濮永瑜，包玲鳳，楊佩文，沈廣材，張 慶，尹興盛，施竹鳳，裴衛(wèi)華，劉月靜，楊光偉，楊明英

(1.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205；3.云南省煙草公司文山州公司，云南 文山 663000)

【研究意義】施肥作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中維持土壤肥力、提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要農(nóng)藝措施，可通過(guò)改變土壤理化性質(zhì)、生物學(xué)活性和土壤環(huán)境，塑造土壤微生物群落，影響作物生長(zhǎng)發(fā)育[1]。然而現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在化肥過(guò)量施用和施肥模式不合理等現(xiàn)象，給土壤養(yǎng)分、耕地質(zhì)量和微生物群落結(jié)構(gòu)帶來(lái)巨大壓力[2]。為了緩解化肥長(zhǎng)期施用造成的負(fù)面影響，通常采用添加有機(jī)肥來(lái)改善耕地質(zhì)量，有機(jī)肥釋放的養(yǎng)分具有穩(wěn)定持久的優(yōu)點(diǎn)，更利于作物生長(zhǎng)[3]。有研究表明，向耕地中添加有機(jī)肥替代部分化學(xué)肥料在農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)中具有巨大潛力[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤理化性質(zhì)、養(yǎng)分含量和酶活性是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，有機(jī)肥的添加可改善土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分含量，提高土壤酶活性[5-6]。土壤微生物是土壤中最為活躍的部分，是衡量土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，直接或間接作用于土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和物質(zhì)循環(huán)，對(duì)維持土壤生產(chǎn)力和健康起重要作用，參與了土壤質(zhì)量演替的全過(guò)程[7-8]。有機(jī)無(wú)機(jī)配施的施肥模式不僅可以快速提升土壤肥力，改善作物品質(zhì)，還可以緩解長(zhǎng)期單施化肥導(dǎo)致土壤生態(tài)環(huán)境惡化這一問(wèn)題[9]。添加不同有機(jī)肥土壤理化性質(zhì)、酶活性、微生物多樣性和群落組成存在顯著差異。桑文等[10]研究發(fā)現(xiàn)，化肥減量10%配施液體有機(jī)肥可顯著提高番茄土壤肥力、改善微生物群落結(jié)構(gòu)，營(yíng)造一個(gè)良好的土壤微生態(tài)環(huán)境。王鵬等[11]研究表明，有機(jī)肥施用可有效提升山東煙區(qū)棕壤有機(jī)碳含量和酶活性。李銀科等[12]研究發(fā)現(xiàn)，施用牛糞的高粱土壤微生物量、酶活性和土壤微生物豐度顯著增加。因此，闡明生物有機(jī)肥輸入后土壤理化性質(zhì)和微生物群落組成差異，對(duì)于優(yōu)化烤煙栽培具有參考價(jià)值。【本研究切入點(diǎn)】近年來(lái)，關(guān)于生物有機(jī)肥對(duì)土壤理化性質(zhì)的報(bào)道較多，但對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，特別是對(duì)細(xì)菌和真菌類群的功能研究相對(duì)較少。為此，本研究設(shè)置植煙土壤耕作前、深耕后以及深耕單施化肥、深耕配施有機(jī)肥和深耕配施生物有機(jī)肥等處理，分析測(cè)試土壤主要理化性質(zhì)、酶活性和微生物種群結(jié)構(gòu)組成?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】解析土壤主要理化性質(zhì)和酶活性與微生物種群豐度間的關(guān)系，揭示深耕配施生物有機(jī)肥模式下植煙土壤微生物群落構(gòu)建機(jī)制，為完善保山地區(qū)煙草產(chǎn)業(yè)高效合理施肥和農(nóng)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置在云南省保山市西邑鄉(xiāng)王寨村，99°18′15″E，24°58′34″N，海拔1620 m，年均溫17.2 ℃，年均降雨量969 mm，土壤類型為黃壤，試驗(yàn)地作物種植模式為烤煙—蠶豆輪作。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理：植煙土壤耕作前(處理BP)、植煙土壤深耕后(處理PA)，深耕+化肥(處理CK)、深耕+化肥+有機(jī)肥(500 kg/hm2)(處理CN)、深耕+化肥+生物有機(jī)肥(4000 kg/hm2)(處理CS)，每個(gè)處理3次重復(fù)。化肥∶復(fù)合肥(8∶16∶26)900 kg/hm2+氮鉀肥300 kg/hm2；有機(jī)肥：農(nóng)家肥發(fā)酵而成；生物有機(jī)肥：以菌渣、中藥渣和草炭為原料，經(jīng)充分腐熟發(fā)酵后，添加微生物菌劑經(jīng)二次發(fā)酵即得，其中，N 質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.82 g/kg，P2O533.78 g/kg，K2O 29.26 g/kg，ω(C)/ω(N)為20.97，多粘芽孢桿菌有效活菌數(shù) ≥ 2.0 億/g。全部的有機(jī)肥和生物有機(jī)肥作為基肥(環(huán)狀塘肥)施用，其它主要栽培技術(shù)參照當(dāng)?shù)乜緹煒?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)方案執(zhí)行，烤煙品種云煙系列(云煙105)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤樣品采集 2020年10月烤煙收獲期按照常規(guī)取樣法取樣。五點(diǎn)取樣法取10～20 cm烤煙根際土，將5個(gè)點(diǎn)的土樣混合為一個(gè)樣本，挑出根系雜質(zhì)，冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室分為2份，1份過(guò)60目篩-80 ℃冷凍干燥，用于DNA提??；1份自然風(fēng)干室溫儲(chǔ)藏，用于理化性質(zhì)和酶活測(cè)定。

