楊應美, 盧燦華, 羅朝旺,蘇家恩，吳德喜, 夏振遠

(1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，昆明 650201; 2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院，昆明 650021; 3.云南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，昆明 650201;4.云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000)

【研究意義】煙草黑脛病(Phytophoraparasiticavar.nicotiana)是全球煙區(qū)普遍發(fā)生的一種重要土傳病害，在全球引起的經(jīng)濟損失通常難以估計[1]，是制約中國煙草優(yōu)質(zhì)安全生產(chǎn)的重要因素[2]。【前人研究進展】目前，防控煙草黑脛病的主要措施是化學防治，但接踵而至的是黑脛病抗藥性的增強，且造成大量的農(nóng)藥殘留，進而破壞了土壤環(huán)境[3]。此外，在烤煙種植過程中，植煙土壤由于長期使用化肥，導致土層板結(jié)，肥力下降，土壤微生物多樣性減少，將嚴重影響煙葉品質(zhì)[4]。而生防菌既可以抑制病原菌[5]，又可以改良農(nóng)作物田間土壤[6]，還可以誘導植物抗病基因的表達[7]。生防菌、病原菌、植物、土壤微生物4者之間是環(huán)環(huán)相扣、密切互作的。生防菌的應用會影響根際土壤微生物群落的變化，根際環(huán)境生物多樣性是影響煙病害的重要因素[8-9]。煙草根際微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，多樣性越高，病原菌越難存活，煙草根際土中有益微生物數(shù)量會增加，潛在致病菌等有害微生物數(shù)量會減少，煙草的抗病能力會增強，烤煙的產(chǎn)質(zhì)量就會越高[10-11]。因此，施用生防菌防治煙草黑脛病是一種有效途徑。陸寧[12]、張永春[13]、王萬能[14]、楊廷[15]、張慧麗[16]、趙秀香[17]等做了相關(guān)研究報道?！颈狙芯壳腥朦c】針對云南省煙草種植面積較大，煙草產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生煙草黑脛病，對煙草產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟影響十分巨大。本研究開展了煙草黑脛病生防菌的篩選鑒定，并研究其對煙草根際土壤中微生物群落的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選鑒定煙草黑脛病生防菌，豐富云南省煙草黑脛病生防菌資源，評價生防菌對煙草根際土壤中疫霉菌的孢子數(shù)、煙草根際微生物的群落結(jié)構(gòu)、微生物的多樣性和豐富度的影響，為研究煙草黑脛病發(fā)生的微生態(tài)機制及其生物防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 根際土壤微生物的誘集

采用根際土壤微生物誘集法[18]誘集根際微生物，具體步驟如下。

步驟1，微生物培養(yǎng)。①分選土壤：將土壤樣品去除雜質(zhì)和較大塊狀物后，裝入培養(yǎng)皿中，用蒸餾水將土壤潤濕；②制作微生物誘集裝置：首先在微孔濾膜邊緣涂布膠水，將不銹鋼平底墊圈置于微孔濾膜上；然后向墊圈內(nèi)腔加入固體培養(yǎng)基；再用膠水涂布金屬墊圈上表面，蓋上另一微孔濾膜；將所述微生物誘集裝置置于①中濕潤的土壤上，輕輕壓實該誘微生物集裝置，確保微孔濾膜與土壤充分接觸，再用土壤將微生物誘集裝置完全覆蓋，并用蒸餾水再次潤濕土壤；③培養(yǎng)：蓋好培養(yǎng)皿，用封口膜將玻璃培養(yǎng)基封好，即制作成微生物培養(yǎng)裝置，并置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。步驟2，微生物分離。①制備菌懸液并梯度稀釋：從培養(yǎng)箱中取出經(jīng)過微生物誘集的培養(yǎng)裝置，將固體培養(yǎng)基搗碎，加入無菌水放置10 min后，梯度稀釋至10-4；②涂布寡營養(yǎng)平板并培養(yǎng)：取10-4菌液涂布于寡營養(yǎng)培養(yǎng)基，每個梯度涂布5皿，于超凈工作臺吹干，并置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。步驟3，微生物保存。①根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等不同，將代表性單菌落劃線于純化培養(yǎng)基平板，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，獲得單菌落即為純培養(yǎng)物；②接種純培養(yǎng)物于保存培養(yǎng)基，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，離心收集菌體，加保存液懸浮菌體，置于-80 ℃超低溫冰箱保藏。

1.2 煙草黑脛病拮抗細菌的篩選

將分離獲得的單菌落采用平板拮抗的方式進行拮抗菌的篩選。用直徑0.5 cm的無菌打孔器打出黑脛病菌餅接到燕麥瓊脂培養(yǎng)基中心，在距離中心位置約3 cm的4個點接種拮抗菌菌塊。將培養(yǎng)皿放入28 ℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，測定菌落半徑，并采用公式(1)計算抑菌率。

