梁敏，趙盼盼，王曉岑，李新，張楠，張西臣，李建華，宮鵬濤，張媛媛

1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.吉林大學(xué)人獸共患病研究所，吉林 長春 130062

十二指腸賈第蟲（Giardia duodenalis，簡稱賈第蟲）是一種重要的人獸共患寄生性原蟲，通過污染的食物或水經(jīng)口感染人及多種哺乳動(dòng)物導(dǎo)致賈第蟲?。?］，引發(fā)腹痛、腹瀉、消化不良等癥狀［2］。由于耐藥性、致畸、致突變等問題的存在［3］，至今尚無防治賈第蟲病的藥物。先天免疫是機(jī)體抵御病原入侵的重要屏障，研究賈第蟲與宿主先天免疫的關(guān)系，有利于尋找防治賈第蟲病的新型疫苗和藥物的作用靶點(diǎn)，為賈第蟲的防治提供新的思路。

硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）是一類調(diào)節(jié)活性氧代謝的氧化還原活性蛋白，在抗氧化系統(tǒng)、調(diào)控細(xì)胞激活與增殖、參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、維持蛋白功能活性位點(diǎn)狀態(tài)和細(xì)胞存活等方面發(fā)揮重要作用［4-6］。在HEK293 細(xì)胞內(nèi)，人TRX1 可抑制由腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）引起的核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）的活化［7］，且TRX1對c-Jun 氨基末端激酶信號通路（JNK signaling pathway，JNK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38MAPK）通路的激活與細(xì)胞類型有關(guān)［8-10］。在原蟲、吸蟲等研究中，TRX 作為機(jī)體TRX 系統(tǒng)的組成部分，在抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用［11-12］。賈第蟲編碼TRX 的基因，且TRX是賈第蟲胞外囊泡蛋白組分之一［13］，但關(guān)于賈第蟲硫氧還蛋白（Giardia duodenalis thioredoxin，GdTRX）對先天免疫調(diào)節(jié)的影響尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組賈第蟲硫氧還蛋白（rGdTRX），并對rGdTRX 調(diào)控小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（peritoneal macrophages，PMs）中先天免疫調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行研究，為GdTRX 免疫功能及其宿主抗賈第蟲免疫機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、質(zhì)粒及菌株 十二指腸賈第蟲WB 株、pET28a 空載體為吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室凍存并提供；大腸埃希菌感受態(tài)DH5α、BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型C57BL／6 小鼠，雌性，6 ～ 8周齡，體重15 ～ 18 g，購自遼寧長生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號：SCXK（遼）2020-0001。所有與動(dòng)物相關(guān)的實(shí)驗(yàn)均按照中華人民共和國動(dòng)物倫理程序和指南進(jìn)行。

1.3 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素購自以色列BI 公司；酵母提取物、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、葡萄糖、L-cysteine HCl、卡那霉素、IPTG、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；巰基乙酸培養(yǎng)基購自美國BD Biosciences 公司；Primer star Mix、EcoRⅠ和NotⅠ快切酶購自日本TaKaRa 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、高效無縫克隆試劑盒（MC40101）購自莫納生物科技有限公司；His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)公司；TritonX-114、p38MAPK／ERK 抑制劑購自美國Sigma 公司；牛膽粉、枸櫞酸鐵銨、酪蛋白、維生素C-Na 購自德國默克公司；兔抗P-p38MAPK、p38MAPK、P-ERK1／2、ERK1／2 以及鼠抗β-actin抗體購自美國Abcam 公司；羊抗兔IgG-HRP 和羊抗鼠IgG-HRP 購自北京Proteintech 公司；小鼠IL-6、IL-12、TNF-α 細(xì)胞因子檢測試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司。