1.2.2 土壤理化指標(biāo)測(cè)定 土壤容重(Bulk density，BD)：環(huán)刀法；土壤pH：pH 儀測(cè)定；有機(jī)質(zhì)(Organic matter，OM)含量：重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定；全氮(Total nitrogen，TN)含量：凱氏定氮法測(cè)定；堿解氮(Alkaline-ydrolyzed nitrogen，AN)含量：堿解擴(kuò)散法測(cè)定；全磷(Total phosphorus，TP)含量：氫氧化鈉熔融—鉬銻比色法測(cè)定；速效磷(Available phosphorus，AP)含量：碳酸氫鈉提取法測(cè)定；全鉀(Total potassium，TK)含量：氫氧化鈉熔融—火焰光度法測(cè)定；速效鉀(Available potassium，AK)含量：鹽酸浸提-AAS法測(cè)定。土壤蔗糖酶(Invertase，INV)和脲酶(Urease，URE)活性采用試劑盒(蘇州瑞思公司生物科技有限公司)微板法測(cè)定，測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 土壤微生物高通量測(cè)序 采用OMEGA試劑盒提取土壤微生物總DNA，提取方法參照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的DNA 溶液經(jīng)NanoDrop ND-2000 分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取DNA 的質(zhì)量、濃度和片段長(zhǎng)度。土壤樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq測(cè)序，引物對(duì)應(yīng)區(qū)域：16S V3～V4區(qū)[338F/806R(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’/5’-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3’)]；真菌ITS擴(kuò)增引物序列為[ITS1F/ITS2R(5’-GGAAGTAAAAGT CGTAACAAG G-3’/5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)]。采用Qiime 2(v2020.2)分析流程進(jìn)行序列去噪或ASV(Amplicon sequence variants)聚類，Bayes分類器進(jìn)行物種注釋，對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)為silva138/16s-bacteria和unite8.0/its-fungi，根據(jù)ASV在不同樣本中的分布，評(píng)估每個(gè)樣本的Alpha多樣性水平。計(jì)算各樣本的距離矩陣，衡量不同處理間的Beta多樣性。根據(jù)16S rRNA測(cè)序結(jié)果，對(duì)土壤細(xì)菌進(jìn)行BugBase表型預(yù)測(cè)，采用FUNGuild v1.0對(duì)土壤真菌進(jìn)行FUNGuild功能預(yù)測(cè)，找出處理間的差異。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)上海美吉生物云平臺(tái)進(jìn)行PCoA分析、RDA分析，采用Excel 2010、SPSS 20、SigmaPlot 12.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、方差分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)肥對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可知，與處理PB相比，處理PA、CK、CN、CS土壤容重顯著降低(P<0.05，下同)，處理CK、CN、CS的pH、全鉀含量顯著降低，處理PA有機(jī)質(zhì)、全磷、速效磷含量顯著降低，處理CK、CN、CS有機(jī)質(zhì)、全磷、速效磷和速效鉀含量顯著提升。與處理CK相比，處理CN土壤pH、速效鉀降低；處理CS土壤pH、速效鉀含量顯著降低，有機(jī)質(zhì)、全磷、速效磷含量顯著增加。

