金李萍 潘曉藝 藺凌云 姚嘉赟 曹 錚 尹文林 賴迎迢 陶家發(fā) 劉憶瀚 沈錦玉, ,

(1. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院, 上海 201200; 2. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室,浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室, 湖州 313001; 3. 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室, 廣州 510380)

鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2, Cy-HV-2)是一種能夠感染金魚和鯽及鯽變種的雙鏈DNA病毒, 是鯉科魚類中發(fā)現(xiàn)的第二種皰疹病毒,其屬于皰疹病毒目(Herpesvirales)異源皰疹病毒科(Alloherpesviridae)鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)[1]。該病毒感染鯽可引起鯽造血器官壞死病(Crucian carp hematopoietic necrosis)[2], 患病鯽表現(xiàn)為食欲下降, 離群獨游, 呼吸速率增加, 體表和鰭條基部出血,眼球突出, 鰓絲腫脹, 充血或出血; 脾和腎腫大、充血等癥狀。該病病程發(fā)展迅速, 死亡率高達90%—100%, 已成為影響中國鯽魚養(yǎng)殖最為嚴重的疫病之一[3—5]。

RNAi(RNA interference, RNA干擾)[6,7]指通過雙鏈RNA(dsRNA)的介導, 特異性降解對應序列的mRNA, 從而特異性抑制相對應基因的表達。目前RNAi技術(shù)已廣泛運用于植物、線蟲和果蠅等低等模式生物的基因表達、調(diào)控與功能的研究中, 在水生動物抗病毒研究中, RNA干擾技術(shù)也被廣泛應用, 如用于對白斑綜合癥病毒、黃頭病毒、草魚出血病病毒和神經(jīng)壞死病毒的抗病毒感染研究[8]。黃桂菊等[9]通過對融合了綠色熒光蛋白(EGFP)基因的石斑魚神經(jīng)壞死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)衣殼蛋白(Major capsid protein, MCP)基因進行siRNA干擾試驗, 表明不同劑量的siRNA均能干擾綠色熒光蛋白的表達。

本實驗針對CyHV-2ORF57設計3組siRNA, 通過轉(zhuǎn)染異育銀鯽脊髓組織細胞系(Spinal cord tissue cell lines ofCarassius auratus gibelio, CSC)后, 進行CyHV-2感染, 通過對細胞病變和病毒含量的測定評估各組siRNA對病毒復制的抑制效率, 為分析CyHV-2的功能因子, 及通過RNA干擾技術(shù)防治Cy-HV-2提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

異育銀鯽脊髓組織細胞系CSC[10]、CyHV-2病毒株CNTB2015由浙江省淡水水產(chǎn)研究所魚病室保存。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司;L-15培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶-EDTA、Opti-MEMⅠ購自Gibco公司; 新生牛血清, 購自金源康公司; 培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒(DP430)、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預混試劑購自天根生化科技 (北京) 有限公司。

1.2 siRNA的合成及引物設計

根據(jù)CyHV-2病毒株CNTB2015基因組(Gen-Bank: MN201961)的ORF57基因片段設計3條siRNA, 并設一組陰性siRNA(siRNA-control); 針對異育銀鯽β-actin基因設計一條FAM修飾的siRNA,同時設計合成針對各條siRNA作用位點的檢測用引物, 由生工生物工程(上海)公司合成, 序列信息如表 1。

表1 siRNA和PCR引物序列信息Tab. 1 Sequences of siRNA and primers

1.3 細胞的培養(yǎng)

CSC細胞用含10%新生牛血清和1%雙抗的L-15培養(yǎng)基于24℃條件下培養(yǎng)。生長至單層后用0.25%胰酶-EDTA消化, 并按2×105cell/mL 100和500 μL分別接種于96孔板和24孔板中, 于24℃條件下培養(yǎng)。

1.4 病毒的培養(yǎng)及TCID50測定

取保存的CyHV-2 CNTB2015病毒液200 μL接種至CSC細胞生長良好的T25細胞瓶中, 孵育30min, 然后加入5 mL維持液(含2%新生牛血清和1%雙抗的L-15培養(yǎng)基), 置于24℃培養(yǎng)。細胞病變達到70%左右, 吹落細胞制成病毒液, 凍融1次后,12000 r/min離心5min后取上清液, 作為感染用病毒液備用。

將制備的病毒液作連續(xù)10倍梯度稀釋, 獲得8個稀釋度10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11和10-12的病毒液, 并設置空白對照組, 每組8個重復。在長滿單層CSC細胞的96孔板中每孔接種各稀釋度的病毒液100 μL, 孵育30min后棄去, 再加入100 μL維持液, 置于24℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 逐日觀察細胞病變, 并記錄細胞病變孔數(shù)。按Reed-Muench法[12]計算病毒滴度TCID50值。