1.4 賈第蟲滋養(yǎng)體的培養(yǎng) 將賈第蟲從液氮罐中取出，迅速在37 ℃水浴鍋中融化，室溫2000 × g 離心5 min，棄上清，加入1 mL 改良TYI-S-33 賈第蟲培養(yǎng)液（每20 mL 培養(yǎng)基含4 g 蛋白胨、2 g 酵母提取物、0.4 g NaCl、0.26 g K2HPO4、0.12 g KH2PO4、2 g 葡萄糖、0.2 g 牛膽粉、0.2 g L-cysteine HCl、0.04 g 維生素C-Na、200 μL 慶大霉素、660 μL 5 mol／L NaOH、2 mL 雙抗、1 mL 枸櫞酸鐵銨、25 mL 胎牛血清）重懸后，轉(zhuǎn)入?yún)捬跖囵B(yǎng)瓶中，加滿賈第蟲培養(yǎng)液，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 PMs 的分離及培養(yǎng) 小鼠腹腔內(nèi)注射2 mL 巰基乙酸培養(yǎng)基，3 ～ 5 d 內(nèi)斷頸處死，浸泡于75%酒精中10 min；打開小鼠腹部暴露腹膜，用PBS 沖洗腹腔，將收集的細(xì)胞懸液1000 × g 離心10 min；計(jì)數(shù)后，按3 × 106個(gè)／ 孔鋪至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，換液繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.6 目的基因的擴(kuò)增 根據(jù)GdTRX 基因序列（GL-50803_00104250）和原核表達(dá)載體pET28a 的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，GdTRX-F：5′-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGCCCTTCAGCCCCATTT-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），GdTRX-R：5′-TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCCTAGAGCATGGCGGCCACG-3′（下劃線部分為NotⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段大小為372 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。收集對數(shù)生長期的賈第蟲滋養(yǎng)體，提取總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，PCR 擴(kuò)增GdTRX基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收純化后，用無縫克隆連接酶將GdTRX 基因與經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ酶切的pET28a 空載體于50 ℃，15 min 條件下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，用含30 μg／mL 卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基于37 ℃過夜培養(yǎng)；提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送庫美生物科技有限公司測序。

1.8 rGdTRX 的表達(dá)及純化 將pET28a 空載體及測序正確的pET28a-GdTRX 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落至含30 μg／mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)；將菌液按1 ∶100 的比例轉(zhuǎn)接至含30 μg ／mL 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)至A600約0.6～ 0.8 時(shí)，加入IPTG 至終濃度為1 mmol／L，37 ℃，140 r／min 誘導(dǎo)表達(dá)6 h；將菌液8000×g 離心10 min，用Binding Buffer 重懸菌體，超聲破碎，再次離心，分離沉淀和上清，進(jìn)行12% SDS-PAGE 鑒定。用His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對目的蛋白進(jìn)行純化并透析過夜，取部分透析后蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE 及Western blot 鑒定。

1.9 內(nèi)毒素的去除 將終濃度為1%的TritonX-114加至透析后的rGdTRX 蛋白液中，劇烈振蕩混勻，冰浴10 min，隨后37 ℃水浴10 min；12000 × g 離心10 min，吸取上層水相。將上述過程重復(fù)3 次，收集含有蛋白的上層水相，經(jīng)BCA 法測定濃度后，0.22 μm濾器過濾，-80 ℃冰箱保存。

1.10 rGdTRX 對PMs 活力影響的檢測 采用CCK-8法。將PMs 以1×105個(gè)／孔的密度鋪至96 孔板，培養(yǎng)6 h；分別用PBS（未處理組）和濃度為5、10、20、50、80 μg／mL 的rGdTRX（實(shí)驗(yàn)組）刺激細(xì)胞24 h；每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h；450 nm 波長處測定吸光度值。按下式計(jì)算不同濃度rGdTRX 的細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值- 空白對照組吸光度值）／（未處理組吸光度值-空白對照組吸光度值）×100%

1.11 炎性細(xì)胞因子分泌水平的檢測 采用ELISA 法。將PMs 以3 × 106個(gè)／ 孔的密度鋪至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁后，用rGdTRX 孵育細(xì)胞0、0.5、1、2、4、6 h；收集培養(yǎng)上清，用細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒檢測IL-6、IL-12 和TNF-α 水平。