表1 植煙土壤主要理化性質(zhì)

2.2 土壤酶活性變化特征

從圖1可見(jiàn)，蔗糖酶活性為45.36～64.81 d/(mg·g)，脲酶活性為0.39～2.06 d/(mg·g)。與處理PB相比，處理CN、CS蔗糖酶顯著提升，處理PA、CK、CN、CS脲酶顯著提升。與處理CK相比，處理CN、CS蔗糖酶和脲酶活性顯著增加。

圖1 不同處理植煙土壤酶活性分析

2.3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征

2.3.1 微生物群落Alpha多樣性分析 土壤細(xì)菌16S rRNA、真菌ITS1基因高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，分別得到Clean tags條數(shù)為205 725、630 030，基于≥97%的相似度水平，通過(guò)ASV劃分和分類地位鑒定，去重后得到ASV總數(shù)為4251、3764。與處理PB相比，處理PA細(xì)菌、真菌Chao1指數(shù)顯著降低，真菌Shannon指數(shù)顯著降低，細(xì)菌Shannon指數(shù)無(wú)顯著變化；處理CK真菌Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)降低，處理CN、CS真菌Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著增加。與處理CK相比，處理CN、CS細(xì)菌Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)無(wú)顯著變化，真菌Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著提高(表2)。

表2 不同處理植煙土壤微生物Alpha多樣性分析

2.3.2 微生物群落Beta多樣性分析 基于ASV分類學(xué)水平的PCoA分析，采用bray-curtis距離算法，細(xì)菌(圖2-a)群落和真菌(圖2-b)群落的PCoA第一坐標(biāo)貢獻(xiàn)度分別為22.80%、38.46%。處理CK、CN、CS土壤細(xì)菌和真菌群落距離處理PB、PA均較遠(yuǎn)，即細(xì)菌和真菌物種組成有一定的差異性。處理CN、CS細(xì)菌、真菌群落與處理CK相似，表明深耕配施有機(jī)肥和生物有機(jī)肥細(xì)菌、真菌群落組成基本相似。真菌群落R值>細(xì)菌群落，表明不同施肥處理對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)組成差異性的影響更為顯著。

圖2 不同處理植煙土壤中細(xì)菌(a)/真菌(b)ASV組成的主成分分析

2.3.3 微生物物種Venn圖分析 不同樣本中16S rRNA(圖3-a)和ITS(圖3-b)的ASV分析結(jié)果顯示，與處理PB相比，處理PA細(xì)菌獨(dú)有ASV數(shù)目增加，真菌ASV數(shù)目減少；處理CK細(xì)菌和真菌ASV數(shù)目均減少；處理CN細(xì)菌ASV數(shù)目減少，真菌ASV數(shù)目增加；處理CS細(xì)菌和真菌ASV數(shù)目均增加。與處理CK相比，處理CN、CS細(xì)菌和真菌獨(dú)有ASV數(shù)目均增加。