1.5 siRNA轉(zhuǎn)染量和轉(zhuǎn)染液維持時間優(yōu)化

siRNA采用脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)包裹的方式轉(zhuǎn)染, 其使用濃度為說明書的推薦濃度, 轉(zhuǎn)染使用的培養(yǎng)基為Opti-MEMⅠ, 將FAM-β-actinsiRNA初始濃度配置成20 μmol/L。各取一定量FAM-β-actin-siRNA與Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基配置成不同濃度(轉(zhuǎn)染終濃度分別為40、80和120 nmol/L)的siRNA復合物50 μL, 將脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基配置成Lipofectamine 2000復合物50 μL, 分別混合靜置5min, 再將siRNA復合物加入Lipofectamine 2000復合物中, 輕輕混勻, 避光靜置25min, 然后加入400 μL Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基, 輕輕混勻, 獲得 500 μL的FAM-βactin-siRNA-脂質(zhì)體復合物溶液, 配制比例見表 2。

在CSC細胞長至80%時進行siRNA的轉(zhuǎn)染。首先, 棄盡24孔板中培養(yǎng)液, 再將上述siRNA-脂質(zhì)體復合物加入24孔板中, 共5組: 3個不同濃度的siRNA組、陰性siRNA對照組和Mock對照組; 每組設6重復。在轉(zhuǎn)染6h后每組選3個重復孔棄盡轉(zhuǎn)染液, 換成含10 %新生牛血清和1%雙抗的L-15繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染24h后, 將所有孔中的培養(yǎng)液吸棄, 并用維持液清洗一次, 再加入維持液后, 在熒光顯微鏡下拍照觀察熒光信號。并在優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件下轉(zhuǎn)染, 在不同時間(24h、48h、72h和120h)進行轉(zhuǎn)染效果的觀察。每組選取3張熒光照片通過軟件Image J計算圖片中熒光點數(shù)量, 首先將圖像轉(zhuǎn)為8-bit,調(diào)整閾值后, 進行自動分析和顆粒計數(shù)(Image-Adjust-Threshold-Analyze-Analyze Particles), 可選步驟: 填補細胞核的空隙(Process-Binary-Fill Holes)打斷細胞核的重疊部分(Process-Binary-Watershed),計算各組熒光點平均值; 同時提取各組細胞RNA,以標定基因拷貝數(shù)濃度的β-actin基因PCR純化產(chǎn)物為參考, 通過熒光定量PCR測定各組β-actin基因表達量, 選擇轉(zhuǎn)染抑制效果最優(yōu)組的轉(zhuǎn)染條件作為后期試驗轉(zhuǎn)染條件。

1.6 CyHV-2 ORF57 siRNA對CyHV-2病毒的抑制作用

按1.5中優(yōu)化后的條件, siRNA濃度80 nmol/L、轉(zhuǎn)染液維持24h, 轉(zhuǎn)染三組CyHV-2ORF57的siRNA(ORF57-siRNA-1、ORF57-siRNA-2、ORF57-siRNA-3), 同時設置陰性對照組(陰性siRNA)、陽性對照組(β-actinsiRNA)、MOCK對照組和空白對照組。每組設立3個重復孔。

在siRNA轉(zhuǎn)染液維持24h后, 洗去轉(zhuǎn)染液, 加入200 μL CyHV-2病毒液(TCID50為108.325/mL), 孵育30min后, 吸棄病毒液, 加入維持液, 于24℃培養(yǎng), 分別在第24h、48h、72h和120h進行細胞狀態(tài)觀察,并采集樣品提取RNA用于轉(zhuǎn)錄基因的定量檢測, 對其中維持至第120h的細胞樣品進行TCID50測定(方法同1.4), 分組情況如表 3所示。

表3 siRNA抑制試驗分組Tab. 3 Grouping of transfection inhibition test

1.7 總RNA的提取及ORF57轉(zhuǎn)錄檢測

對1.6中采集的細胞樣品按試劑盒說明書進行總RNA的提取, 取80 ng RNA進行cDNA合成(FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒)。按表 2中的引物進行熒光定量PCR, 每組共3個平行樣品, 每個樣品設立2個重復, qPCR采用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒, 據(jù)說明書的25 μL反應體系進行配制, 反應程序為: 95℃ 15min; 95℃ 10s、60℃ 32s, 40個循環(huán)。選擇鯽β-actin作為內(nèi)參基因進行校準, 采用2-ΔΔCt法計算ORF57的相對表達量,ΔΔCt=(Cttarget-Ctβ-actin)待測樣本-(Cttarget-Ctβ-actin)校準樣本。

