，制成孢子懸浮液，將同種菌株的孢子懸浮液混勻后調節(jié)濃度至107CFU/mL。

1.3.2 拌種劑制備 將含量為1011CFU/g的生防菌粉混入活性炭，制成濃度為109CFU/g的母劑，生防菌組合ZD13-5+SD24-3、ZD13-5+ZD21-4、SD24-3+ZD21-4按3∶3的比例混勻，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4按2∶2∶2的比例混勻制成拌種劑。

1.3.3 生防菌液制備 將含量為1011CFU/g的生防菌粉溶于無菌蒸餾水，制成濃度為109CFU/mL的母液，生防菌組合ZD13-5+SD24-3、ZD13-5+ZD21-4、SD24-3+ZD21-4按3∶3的比例混勻，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4按2∶2∶2的比例混勻制成生防菌液。

1.3.4 盆栽試驗 為期2年的盆栽試驗在黑龍江八一農墾大學進行，其中拌種處理分別于2018、2019年進行，基質處理僅在2019年進行，參照劉淑娜[3]的方法并略有調整，馬鈴薯種薯經(jīng)0.1%的高錳酸鉀浸泡15 min后，用無菌蒸餾水沖洗3遍，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽，至芽長0.5 cm左右，播種前切至50 g帶1～2個芽眼的薯塊。蛭石、珍珠巖、草炭土按1.0∶1.0∶2.0的比例混勻后滅菌，用作盆栽基質。在35 cm×35 cm的花盆中裝入2.5 kg的基質，每盆加入150 mL濃度為107CFU/mL的病原菌孢子懸浮液，混勻后加入15 g復合肥(氮磷鉀比例11∶23∶16)，覆蓋0.5 kg基質后澆透水，按不同處理放入薯塊并覆蓋2.5 kg基質。試驗設置9個處理，4個拌種處理按拌種劑：種薯按1∶100的比例質量比混拌均勻后播種；4個基質處理按m(生防菌液)∶m(種薯)=1∶5比例播種前用小噴壺均勻噴施在基質表面后播種，然后覆蓋2.5 kg基質，1個對照，不做處理直接種入基質。處理1: CK；處理2:ZD13-5+SD24-3拌種；處理3:ZD13-5+ZD21-4拌種；處理4:SD24-3+ZD21-4拌種；處理5: ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌種；處理6:ZD13-5+SD24-3基質處理；處理7:ZD13-5+ZD21-4基質處理；處理8:SD24-3+ZD21-4基質處理；處理9: ZD13-5+SD24-3+ZD21-4基質處理。每個處理3個重復，每個重復3盆。出苗40 d后調查株高，莖粗，根長，根鮮重，9月25日進行收獲，每盆單獨收獲后調查大中薯率、產(chǎn)量與病情指數(shù)并計算防效。

1.3.5 田間試驗 試驗于2019年在黑龍省農業(yè)科學院克山分院試驗田進行，該試驗田已經(jīng)連續(xù)3年以上種植馬鈴薯，馬鈴薯瘡痂病發(fā)病率超過70%。試驗田春季起壟，行距80 cm，行長3 m，每區(qū)5行，每行種植12株，人工開溝播種。試驗設置9個處理，4個拌種處理按拌種劑：種薯(質量比)1∶100的比例混拌均勻后播入溝中覆土，4個土壤處理按m(生防菌液)∶m(種薯)=1∶5比例播種前用小噴壺均勻噴施在溝中土壤表面，將塊莖播入溝中覆土，1個空白對照，不做處理，直接將塊莖播種入溝中覆土，采用隨機區(qū)組試驗設計。處理1: CK；處理2:ZD13-5+SD24-3拌種；處理3:ZD13-5+ZD21-4拌種；處理4:SD24-3+ZD21-4拌種；處理5: ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌種；處理6:ZD13-5+SD24-3土壤處理；處理7:ZD13-5+ZD21-4土壤處理；處理8:SD24-3+ZD21-4土壤處理；處理9: ZD13-5+SD24-3+ZD21-4土壤處理。設置3次重復，試驗地四周設置保護行，試驗于5月6日進行播種，田間常規(guī)管理，出苗40 d后調查株高、莖粗，9月30日收獲，對小區(qū)中間3行逐株調查病情指數(shù)、大中薯率與產(chǎn)量并計算防效。

