佐長賡, 王靜怡, 牛新湘, 劉 萍, 管力慧, 黨文芳, 楊紅梅, 楚 敏, 王 寧, 林 青, 王有武, 婁 愷, 史應武,6

(1.新疆大學生命科學與技術學院,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所,烏魯木齊 830091;3.新疆特殊環(huán)境微生物實驗室,烏魯木齊 830091;4.新疆農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所,烏魯木齊 830091;5.塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300;6.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北綠洲農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室,烏魯木齊 830091)

【研究意義】中國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國和消費國，年產(chǎn)量約591萬t，新疆是我國最大的產(chǎn)棉區(qū)，其產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的85%以上[1]。由于新疆棉花的連年輪作，棉花黃萎病也日趨加重，極大影響了棉花的產(chǎn)量和品質，造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。目前，抗病品種研發(fā)尚處于初級階段，生物防治已成為重要的防治方法之一，很多微生物被證明有生防效果[3-5]。植物誘導抗性是生物防治的途徑之一，誘導系統(tǒng)抗性(ISR)是指植物根和根際微生物之間的相互作用引發(fā)植物防御系統(tǒng)，形成許多新的化學物質，對抗疾病病原體，如細菌、真菌和病毒[7]。【前人研究進展】誘導抗性是植物進行自我保護的重要方法。大量研究表明，內生菌及根際細菌可以定殖在植物根際或體內[8]，抑制植物病原菌，還能發(fā)揮誘導抗性提高植物抗病能力[9]，促進植物生長，增加作物產(chǎn)量[10]。周東興等[11]報道在生防細菌作用下，番茄中酶活顯著提高，有效防治番茄枯萎病。楊亞茹等[12]報道內生菌可促進幼苗生長，提高植物抗氧化能力，提高辣椒產(chǎn)量。趙沛等[13]評價了棉花內生真菌對棉花黃萎病的防效效果，菌株CEF-373成功激活了相關防御酶活和病程相關蛋白基因PR10的表達，表明棉花內生真菌CEF-373菌株有較好的生物防治應用前景。【本研究切入點】本課題組前期從棉花中篩選出4株對棉花黃萎病具有防治效果的內生菌和根際細菌[14]，研究發(fā)現(xiàn)，4株菌在棉花體內的定殖數(shù)量先上升，第50天時趨于穩(wěn)定。因此，本研究選取第50天棉花為研究對象，通過測定第50天棉花株高、根長、根毛數(shù)、葉片數(shù)和棉花葉片中相關防御酶活，分析內生菌及根際細菌對棉花的促生作用和誘導抗病作用?！緮M解決的關鍵問題】本文為內生菌及根際細菌提高植物抗逆性，促進植物生長提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株及棉花品種 供試病原菌為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)，由新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所劉海洋副研究員饋贈[15]。供試內生菌及根際細菌BacillusvelezensisBHZ-29、B.atrophaeusSHZ-24菌株篩選自博樂、石河子棉株體內；B.subtilisSHT-15、B.vanilleaSMT-24 分離自石河子棉株根際土壤[16]。棉花品種新陸早36號，種子由中國農(nóng)業(yè)科學院石河子棉花研究所尤崇志副研究員饋贈。

1.1.2 土壤樣品的采集和處理 于烏魯木齊安寧渠、博樂、石河子、庫爾勒、圖木舒克實驗地采集棉株根際10～15 cm土壤，土樣在室內經(jīng)自然晾干后，用直徑2 mm的篩網(wǎng)過篩、混勻，裝入密封袋中保存在 4 ℃冰箱中備用[17]。

1.1.3 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，牛肉粉 3.0 g，氯化鈉 5.0 g，瓊脂 15.0 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.3。NB培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 5.0 g，氯化鈉 5.0 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.2。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水 1000 mL，pH自然。Czapek’s培養(yǎng)基：NaNO33.00 g，K2HPO31.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，KCl 0.50 g，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.01 g，蔗糖 30.00 g，蒸餾水 1000 mL，pH 6.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 內生菌及根際細菌種子液及大麗輪枝菌發(fā)酵液制備 挑取內生菌及根際細菌單菌落接種于50 mL NB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d后作為種子液，將種子液以3 %的量接入到200 mL NB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d即得到內生菌及根際細菌發(fā)酵液。用直接6 mm打孔器取大麗輪枝菌菌餅倒貼于PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)15 d，再用打孔器取直徑6 mm的菌餅，接種于200 mL察比克培養(yǎng)基中，每瓶10個菌餅，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d即為大麗輪枝菌發(fā)酵液[18]。