圖3 基于ASV分類水平植煙土壤中細(xì)菌(a)/真菌(b)Veen分析

2.3.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析 由圖4-a可以看出，所有樣本在門(mén)水平上的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為放線菌門(mén)Actinobacteria(29.94%～37.33%)、變形菌門(mén)Proteobacteria(14.07%～28.13%)、綠彎菌門(mén)Chloroflexi(14.20%～21.92%)、酸桿菌門(mén)Acidobacteria(9.44%～16.23%)，占總豐度和的83.26%～86.78%。其中，與處理CK相比，處理CN Acidobacteri和Actinobacteria豐度無(wú)顯著變化，Proteobacteria豐度顯著增加，Chloroflexi豐度顯著降低；處理CS Acidobacteria豐度顯著增加，Chloroflexi、Actinobacteria豐度顯著降低，Proteobacteria豐度無(wú)顯著變化。由圖4-b可知，所有樣本在門(mén)水平上的真菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為子囊菌門(mén)Ascomycota(58.05%～78.81%)、擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota(3.51%～19.08%)、被孢霉門(mén)Mortierellomycota(0.97%～13.44%)，占總豐度84.79%～93.60%。與處理CK相比，處理CN Basidiomycota豐度降低，Mortierellomycota豐度顯著增加；處理CS Ascomycota豐度增加，Basidiomycota和Mortierellomycota豐度顯著降低。

圖4 基于門(mén)分類水平植煙土壤細(xì)菌(a)和真菌(b)群落組成

2.3.5 屬水平上LEfSe物種差異分析 基于LEfSe分析，查找各處理在細(xì)菌屬分類學(xué)水平上具有顯著性差異的土壤微生物物種，結(jié)果見(jiàn)圖5-a。處理PB、CN、CS分別有4、9、11個(gè)屬的細(xì)菌種群存在顯著性差異，處理PA和CK屬的細(xì)菌種群則不存在差異顯著性。真菌LEfSe分析見(jiàn)圖5-b，處理PB、PA、CK、CN和CS分別有23、11、10、16、10個(gè)屬的真菌種群存在顯著性差異。

圖5 基于屬分類水平植煙土壤細(xì)菌(a)和真菌(b)LEfSe分析

2.4 土壤微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性

細(xì)菌、真菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)與土壤理化性狀相關(guān)性分析(圖6)結(jié)果表明，Actinobacteria相對(duì)豐度與URE呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；Proteobacteria與TP、AP、INV、URE呈極顯著正相關(guān)，與pH、TK呈極顯著負(fù)相關(guān)，與OM呈顯著正相關(guān)(P<0.05，下同)；Chloroflexi與TP呈極顯著負(fù)相關(guān)，與TK呈顯著正相關(guān)，與INV呈顯著負(fù)相關(guān)。Ascomycota與TK呈極顯著正相關(guān)，與INV、URE呈極顯著負(fù)相關(guān)，與AP、AK呈顯著負(fù)相關(guān)；Basidiomycota與TP呈顯著負(fù)相關(guān)；Mortierellomycota與pH、TK呈極顯著負(fù)相關(guān)，與AP、AK、INV、URE呈極顯著正相關(guān)，與TP呈顯著正相關(guān)。由圖7-a可知，pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、有效磷、土壤容重、蔗糖酶和脲酶顯著影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，其中土壤容重影響最為顯著。由圖7-b可知，pH、有效磷顯著影響真菌群落結(jié)構(gòu)組成，其中pH影響最為顯著。

X軸和Y軸分別為環(huán)境因子和物種，通過(guò)計(jì)算獲得R值和P值。R值在圖中以不同顏色展示，P值若小于0.05則用 * 號(hào)標(biāo)出，右側(cè)圖例是不同R值的顏色區(qū)間。P值若小于0.05則用 * 號(hào)標(biāo)出，* 代表0.01 < P ≤ 0.05，**代表0.001 < P ≤ 0.01，***代表P ≤ 0.001