1.12 p38MAPK／ERK 信號通路激活情況的檢測 采用Western blot 法。將PMs 以3 × 106個(gè)／ 孔的密度鋪至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁后，用PBS、His 標(biāo)簽蛋白、終濃度為50 μg／mL 的rGdTRX 孵育細(xì)胞0.5、1、2、4、6 h；收取全細(xì)胞蛋白后制樣，經(jīng)12% SDSPAGE 分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入兔抗P-p38MAPK、p38MAPK、P-ERK1／2、ERK1／2 及鼠抗β-actin 抗體（均1 ∶1000稀釋），4 ℃過夜；TBST 洗膜4 次，10 min／次，分別加入羊抗兔IgG-HRP 或羊抗鼠IgG-HRP（均1 ∶5000稀釋），室溫孵育1 h；TBST 洗膜4 次，10 min／次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液（ECL）顯色，Image J 對目的蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.13 p38MAPK／ERK 信號通路對炎性細(xì)胞因子分泌影響的檢測 采用ELISA 法。將小鼠PMs 以3 ×106個(gè)／ 孔的密度鋪至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁后，分別用p38MAPK 抑制劑（SB203580，30 mmol／L）、ERK抑制劑（PD98059，40 mmol／L）或DMSO 預(yù)處理1 h，再用rGdTRX 孵育細(xì)胞24 h，設(shè)rGdTRX 單獨(dú)刺激組。分別收集培養(yǎng)上清，用細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒檢測IL-6、IL-12 和TNF-α 水平。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有試驗(yàn)重復(fù)3 次。采用Graph-Pad Prism 軟件對組內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)使用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物及重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，GdTRX 基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為372 bp，與預(yù)期一致，見圖1。質(zhì)粒pET28a-GdTRX經(jīng)雙酶切鑒定證明構(gòu)建正確，測序結(jié)果與GenBank上登錄的序列相符，見圖2。

2.2 表達(dá)及純化產(chǎn)物的鑒定 12% SDS-PAGE 分析發(fā)現(xiàn)，rGdTRX 在上清和沉淀均有表達(dá)，見圖3。用His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化后，表達(dá)的rGdTRX 相對分子質(zhì)量約20000，見圖4；透析純化后，12% SDSPAGE 及Western blot 分析顯示，純化的rGdTRX 相對分子質(zhì)量約為20000，見圖5 和圖6。

圖3 rGdTRX 表達(dá)的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE profile of expressed rGdTRX

圖4 His 標(biāo)簽蛋白純化的rGdTRX 的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of rGdTRX purified with His tag

圖5 透析純化的rGdTRX 的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE profile of rGdTRX purified by dialysis

圖6 透析純化的rGdTRX 的Western blot 分析Fig.6 Western blotting of rGdTRX purified by dialysis

2.3 rGdTRX對PMs 活力的影響 CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，rGdTRX 在50 μg ／mL濃度下對PMs 活力無影響（F5，12= 3.780，P > 0.05），在80 μg／mL 下，對PMs 活力有輕微抑制（F5，12=3.780，P > 0.05），見圖7。因此，選擇濃度50 μg／mL 的rGdTRX 對PMs 進(jìn)行刺激。

圖7 rGdTRX 刺激PMs 的安全濃度篩選Fig.7 Screening of safe concentration of rGdTRX for stimulating PMs

2.4 rGdTRX 調(diào)控MAPK 信號通路對炎性細(xì)胞因子分泌的影響 ELISA 檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，在6 h 內(nèi)，rGdTRX 能夠時(shí)間依賴性地促進(jìn)IL-6、IL-12 和TNF-α 細(xì)胞因子的分泌，且在6 h 時(shí)分泌水平最高（F5，12分別為18.73、54.57 和240.0，P 均< 0.0001），見圖8。表明rGdTRX 可誘導(dǎo)PMs中IL-6、IL-12 和TNF-α 的分泌。

圖8 rGdTRX 誘導(dǎo)PMs 中IL-6（A）、IL-12（B）和TNF-α（C）細(xì)胞因子的分泌情況Fig.8 Secretions of inflammatory cytokines IL-6（A），IL-12（B）and TNF-α（C）inducted by rGdTRX

2.5 p38MAPK／ERK 信號通路激活情況 Western blot 分析顯示，與PBS 對照組相比，rGdTRX 刺激PMs可引起p38MAPK 和ERK 的磷酸化（F8，18分別為81.79和158.7，P 均<0.0001）；p38MAPK 2 h 和ERK 1 h的磷酸化水平達(dá)到峰值，之后隨時(shí)間延長蛋白磷酸化水平逐漸恢復(fù)。見圖9 和圖10。表明rGdTRX 可激活PMs 的MAPK 信號通路。

圖9 rGdTRX 對MAPK 信號通路激活的Western blot分析Fig.9 Western blotting of activation of MAPK signaling pathway by rGdTRX