抑菌率(%)=(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑×100

(1)

1.3 煙草黑脛病拮抗細菌防效測定

選取抑菌率較好的2株拮抗菌79-14和05-1506進行溫室盆栽試驗，試驗設3個處理：處理1，拮抗菌79-14；處理2，拮抗菌05-1506；處理3(CK)，清水對照。苗齡60 d的煙苗移栽緩苗7 d后采用灌根法接種煙草疫霉菌，接種濃度為1×105個/mL(每株100 mL)，病原菌接種后6 h內(nèi)完成拮抗菌灌根處理，處理1灌根拮抗菌79-14，濃度為1×105CFU/mL(每株100 mL)；處理2灌根拮抗菌05-1506，濃度為1×105CFU/mL(每株100 mL)；處理3灌根100 mL 蒸餾水。每個處理進行3個平行試驗，每個平行試驗處理10株煙苗。30 d后調(diào)查發(fā)病情況，并按公式(2)和公式(3)分別計算病情指數(shù)和防治效果。參照Zhao等[19]的根際土采集方法，按發(fā)病重度、中度、輕度和不發(fā)病各采取4株煙草根際土樣，混合均勻，放入無菌密封袋裝入冰盒，帶回實驗室-80 ℃ 保存，用于實時熒光定量PCR檢測以及細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的分析。

病情指數(shù)=[∑(各病級株數(shù) × 各病級代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級代表值)]×100

(2)

防治效果(%)=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù) ×100

(3)

1.4 生防菌的鑒定

取1.5 mL活化的菌液，用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以細菌基因組DNA為模板，13F(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)和13R(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)為通用引物進行16S rDNA基因序列擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)過Trans-T1 感受態(tài)細胞進行連接，連接產(chǎn)物用T5 Zero進行轉(zhuǎn)化，取50 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h，得到菌落，經(jīng)菌落 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后送上海英濰捷基測序公司測序。測序后利用BLAST軟件進行同源性比較，用軟件MEGA 7.0的Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 土壤中煙草疫霉菌的MGB探針實時熒光定量PCR檢測

采用血球計數(shù)板計數(shù)法將煙草疫霉菌游動孢子懸浮液添加無菌水稀釋成 1×108、1×107、1×106、1×105、1×104和 1×103共6 個濃度，分別取 2 mL，加入到裝有2 g土壤(無煙草疫霉菌)的離心管中，混勻，以加入無菌水滅菌土壤為空白對照，將樣品自然風干，每個樣品3個重復，使用PowerSoil DNA Isolation Kit(MO BIO，Inc.)試劑盒，提取其基因組 DNA，用于擴增繪制標準曲線。利用實驗室前期篩選到的特異性探針引物ZH1：5′-GCAGATCTTGCCGTTCGAAT-3′，ZH2：5′-GCTCGCTTGCAGGTTTATT TG-3′，P-ZH：FAM-5′-CTACACGGTACAACAGCT-3′-NFQ-MGB，同時擴增標準品和實驗土壤DNA樣品。擴增反應體系：2×TaqMan Fast qPCR Master Mix 10 μL，探針引物各0.4 μL，DNA模板2 μL，DNF Buffer 2 μL，用 ddH2O 補足體積至20 μL。反應條件：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃ 變性5 s，56 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，45個循環(huán)。每個土樣做3個平行實驗，結(jié)果取平均值。

1.6 煙草根際土壤細菌和真菌多樣性分析

使用MP Fast?DNA試劑盒(MP Biomedicals，CA，USA)提取土壤DNA，使用PowerClean?DNA Clean-up Kit(MoBio，CA，USA)進行純化，使用NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop Technologies，DE，USA)檢測DNA濃度和純度，然后委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成高通量測序。煙草根際土壤細菌擴增子多樣性分析中應用細菌16S rDNA 的V3～V4 區(qū)序列，所用引物為341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′，806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′，真菌擴增子多樣性采用ITS1-5F區(qū)序列，引物為ITS5-1737F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，ITS2-2043R：5′-GCTGCGTTCTTCAT CGATGC-3′。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

經(jīng)高通量測序得到的雙端序列經(jīng)拼接與質(zhì)控過濾得到優(yōu)化序列，采用Usearch(version 7.0 http://drive5.com/uparse/)進行OTU聚類，對97%相似水平的OTU與Unite(Release 7.2 http://unite.ut.ee/index.php)數(shù)據(jù)庫比對并進行OTU物種注釋；采用軟件Mothur(version v.1.30.1)計算Alpha多樣性指數(shù)，Alpha多樣性分析，可以反映微生物群落的豐富度與多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草黑脛病生防菌的篩選及鑒定