1.3.6 受害程度調查 病情調查的方法參照邢瑩瑩[10]、吳立萍[4]等的方法，塊莖洗凈晾干后調查每個重復的病斑面積等級和病斑深度等級(表1)，并計算病斑面積等級均值(MA)和病斑深度等級均值(MD)，并按下式計算病情指數(shù)(Scab Index，SI)。

表1 馬鈴薯瘡痂病害分級標準

SI=(MA×MD)/20×100

1.3.7 生長指標測定 株高：測量植株地上最高主莖自地面到頂端部分長度。

莖粗：測量植株地上5～10 cm處的最大直徑。

根長：測量植株最長根的長度。

根鮮重：挖出全部地面以下根系，洗凈后晾干，測量鮮重。

大中薯率：收獲后測定大中薯與小薯個數(shù)，計算大中薯率。其中大中薯標準為塊莖質量≥75 g，低于75 g為小薯。

產(chǎn)量：收獲后調查測產(chǎn)區(qū)產(chǎn)量，計算每公頃產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計與分析。

2 結果與分析

2.1 盆栽試驗防治效果

在2018和2019年的盆栽試驗中，不同生防菌組合均對瘡痂病有較好的防治效果，經(jīng)拌種處理病情指數(shù)均顯著低于對照(表2)。2018年3株生防菌組合防治效果最好，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4防治效果達80.68%，病情指數(shù)為3.89。ZD13-5+SD24-3病情指數(shù)顯著高于其它生防菌組合，防治效果僅為36.52%；SD24-3+ZD21-4防治效果為79.25%，僅次于ZD13-5+SD24-3+ZD21-4。2019年病害發(fā)生程度較2018年高，各處理病情指數(shù)均有不同幅度提升，防治效果總體上也較2018年有所降低，其中ZD13-5+SD24-3+ZD21-4防治效果為74.68%，較2018年降低6%，病情指數(shù)為6.78，較2018年提高2.89；SD24-3+ZD21-4防治效果為68.33%，較2018年降低10.92%，病情指數(shù)為8.48，較2018年提高4.3。ZD13-5+SD24-3病情指數(shù)高于其它組合，達到14.59，較2018年提高1.81，防治效果為45.53%，較2018年提高9.01%。

表2 2018—2019年盆栽實驗中不同處理對馬鈴薯瘡痂病的影響

2019年的盆栽試驗中，基質噴施不同組合生防菌同樣對瘡痂病有較好的防治效果，各處理病情指數(shù)均顯著低于對照。ZD13-5+ZD21-4防治效果最好，達74.48%，病情指數(shù)為7.50；ZD13-5+SD24-3+ZD21-4 防治效果為71.08%，病情指數(shù)為8.50，僅次于ZD13-5+ZD21-4；ZD13-5+SD24-3防治效果低于其它組合，僅為44.98%。

使用生防菌拌種能顯著降低馬鈴薯瘡痂病危害程度，不同組合生防菌防治效果存在差異，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4防治效果最佳且較為穩(wěn)定。生防菌拌種與基質處理均對馬鈴薯瘡痂病有較好的防治效果，相同組合生防菌不同施用方式間防治效果無顯著差異。

2.2 盆栽試驗生防菌促生作用

不同處理對馬鈴薯的促生作用存在較大差異(表3)，SD24-3+ZD21-4無論拌種還是基質處理相較其他處理，均有較好的促生作用，與對照相比，SD24-3+ZD21-4拌種處理的株高增加28.89%，莖粗增加16.22%，鮮重增加36.69%；SD24-3+ZD21-4基質處理的株高增加21.50%，莖粗增加56.76%，鮮重增加35.29%，且均達到顯著差異水平。ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌種和基質處理的株高、莖粗和鮮重均小于SD24-3+ZD21-4處理，但差異未達到顯著水平。與對照相比，ZD13-5+SD24-3拌種處理的馬鈴薯鮮重增長率為負，與ZD13-5+ZD21-4拌種處理相比，莖粗的增長率相同，株高差異顯著，ZD13-5+ZD21-4拌種處理馬鈴薯鮮重增長率為18.49%；與對照相比，ZD13-5+SD24-3和ZD13-5+ZD21-4基質處理的株高、莖粗和鮮重均有增長，且ZD13-5+SD24-3和ZD13-5+ZD21-4間差異不顯著。與對照相比，除ZD13-5+ZD21-4和ZD13-5+SD24-3拌種處理外，其余處理均能顯著增加根重，促進根發(fā)育，此外ZD13-5+SD24-3+ZD21-4基質處理還能顯著增加根長。盆栽試驗結果表明，菌株SD24-3、ZD21-4和ZD13-5可以通過增加株高、莖粗、根生長發(fā)育及塊莖鮮重來促進馬鈴薯生長，不同施用方式對植株促生作用的影響在不同生防菌組合間存在差異，拌種和基質處理互有優(yōu)劣，從塊莖鮮重來看，不同施用方式對生防菌的促生作用無顯著影響。