圖7 土壤環(huán)境因子與不同處理土壤細(xì)菌(a)/真菌(b)群落結(jié)構(gòu)的冗余分析

2.5 BugBase表型預(yù)測(cè)

通過(guò)BugBase表型預(yù)測(cè)出個(gè)樣本中土壤細(xì)菌的9種潛在類型為：好氧(Aerobic)、厭氧(Anaerobic)、移動(dòng)元件(Mobile Element Containing)、兼性厭氧(Anaerobic Facultatively)、生物膜形成(Biofilm Forming)、革蘭氏陰性(Gram Negative)、革蘭氏陽(yáng)性(Gram Positive)、致病性(Pathogenic)、氧化脅迫耐受(Oxidative Stress Tolerant)。各樣本中均以好氧菌、含可移動(dòng)元件菌、革蘭氏陰性菌、致病性菌和氧化脅迫耐受菌為主。與處理PB相比，處理PA、CK、CN厭氧菌、革蘭氏陰性菌和氧化脅迫耐受菌豐度降低，致病性菌豐度增加；處理CS好氧、含可移動(dòng)元件、致病性和氧化脅迫耐受菌豐度顯著增加，革蘭氏陰性菌豐度降低。與處理CK相比，處理CN好氧和致病性菌豐度增加，處理CS好氧菌、含可移動(dòng)元件菌和氧化脅迫耐受菌豐度增加。

圖8 BugBase表型預(yù)測(cè)

2.6 FUNGuild功能預(yù)測(cè)結(jié)果

根據(jù)FUNGuild功能預(yù)測(cè)分析(圖9-a)結(jié)果，真菌群落營(yíng)養(yǎng)類型可分為9類，病理營(yíng)養(yǎng)型(Pathotroph)、腐生營(yíng)養(yǎng)型(Saprotroph)、共生營(yíng)養(yǎng)型(Symbiotroph)、病理—腐生營(yíng)養(yǎng)型(Pathotroph-Saprotroph)、病理—共生營(yíng)養(yǎng)型(Pathotroph-Symbiotroph)、腐生—共生營(yíng)養(yǎng)型(Saprotroph-Symbiotroph)、病理—腐生—共生營(yíng)養(yǎng)型(Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph)、腐生—病理—共生營(yíng)養(yǎng)型(Saprotroph-Pathotroph-Symbiotroph)和病原菌—腐生—共生營(yíng)養(yǎng)型(Pathogen-Saprotroph-Symbiotroph)。處理PB以腐生營(yíng)養(yǎng)型(36.38%)和病理—腐生—共生營(yíng)養(yǎng)型(21.77%)為主，處理PA以病理營(yíng)養(yǎng)型(27.13%)、腐生營(yíng)養(yǎng)型(23.10%)和病理—腐生—共生營(yíng)養(yǎng)型(25.51%)為主，處理CK以腐生營(yíng)養(yǎng)型(44.09%)和病理—腐生—共生營(yíng)養(yǎng)型(30.87%)為主，處理CN、CS均以腐生營(yíng)養(yǎng)型(63.01%、44.62%)為主。

圖9 FUNGuild功能預(yù)測(cè)

通過(guò)功能類群鑒定，檢測(cè)出81種功能群，針對(duì)其中9種功能群進(jìn)行分析(圖9-b)，病理營(yíng)養(yǎng)型主要功能群為動(dòng)物病原菌(Animal Pathogen)、真菌寄生菌(Fungal Parasite)和植物病原菌(Plant Pathogen)；腐生營(yíng)養(yǎng)型主要有木質(zhì)腐生菌(Wood Saprotroph)、糞腐生菌(Dung Saprotroph)、葉子腐生菌(Leaf Saprotroph)和未定義腐生菌(Undefined Saprotroph)；共生營(yíng)養(yǎng)型主要為叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal)和外生菌根真菌(Ectomycorrhizal)。各樣本均以植物病原菌和未定義腐生菌為主，與處理PB相比，處理PA和CK植物病原菌豐度顯著增加，未定義腐生菌豐度下降；處理CN、CS植物病原菌和未定義腐生菌呈下降趨勢(shì)。與處理CK相比，處理CN、CS植物病原豐度降低，未定義腐生菌豐度增加。