通過土壤細菌誘集法，從來自云南省不同地區(qū)的20份植煙土壤中分離了120株土壤細菌，將每株菌進行平板拮抗試驗，結(jié)果找出2株拮抗煙草黑脛病最明顯的菌株79-14和05-1506，其抑菌率分別為76%和72%(表1)。防效試驗結(jié)果表明，2株拮抗菌的防效分別為64%和76%(表2)。將2株生防菌79-14和05-1506的16S rDNA 序列通過BLAST程序?qū)Ρ确治?，發(fā)現(xiàn)79-14與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)進化關(guān)系最近，同源性達100%，05-1506與蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)進化關(guān)系最近，同源性100%(圖1)，由此將2株菌鑒定為芽孢桿菌。

表1 平板對峙結(jié)果

表2 生防菌盆栽防效

圖1 菌株79-14和05-1506的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 根際土壤中煙草疫霉菌的MGB探針實時熒光定量分析

由表3可知，處理1、處理2和處理 3(CK)的每克土壤所含煙草疫霉菌孢子數(shù)量分別為3.02×104、8.13×103和4.07×106個，處理1和處理2均比處理 3(CK)降低了2個數(shù)量級?？梢姡┤牒Y選的2株芽孢桿菌 79-14 和 05-1506 后顯著降低了土壤中煙草疫霉菌孢子的數(shù)量，菌株05-1506降低程度更大。

表3 土壤中煙草疫霉菌檢測結(jié)果

2.3 煙草根際土壤細菌和真菌群落 α 多樣性分析

對煙草根際土壤中細菌和真菌群落進行測序分析，細菌 α 多樣性指數(shù)總體上均高于真菌，說明細菌在煙草根際土壤微生物中占主導地位。各處理中細菌和真菌測序覆蓋率分別在98%和 99%以上，表明樣品中的序列絕大多數(shù)被測出，測序結(jié)果能夠較好反映煙草根際土壤細菌、真菌群落組成的真實情況(表4)。

表4 不同處理根際土壤細菌和真菌群落的a多樣性指數(shù)

在細菌群落 α 多樣性指數(shù)中，OTUs 數(shù)目和Chao1指數(shù)排序均為 處理3 >處理1 >處理2，Shannon 指數(shù)排序為處理3 >處理2 >處理1；在真菌群落 α 多樣性指數(shù)中，OTUs 數(shù)目和Chao1指數(shù)排序均為處理2 >處理1 >處理3，Shannon 指數(shù)排序為處理1 >處理2 >處理3，說明施入芽孢桿菌提高了土壤真菌多樣性，降低了土壤細菌多樣性。

2.4 生防菌對烤煙根際土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可知，各處理烤煙根際土壤細菌豐富度前10的門包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、厚壁菌門(Firmicutes)、不明細菌(unidentified_Bacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍藻門(Cyanobacteria)、疣微門(Verrucomicrobiota)和粘球菌門(Myxococcota)。細菌相對豐度大于 10%的門主要有變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、不明細菌和擬桿菌門，其中變形菌門的豐度最高，占各樣本總有效序列30%以上。處理2和處理1的變形菌門和擬桿菌門相對豐度比處理3的高，放線菌門比處理3的低。厚壁菌門相對豐度處理2﹥處理3﹥處理1。說明施入芽孢桿菌改變了烤煙根際土壤細菌群落優(yōu)勢種群的比例。

圖2 生防菌在門水平上對樣本細菌(a)和真菌(b)物種組成的影響

各處理烤煙根際土壤真菌豐富度前10的菌門包括子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、被孢霉菌門(Mortierellomycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)、捕蟲霉門(Zoopagomycota)、Aphelidiomycota門和芽枝霉門(Blastocladiomycota)。真菌相對豐度大于 10%的門主要有子囊菌門、壺菌門和被孢霉菌門，其中子囊菌門的豐度最高，占各樣本總有效序列60%以上。處理2和處理1的子囊菌門、羅茲菌門和擔子菌門相對豐度高于處理3的相對豐度，壺菌門和被孢霉菌門的相對豐度低于處理3的相對豐度。說明施入芽孢桿菌能提高烤煙根際土壤真菌群落優(yōu)勢種群子囊菌門、羅茲菌門和擔子菌門的比例，而降低壺菌門和被孢霉菌門的比例。