表3 2019年盆栽試驗中不同處理對馬鈴薯的促生作用和產(chǎn)量影響

2.3 田間試驗防治效果

在田間環(huán)境中，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4與SD24-3+ZD21-4拌種防治效果優(yōu)于土壤處理(表4)，病害程度也低于土壤處理，其余處理不同施用方式對防治效果無顯著影響。拌種處理中，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4防治效果最好(61.60%)，病害程度最輕；ZD13-5+SD24-3防治效果最差(11.35%)，病害嚴重程度與對照相比差異不顯著。土壤處理中，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4病情指數(shù)顯著低于對照，其余各處理與對照無顯著差異，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4防治效果最好為35.48%，與拌種相比防治效果明顯降低；ZD13-5+ZD21-4病害嚴重程度高于對照。結果表明，田間使用3株生防菌混合拌種防治效果優(yōu)于土壤噴施，能較好防治馬鈴薯瘡痂病。

表4 2019年田間試驗中不同處理對馬鈴薯瘡痂病的影響

2.4 田間試驗生防菌促生作用

田間環(huán)境下，不同處理對馬鈴薯有一定的促生作用，但未達到顯著水平(表5)。除ZD13-5+SD24-3外，各處理均對株高有一定的促進作用，其中ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌種處理的株高43.90 cm，明顯高于對照，增長9.26%；ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌種處理、ZD13-5+SD24-3土壤處理及ZD13-5+SD24-3+ZD21-4土壤處理與對照相比，莖粗均增長9.09%。ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌種和土壤處理的產(chǎn)量分別達到36 937.50和39 262.50 kg/hm2，與對照相比分別增產(chǎn)26.28%和34.23%；此外，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌種還能提高馬鈴薯大中薯率，與對照相比增加8.44%。ZD13-5+SD24-3拌種和土壤處理大中薯率較對照(56.23%)，分別提高13.82%和12.34%。結果表明，田間復雜環(huán)境下菌株SD24-3、ZD21-4和ZD13-5促生作用受一定影響。此外，菌株除促進馬鈴薯株高，莖粗外，還能促進馬鈴薯結薯及塊莖膨大，從而促進馬鈴薯生長及產(chǎn)量提高。

表5 2019年大田試驗中不同處理對馬鈴薯的促生作用和產(chǎn)量影響

3 討 論

本試驗選用的枯草芽胞桿菌ZD13-5、地衣芽胞桿菌SD24-3和解淀粉芽胞桿菌ZD21-4具有開發(fā)為混合菌劑的潛力，3株生防菌混配拌種使用防治效果最好，優(yōu)于2株生防菌復配。研究表明生防菌混配可拓寬其適應范圍，提高生防效果[11-12]。魏滟潔等[13]通過枯草芽胞桿菌B.subtilisJ2和球毛殼菌ChaetomiumglobosumND35混配，發(fā)現(xiàn)對黃瓜苗期枯萎病的防治效果優(yōu)于單一生防菌；柳春燕等[14]將枯草芽胞桿菌(B.subtilis)和擬康氏木霉(Trichodermapseudokoningii)混配用于田間防治黃瓜枯萎病試驗，得出2株菌混合具有一定協(xié)同作用的結論。劉大群等[15]研究拮抗鏈霉菌(Streptomycesstrains)防治馬鈴薯瘡痂病表明，單株拮抗菌株防治效果,優(yōu)于2株拮抗菌混配，與本結論相反；呂建林等[16]研究表明，將枯草芽胞桿菌(B.subtilis)與其他生防芽胞桿菌兩兩混接能顯著提高對煙草青枯病的防治效果，最高達83.39%，但3株菌混接防效僅為45.49%，推測不同生防菌間除協(xié)同作用外可能還存在競爭關系。關于3株生防菌混配后對馬鈴薯瘡痂病有較好防治作用的機理還需進一步研究。