3 討 論

3.1 深耕配生物有機(jī)肥對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

深耕配施生物有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性和種群豐度影響不同。大量研究表明，長(zhǎng)期單施化學(xué)肥料會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌、真菌豐富度和多樣性降低，配施有機(jī)肥或單施有機(jī)肥可提高土壤細(xì)菌、真菌的豐富度和多樣性[13-15]。本試驗(yàn)中，相較于處理CK，處理CN、CS植煙土壤細(xì)菌豐度和真菌豐度顯著增加，其中細(xì)菌多樣性無(wú)顯著變化，真菌豐度顯著增加。有研究表明，土壤微生物種群間存在著一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，某一種群的快速生長(zhǎng)必然會(huì)因競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、空間和生態(tài)位點(diǎn)，對(duì)其他種群的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用[16]。本研究中，相較于處理PB、PA，處理CN、CS土壤細(xì)菌豐度和多樣性顯著降低，真菌種群豐度和多樣性顯著增加，說(shuō)明生物有機(jī)肥的投入對(duì)土壤真菌生長(zhǎng)繁殖起了促進(jìn)作用，可能是生物有機(jī)肥增加了適宜真菌生存的空間和增強(qiáng)了真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制了細(xì)菌的數(shù)量；也可能是適宜細(xì)菌生存的pH為中性或微堿性，適宜真菌生長(zhǎng)的pH為弱酸性或酸性，施用生物有機(jī)肥后土壤pH降低，促進(jìn)真菌數(shù)量的增加[17]。土壤真菌/細(xì)菌(F/B)數(shù)量比可反映土壤肥力和健康狀況，有研究指出F/B值較高時(shí)微生物對(duì)周?chē)h(huán)境響應(yīng)積極，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)具有較高的可持續(xù)性[18]。張明等[19]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥較單施化肥處理顯著促進(jìn)細(xì)菌、真菌生長(zhǎng)和F/B，本研究結(jié)果與之相一致。

大量施肥方式的研究表明，各類土壤樣本細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要包括Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria等，且總相對(duì)豐度占細(xì)菌群落的70%以上[20-21]；與細(xì)菌群落一樣，有機(jī)無(wú)機(jī)配施土壤中真菌門(mén)子囊菌門(mén)(Ascomycota)占主導(dǎo)地位[22-23]，本研究也得出相似結(jié)論。土壤微生物種群組成結(jié)果表明，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Acidobacteria、Proteobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria，真菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Ascomycota、Basidiomycota、Mortierellomycota，各處理優(yōu)勢(shì)菌門(mén)組成基本相似，相對(duì)豐度差異性達(dá)到顯著性水平。與處理CK相比，處理CN Proteobacteria、Mortierellomycota豐度增加，Chloroflexi、Basidiomycota豐度降低；處理CS Acidobacteria、Ascomycota相對(duì)豐度增加，Chloroflexi、Actinobacteria、Basidiomycota、Mortierellomycota豐度降低。進(jìn)一步查找各處理間在屬水平上具有顯著性差異的物種，基于LEfSe分析結(jié)果表明單施化肥導(dǎo)致細(xì)菌和真菌差異性物種數(shù)減少，種群多樣性呈降低趨勢(shì)，而增施有機(jī)肥和生物有機(jī)肥可提高細(xì)菌和真菌差異物種數(shù)。

3.2 土壤環(huán)境因子與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的耦合關(guān)系