圖10 p38MAPK（A）和ERK（B）的相對磷酸化水平Fig.10 Relative phosphorylation levels of p38MAPK（A）and ERK（B）

2.6 p38MAPK／ERK 信號通路對炎性細(xì)胞因子分泌的影響 ELISA 檢測結(jié)果顯示，與空白對照組、DMSO 組相比，rGdTRX 組IL-6、IL-12 和TNF-α 細(xì)胞因子的分泌量均顯著升高（F4，10分別為23.52、26.82 和54.32，P 均< 0.0001）。與rGdTRX 單獨(dú)刺激組相比，SB203580 預(yù)處理組IL-6 分泌量降低約2.3 倍（t = 3.434，df = 4，P < 0.05），IL-12 分泌量降低約3.5 倍（t = 4.448，df = 4，P < 0.05），TNF-α分泌量降低約1.8 倍（t = 4.124，df = 4，P < 0.05）；PD98059 預(yù)處理組IL-6 分泌量降低約2.5 倍（t =3.754，df = 4，P < 0.05），IL-12 分泌量降低約2.9倍（t = 3.978，df = 4，P < 0.05），TNF-α 分泌量降低約1.7 倍（t = 5.267，df = 4，P < 0.01）。見圖11。阻斷p38MAPK／ERK 信號通路后，rGdTRX 介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌降低，表明rGdTRX 通過p38MAPK ／ERK 信號通路調(diào)控宿主細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-12 和TNF-α 的分泌。

圖11 p38MAPK／ERK 信號通路對IL-6（A）、IL-12（B）和TNF-α（C）炎性細(xì)胞因子分泌的影響Fig.11 Effect of p38MAPK／ERK signaling pathway on secretions of inflammatory cytokines IL-6（A），IL-12（B）and TNF-α（C）

3 討論

宿主的先天免疫系統(tǒng)在抗寄生蟲感染中發(fā)揮重要作用。賈第蟲感染小鼠能夠引起IL-6、IL-12、TNF-α 等多種細(xì)胞因子水平上調(diào)并發(fā)揮抗賈第蟲感染作用［14-15］，賈第蟲分泌的胞外囊泡同樣能夠誘導(dǎo)小鼠PMs 分泌IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子，炎性細(xì)胞因子分泌是宿主抗賈第蟲感染的重要手段之一。TRX是賈第蟲胞外囊泡的重要組分［13，16］，在賈第蟲誘導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答中可能扮演重要角色。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rGdTRX 能引起PMs 炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-12、TNF-α 的分泌，提示rGdTRX 在賈第蟲激活宿主先天免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。

TRX 在機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖和存活等過程中發(fā)揮重要作用［17-18］。TRX 能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及IL-12 分泌，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，且能夠通過JNK、p38MAPK 通路參與細(xì)胞凋亡等過程［4，19］。研究表明，MAPK 信號通路有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及調(diào)控細(xì)胞因子分泌等作用［20］。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，賈第蟲、賈第蟲胞外囊泡均能激活宿主細(xì)胞p38MAPK 和ERK 信號通路，引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生［13，16，21］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rGdTRX 同樣可激活小鼠PMs 的MAPK 信號通路；p38MAPK／ERK 信號通路被抑制后，rGdTRX 引起的炎性細(xì)胞因子分泌顯著降低，表明rGdTRX 誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子分泌能夠通過p38MAPK、ERK 信號通路調(diào)控，本文為賈第蟲激活宿主先天免疫反應(yīng)中關(guān)鍵分子的研究提供了新的理論依據(jù)。另一方面，在陰道毛滴蟲、瘧原蟲、阿米巴原蟲的研究中，TRX 系統(tǒng)是其抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要防線［22］，也是陰道毛滴蟲適應(yīng)微氧生活的可能原因。賈第蟲TRX 系統(tǒng)具有同等功能，然而其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究［23］。

綜上所述，rGdTRX 能通過p38MAPK、ERK 信號通路調(diào)控小鼠PMs 炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-12 和TNF-α 的分泌，本實(shí)驗(yàn)為揭示rGdTRX 在賈第蟲誘導(dǎo)宿主細(xì)胞先天免疫應(yīng)答機(jī)制中起到的關(guān)鍵作用提供了重要理論支撐，rGdTRX 是賈第蟲激活宿主先天免疫的關(guān)鍵分子之一。