本試驗所用的生防菌不僅能有效防治馬鈴薯瘡痂病，還能促進植株生長，提高作物產(chǎn)量。這與Wang等[17]的結果相類似，其通過9.5×108CFU/g枯草芽胞桿菌B.subtilisznjdf1和0.5×108CFU/g哈茨木霉Trichodermaharzianumznlkhc1隨開溝播種時隨種薯一起撒入溝槽，使病情指數(shù)降低30.6%～46.1%，產(chǎn)量增加23.0%～32.2%。Zhang等[18]通大田試驗對拮抗菌株Streptomycessp.strain PBSH9進行了研究，研究表明PBSH9防治效果優(yōu)于商品化鏈霉素，防效47.64%～73.97%，增產(chǎn)9.70%～15.93%。Sarwar等[19]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌StreptomycesA1RT不僅可以產(chǎn)生Isatropolone C抑制多種瘡痂病原菌，有效減少病害發(fā)生，還可以產(chǎn)生大量IAA來促進植株與塊莖的生長發(fā)育。Sarwar等[20]還發(fā)現(xiàn)鏈霉菌StreptomycesviolaceusnigerAC12AB可以通過產(chǎn)生阿扎霉素 RS22A來減輕病害發(fā)生程度，還可以通過產(chǎn)生IAA、溶解磷酸鹽、固氮等促進馬鈴薯生長發(fā)育。阿扎霉素具有廣譜抗菌性[21]。芽胞桿菌作為植物根際促生長微生物的代表被廣泛研究，同時可以防止病原菌侵染或誘導植物抗病。Bais等[22]發(fā)現(xiàn)B.subtilis6051在植株根部定殖后可以形成生物膜和分泌表面活性物質，共同保護植株免受病原菌侵染。解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens通過fengycin、surfactin等環(huán)狀脂肽在內的多種廣譜抗菌化合物抵御病原菌侵染[23-24]。地衣芽胞桿菌可產(chǎn)生3-甲基-1丁醇等揮發(fā)物對植物病原真菌產(chǎn)生抑制[26-27]。關于本文所用3株生防芽胞桿菌，通過何種方式促進植株生長和抵御病害發(fā)生有待進一步研究。

不同的施用方式可能對生防菌的生物防治及促生作用產(chǎn)生影響，綜合本試驗結果，田間拌種使用優(yōu)于土壤噴施。這與Zhang等[29]的結果相類似，其發(fā)現(xiàn)拌種比土壤處理更適合PBSH9接種，同樣，Dubey等[28]研究木霉菌防治綠豆根腐病發(fā)現(xiàn)種子處理效果均優(yōu)于土壤施用。Martyniuk等[29]通過大豆土壤和種子接種根瘤菌，發(fā)現(xiàn)土壤接種比種子接種增產(chǎn)57%左右，與本文結論相反。Manzar等[30]研究發(fā)現(xiàn)木霉菌土壤施用和種子處理組合施用對高粱的促生作用優(yōu)于單獨施用；黎妍妍等[31]研究認為生防菌拌土圍根對煙草青枯病的防治效果優(yōu)于兌水灌根。以上研究表明，不同的生防菌選擇合適的施用方式將有利于展現(xiàn)其應用效果。在田間使用中，生防菌還常與殺菌劑、有機肥等載體及栽培措施結合使用。此外，本試驗所用生防菌田間防治效果均低于盆栽，可能由于田間條件復雜多變，受到諸如土壤性質，天氣條件等因素的影響，使得結果不一定與盆栽相一致[32]。

綜上所述，有關3株生防菌促生及防治作用的機理等待進一步研究，同時需要廣泛的田間試驗進一步明確3株生防菌在田間條件下的施用方式、穩(wěn)定的防效，為今后開發(fā)應用混合生防菌劑防治馬鈴薯瘡痂病提供理論基礎和新的解決路徑。

4 結 論

生防菌枯草芽胞桿菌ZD13-5、地衣芽胞桿菌SD24-3和解淀粉芽胞桿菌ZD21-4對馬鈴薯瘡痂病有較好防治效果，同時能促進植株生長提高產(chǎn)量；適宜的生防菌混配可利用協(xié)同作用提高其效果；不同的施用方式會影響生防菌的實際效果，本試驗表明種薯拌種比土壤噴施更適合馬鈴薯瘡痂病防治，綜合評價得出ZD13-5+SD24-3+ZD21-4種薯拌種效果最佳。