土壤環(huán)境因子與土壤微生物是相互作用、相輔相成的，共同影響耕地生產(chǎn)力和作物生長(zhǎng)。一方面，施肥可通過(guò)改變土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分含量，間接引起微生物生長(zhǎng)、代謝過(guò)程和群落組成發(fā)生變化，同時(shí)土壤養(yǎng)分作為土壤酶的代謝底物，其含量變化也影響土壤酶的活性；另一方面，土壤微生物會(huì)參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，其活性和組成的改變也導(dǎo)致自身代謝、死亡和沉積等改變，進(jìn)而改變土壤理化特征[24]。本研究中添加有機(jī)肥和生物有機(jī)肥后，土壤pH由弱堿性向中性轉(zhuǎn)化，原因可能是有機(jī)肥中有機(jī)物質(zhì)在分解過(guò)程中產(chǎn)生的腐殖酸是包含有多種酸性功能團(tuán)的弱酸，可增強(qiáng)土壤的酸堿緩沖能力，達(dá)到緩沖土壤pH的效果[25]。通過(guò)對(duì)環(huán)境因子和微生物種群間的Spearman相關(guān)性分析和冗余分析，結(jié)果表明不同的環(huán)境因子對(duì)微生物種群豐度和群落組成的影響不同，總體上來(lái)看，pH和有效磷對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的影響較為顯著。

3.3 深耕配施生物有機(jī)肥對(duì)土壤微生物功能類群的影響

本研究通過(guò)BugBase表型預(yù)測(cè)來(lái)揭示細(xì)菌功能性狀對(duì)不同施肥模式的響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)配施生物有機(jī)肥處理好氧細(xì)菌豐度顯著增加，相反厭氧菌的豐度下降。酸桿菌門(mén)宜在厭氧和微氧、pH低的環(huán)境中生存[26]，配施生物有機(jī)肥后pH、酸桿菌豐度下降，土壤厭氧細(xì)菌豐度變化趨勢(shì)一致。研究發(fā)現(xiàn)配施生物有機(jī)肥后可移動(dòng)元件含量、細(xì)菌的生物膜形成、兼性厭氧菌和氧化脅迫耐受菌豐度增加，原因可能是這些功能類群涉及較多部分的是變形菌門(mén)一類，變形菌門(mén)大多是兼性或?qū)Ｐ詤捬蹙?，大多?shù)外膜由脂多糖組成，同時(shí)放線菌門(mén)和變形菌門(mén)具有較高的生態(tài)位偏好[27]，而本研究中放線菌門(mén)和變形菌門(mén)配施生物有機(jī)肥后豐度呈上升趨勢(shì)。FUNGuild功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明，配施生物有機(jī)肥后真菌群落的營(yíng)養(yǎng)類型主要是腐生營(yíng)養(yǎng)型，群落功能主要是植物病原菌和未定義腐生菌。其中，營(yíng)養(yǎng)類型中腐生營(yíng)養(yǎng)型和病理營(yíng)養(yǎng)型豐度呈上升趨勢(shì)，糞腐生菌和未定義腐生菌豐度增加，說(shuō)明向植煙土壤中添加生物有機(jī)肥增強(qiáng)了土壤真菌的分解能力；群落功能中植物病原菌豐度降低，說(shuō)明向植煙土壤中添加生物有機(jī)肥降低了煙草的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，從而減少經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié) 論

深耕配施生物有機(jī)肥顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)、全磷和速效磷含量以及蔗糖酶和脲酶活性，顯著降低土壤pH；顯著提高真菌Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，并顯著促進(jìn)細(xì)菌和真菌群落差異性增強(qiáng)，而且對(duì)其群落結(jié)構(gòu)組成差異性的影響更為顯著；顯著提高了放線菌門(mén)(Acidobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和子囊菌門(mén)(Ascomycota)的種群豐度，降低了綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Actinobacteria)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)和被孢霉門(mén)(Mortierellomycota)的種群豐度，導(dǎo)致屬水平的細(xì)菌和真菌顯著差異性物種增加。深耕配施生物有機(jī)肥顯著影響土壤微生物功能類群，其中致病性細(xì)菌和植物病原真菌豐度顯著下降。影響土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的主要理化因子分別是土壤容重和pH?？傊?，深耕配施生物有機(jī)肥可通過(guò)降低土壤容重和pH，增加植煙土壤養(yǎng)分含量，提高土壤生物活性，促進(jìn)土壤微生物功能多樣性形成，是堿性植煙土壤質(zhì)量提升的有效措施。