3 討 論

目前已報道的煙草黑脛病生防菌主要是通過高溫加熱法篩選獲得的芽孢桿菌，還有少量的熒光假單胞菌，生防資源范圍較為狹窄。土壤是生防菌的重要來源，但土壤中難培養(yǎng)微生物幾乎占到99%，其培養(yǎng)技術(shù)的核心是抓住細菌自身特性、模擬天然生存條件、使用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基、適當延長培養(yǎng)時間[20]。本研究團隊前期發(fā)明了“一種土壤微生物誘集的方法”[18]，該方法打破了常規(guī)分離法，突破性地模擬了土壤細菌的天然生存環(huán)境，獲得了包括“難培養(yǎng)、繁殖速度慢”的土壤細菌，拓展了細菌的分離深度，提高微生物活性，更加高效的篩選出有用的生防菌，煙草黑脛病防治方面有著更大研究潛力。

芽孢桿菌是目前研究最多、也是最重要一類的生防細菌，它們能產(chǎn)生耐熱抗逆芽孢，有易繁殖、生長速度快、適應性強和防治效果好等特點，有利于生防農(nóng)藥的生產(chǎn)和拮抗菌在環(huán)境中存活和定殖[21]，與真菌和放線菌生防菌劑相比，更受人們的關(guān)注。Torres等[22]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)對番茄，花椒，南瓜和黃瓜等一些蔬菜的地上鮮重有促進作用，而且具有一定的抑制真菌生長的能力；易磊[23]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌CR-502(B.velezensisCR-502)具有抑制黑曲霉菌和多種植物病原菌的正常生長；李超峰[24]研究發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)用于配制生物殺蟲劑。本研究采用“土壤細菌誘集法”分離出了120份土壤細菌，最終獲得了2 株芽孢桿菌79-14和05-1506，豐富了同領域的研究內(nèi)容，為同類研究提供重要參考和補充，為煙草黑脛病的生物防治提供了新的資源。

值得注意的是，本研究在實驗室平板對峙中芽孢桿菌79-14的抑菌率比05-1506的大，但在盆栽試驗中79-14的防治效果比05-1506的低12%，通過分析，一方面可能是79-14的拮抗性能和定殖能力比05-1506的弱。曾衡等[25]研究發(fā)現(xiàn)，生防菌的防治效果與該菌在土壤和植株上的定殖能力有關(guān)。實驗室平板對峙和溫室盆栽土壤在溫度、養(yǎng)分、水分等方面都有著很大的差距。因此，生防菌對煙草黑脛病菌的拮抗能力并不等同于防治能力，生防菌在使用過程中，環(huán)境對其影響較大，所以，在進行生物防治時，應高度重視生防菌的環(huán)境適應性。另一方面可能是土壤根際微生物組的作用使得平板上抑制效果好的菌株在土壤條件中生長不理想，導致試驗結(jié)果存在差異。因此，本研究進一步研究了芽孢桿菌79-14和05-1506對根際土壤微生物群落的作用。

生防菌對土壤中的細菌、真菌和病原菌都具有調(diào)控作用。樊祖清等[26]研究表明，在煙田施用解淀粉芽孢桿菌菌劑后，改善了土壤微生物結(jié)構(gòu)，增加了有益菌的含量并提高了烤煙的產(chǎn)量。連玲麗等[27]研究發(fā)現(xiàn)，生防芽孢桿菌EN5處理改善了根際土壤中細菌群體的多樣性。本研究也發(fā)現(xiàn)，施入芽孢桿菌79-14和05-1506后，煙草根際土壤中煙草疫霉菌的孢子數(shù)降低了2個數(shù)量級，改變了煙草根際土壤細菌和真菌的優(yōu)勢種群比例，提高了煙草根際土壤真菌群落物種多樣性和豐富度，但煙草根際土壤細菌多樣性和豐富度有小幅度降低，猜測原因可能是采樣不充分，本研究只采集了施入生防菌后30 d的土樣。有研究表明，多粘類芽孢桿菌在施藥后一段時間內(nèi)對細菌微生物群落影響較小，但隨時間的增加，多粘類芽孢桿菌對細菌微生物群落開始產(chǎn)生影響，物種的豐富度及多樣性開始增加；多粘類芽孢桿菌藥劑對真菌群落的影響較為迅速，但持效期較短[28]。為了更好地研究生防菌對根際土壤細菌群落的影響，應該大量采集施入生防菌后不同時期的土樣。

4 結(jié) 論

分離出120份土壤細菌，篩選到抗煙草黑脛病效果較好的芽孢桿菌79-14 和05-1506，且防治效果分別為 64%和76%。它們有效降低了土壤中煙草疫霉菌的數(shù)量，均比對照約降低了2個數(shù)量級，且改變了煙草根際土壤細菌和真菌的優(yōu)勢種群比例，提高了煙草根際土壤真菌的多樣性和豐富度，但煙草根際土壤細菌多樣性和豐富度有小幅度降低，它們對煙草黑脛病的防控具有重要的應用價值。