1.2.2 內生菌及根際細菌對棉花的促生作用 分別將滅菌土和非滅菌土裝至長8 cm、寬6 cm的營養(yǎng)缽中，每缽種植8粒顆粒飽滿的棉種，覆土后撫平表層土壤，放入智能培養(yǎng)箱出苗，晝/夜光照與溫度分別為：13 h/11 h，26 ℃/24 ℃，光照強度：60 klx，相對濕度：60%。內生菌及根際細菌發(fā)酵液分3次灌溉。播種后18 d左右棉苗一片真葉初現(xiàn)時將SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株發(fā)酵液均以10 mL/缽(108CFU/mL)均勻澆灌棉苗，對照接種等體積滅菌NB培養(yǎng)基，繼續(xù)放置智能培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7 d后接種大麗輪枝菌，大麗輪枝菌的接種方法：將營養(yǎng)缽中棉花須根在花盤中磨損后浸泡在大麗輪枝菌發(fā)酵液中，接種量以10 mL/缽(107CFU/mL)計算。接種大麗輪枝菌5 d后，第二次接種內生菌及根際微生物發(fā)酵液10 mL/缽(108CFU/mL)。10 d后第3次接種內生菌及根際微生物發(fā)酵液10 mL/缽(108CFU/mL)。棉苗50 d時，將棉苗拔出后沖洗干凈，統(tǒng)計所有棉株的株高、根毛數(shù)、葉片數(shù)、根長。

1.2.3 防御酶活性、丙二醛和木質素含量的測定 分別稱取0.1 g葉片組織用于提取粗酶，酶活均按照酶活性試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)步驟操作，利用紫外—可見光分光光度計檢測防御酶活性(POD、PPO、CAT、SOD、PAL酶活，丙二醛和木質素含量)變化[19]。

2 結果與分析

2.1 內生菌及根際細菌對棉花的促生作用

經(jīng)過SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株發(fā)酵液處理的滅菌土壤與非滅菌土壤的棉株株高、葉片數(shù)、根長、根毛數(shù)與對照組相比，均有不同程度的提高，同時，滅菌土中經(jīng)4種菌株發(fā)酵液處理后的株高顯著高于對照(圖1)。滅菌土與非滅菌土相比，同一處理非滅菌土中的根長、根毛數(shù)、葉片數(shù)均高于滅菌土，SHZ-24和BHZ-29處理后滅菌土株高高于非滅菌土，而SMT-24與SHT-15處理后非滅菌土株高高于滅菌土。

圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準差，柱上不同小寫字母表示經(jīng)Duncan’s新復極差法檢驗在P<0.05水平差異顯著。SS-滅菌土壤；NS-非滅菌土壤，下同

2.2 內生及根際細菌對棉花防御酶活性的影響

2.2.1 內生菌及根際細菌對過氧化氫酶(CAT)的影響 在滅菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株發(fā)酵液處理后CAT酶活均高于對照組，分別是對照處理的1.99、1.52、1.93和1.52倍。SHZ-24處理的CAT酶活性最高，達到83.23 μmol/(min·g)。非滅菌土壤中，SMT-24處理CAT酶活是對照處理的1.74倍，SHT-15處理CAT酶活性與對照組相當，SHZ-24、BHZ-29 菌株發(fā)酵液處理CAT酶活低于對照組，分別是對照處理的89.19%和28.09%(圖2-A)。

2.2.2 內生菌及根際細菌對多酚氧化酶(PPO)的影響 在滅菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15菌株發(fā)酵液處理后PPO酶活均顯著高于CK對照組，分別是對照處理的2.84、1.45和2.82倍，BHZ-29菌株發(fā)酵液處理后PPO酶活是對照處理的1.08倍，SMT-24處理的PPO酶活性最高，達到108.94 U/g FW；非滅菌土壤中，SHZ-15處理后CAT酶活比對照組低，是對照處理的94.51%，其他3種菌發(fā)酵液處理均高于CK對照組，分別是對照處理的1.13、1.04、1.11倍(圖2-B)。

2.2.3 內生菌及根際細菌對超氧化物歧化酶(SOD)的影響 在滅菌土壤和非滅菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株發(fā)酵液處理后SOD酶活均高于CK對照組，滅菌土中分別是對照處理的1.37、1.43、1.27和4.25倍，BHZ-29處理的SOD酶活性最高，達到430.59 U/g FW(圖2-C)；非滅菌土中處理組SOD酶活分別是對照處理的3.19、6.47、4.81、1.75倍，SMT-24處理的SOD酶活性最高，達到456.93 U/g FW。

2.2.4 內生菌及根際細菌對過氧化物酶(POD)的影響 在滅菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株發(fā)酵液處理后POD酶活顯著高于CK對照組，分別是對照處理的4.96、5.34、6.67和5.18倍，SHT-15處理的POD酶活性最高，達到2849.87 U/g FW；非滅菌土壤中，SHZ-24、SHT-15、BHZ-29處理后POD酶活顯著高于對照組，分別是對照處理的8.18、10.57和6.92倍，SMT-24菌株發(fā)酵液處理后POD酶活是對照處理的2.95倍(圖2-D)。

2.2.5 內生菌及根際細菌對苯丙氨酸解氨酶(PAL)的影響 在滅菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株發(fā)酵液處理后PAL酶活顯著高于CK對照組，分別是對照處理的2.36、2.05、1.60、2.12倍，SHZ-24處理的PAL酶活性最高，達到59.17 U/g FW，非滅菌土壤中，SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株發(fā)酵液處理后PAL酶活均高于CK對照組，分別是對照處理的1.04、1.45和2.03倍，SHZ-24處理PAL酶活顯著低于CK對照組，是對照處理的84.92%，SHZ-24處理PAL酶活性最低，為23.40 U/g FW(圖2-E)。

圖2 內生菌與根際微生物接種后對棉花葉片CAT、PPO、SOD、POD、PAL活性的影響

2.3 內生菌及根際細菌對棉苗葉片丙二醛和木質素含量的影響

2.3.1 內生菌及根際微生物對丙二醛(MDA)含量的影響 在滅菌土壤中SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株發(fā)酵液處理后MDA含量低于CK對照組，分別是對照處理的75.78%、82.62%、94.13%和79.38%，SHZ-24處理MDA含量最低，為26.34 nmol/g FW；非滅菌土壤中，SMT-24、SHT-15、BHZ-29處理后MDA含量低于對照組，分別是對照處理的45.46%、71.94%、74.25%，SHZ-24處理后丙二醛含量高于對照組，是對照處理的1.19倍(圖3-A)。

2.3.2 內生菌及根際細菌對木質素含量的影響 在滅菌土壤中，SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株發(fā)酵液處理后，木質素含量顯著高于對照處理，分別是對照處理的1.04、1.18、1.05、1.07倍；非滅菌土壤中，除SHT-15菌液處理后木質素含量低于對照組，是對照處理的95.78%，其他處理均高于對照處理，分別是對照處理的1.15、1.62、1.05倍，SMT-24處理木質素含量最高，達到4.11 mg/g DW(圖3-B)。

圖3 內生菌與根際微生物接種后對棉花葉片丙二醛、木質素含量的影響

3 討 論

本研究結果表明，接種后50 d，內生菌及根際細菌發(fā)酵液處理能促進不同土壤中棉花生長，在滅菌土中，SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29菌株發(fā)酵液處理后顯著增加了棉花的株高，同時，經(jīng)過內生菌及根際細菌處理后，不同程度提高棉花防御相關酶活，減少MDA的積累，從而增強棉花植株對病害的抗性。

棉花植株本身就有一套完整的防御體系，生物或非生物的脅迫都可以刺激這種防御反應，因此，通常將防御酶活性變化作為衡量植株防御能力的重要指標[20]。CAT廣泛存在植物細胞中，維持細胞H2O2正常水平[21]，POD可減少活性氧積累，維護膜結構完整性[22]，SOD可清除自由基，延緩植物衰老，PAL可促進植物產(chǎn)生酚類化合物，從而達到抵御病害侵染的效果，增強植物抗病性。植物在逆境條件下通常利用產(chǎn)物MDA作為指標來表示植物對逆境條件反應的強弱，木質素在植物防御體系中可增加細胞壁韌性，提高植物抗病原菌侵入能力[23]。本研究中，在50 d時不同土壤中棉株防御相關酶活性和木質素含量均增加，MDA含量下降，表明4株菌能誘導棉株體內防御酶活性表達，增強棉花自身免疫。相較滅菌土和非滅菌土而言，棉株生物量變化在滅菌土壤中較非滅菌土壤變化趨勢平緩的原因經(jīng)推測可能是非滅菌土壤中環(huán)境較復雜，對所施內生菌和根際細菌的影響不穩(wěn)定，使發(fā)揮其活性存在很多不確定性。本研究中丙二醛含量最低值和木質素含量最高值均出現(xiàn)在非滅菌土壤中，可能是非滅菌土壤的微環(huán)境更適合根際細菌的生存[24-25]。

綜上所述，內生菌及根際細菌有較好的應用前景，在50 d時還能有效的促進棉花植株的生長，同時能誘導棉花植株防御酶活性的表達，提高棉花防御相關酶活，增強棉花植株的系統(tǒng)抗病性，有效預防棉花黃萎病的發(fā)生。內生菌及根際細菌是綠色、安全的生物防治方法，加大內生菌及根際細菌大田應用研究有助于生物防治在綠色食品種植中的推廣應用，進而保障農(nóng)產(chǎn)品質量安全及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

4 結 論

接種后50 d，SHZ-24、SMT-24、SHT-15、BHZ-29均可促進棉株生長，增加棉株株高、根長、葉片數(shù)、根毛數(shù)，同時也能提高棉花防御酶CAT、SOD、PAL、POD、PPO活性，增加棉株體內木質素含量，降低棉株丙二醛含量，減少對棉株的毒害作用，增強棉株抗病性。