表2 加樣配比表Tab. 2 Sampling ratio table

1.8 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。其中,ORF57在不同組的相對表達量采用T檢驗分析, 統(tǒng)計學顯著性水平設定P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 病毒培養(yǎng)及病毒滴度的測定

CyHV-2病毒接種至CSC細胞中培養(yǎng), 至第5天出現(xiàn)80%的細胞病變(圖 1), 收獲病毒液。于長滿至80%單層的CSC細胞的96孔板中進行TCID50測定,記錄每個稀釋度的細胞病變孔數(shù)(表 4), 按Reed-Muench法計算, 獲得TCID50為108.325/mL。

表4 TCID50病毒滴度測定Tab. 4 Detection of TCID50 in different virus dilutions

圖1 正常細胞與病變細胞狀態(tài)圖Fig. 1 Normal cells and pathological cells

2.2 siRNA 轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

采用針對β-actin基因的FAM-siRNA在24孔板培養(yǎng)的CSC細胞上進行轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化。采用熒光顯微鏡在相同放大倍數(shù)和相同發(fā)射光強度下, 采集各組別的熒光圖片(圖 2), 通過圖片處理軟件Image J分析各組3張圖片的熒光點數(shù)量。各組熒光點平均值見表 5。結(jié)果顯示: 轉(zhuǎn)染液體維持6h后, 熒光信號與siRNA終濃度呈正相關(guān); 而維持24h后, 80 nmol/L轉(zhuǎn)染濃度組熒光點數(shù)最高, 平均1366個, 40 nmol/L濃度組平均熒光點數(shù)700個。

表5 Image J 統(tǒng)計熒光點數(shù)量Tab. 5 Number of fluorescent spots counted by Image J

圖2 在不同條件下FAM-β-actin-siRNA轉(zhuǎn)染效果Fig. 2 Effect of different concentrations of FAM-β-actin- siRNA transfection

提取各組樣品RNA, 通過熒光定量PCR檢測各組β-actin基因拷貝數(shù), 結(jié)果顯示, 當轉(zhuǎn)染濃度為80 nmol/L, 轉(zhuǎn)染時間為24h時,β-actin基因表達量最低(表 6),表明該組轉(zhuǎn)染后, siRNA的干擾效果相對較好。

表6 在各轉(zhuǎn)染方案下β-actin基因拷貝數(shù)Tab. 6 Copy number of β-actin gene under each transfection scheme(copies/ng)

結(jié)合熒光照片熒光點數(shù)量和β-actin基因表達量的分析結(jié)果, 以80 nmol/L濃度的FAM-β-actin-siRNA轉(zhuǎn)染CSC細胞, 轉(zhuǎn)染后維持時間為24h時, siRNA的抑制效率最高。因此, 選擇以80 nmol/L濃度的siRNA轉(zhuǎn)染CSC細胞后維持24h作為后期轉(zhuǎn)染試驗方案。

在優(yōu)化后的條件下轉(zhuǎn)染FAM-β-actin-siRNA后,吸棄轉(zhuǎn)染液, 加入維持液, 在第24、第48、第72和第120h在熒光倒置顯微鏡(Leica DMI 3000B)下進行熒光信號觀察(圖 3)。結(jié)果表明, 在24—72h內(nèi)熒光信號數(shù)量無顯著差異; 在第120h時, 觀察到熒光點的數(shù)量和細胞數(shù)量都顯著減少。通過熒光定量PCR檢測各組β-actin基因轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù), 結(jié)果顯示(表 7),FAM-β-actin-siRNA在120h內(nèi)對細胞β-actin基因轉(zhuǎn)錄的抑制效果存在小幅波動, 在第72h時抑制效率最高, 第24和第120h兩個時間點抑制效率無顯著差異。

表7 轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和120h β-actin基因表達情況Tab. 7 Expression of β-actin gene at 24h, 48h, 72h and 120h after transfection (copies/ng)

圖3 轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和120h熒光信號Fig. 3 Observation of fluorescence effect at 24h, 48h, 72h and 120h

2.3 ORF57-siRNA對CyHV-2病毒致細胞病變的抑制作用

對轉(zhuǎn)染不同ORF57-siRNA的CSC細胞進行病毒感染, 并對感染病毒后的細胞進行觀察, 結(jié)果顯示: 在感染病毒后第24和第48h, 各組無明顯細胞病變, 第72h各組細胞出現(xiàn)部分聚集, 在第120h各組觀察到明顯的細胞病變(圖 4)。在第120h時, 相較對照組,ORF57-siRNA-2組細胞病變最少,ORF57-siRNA-3組次之,ORF57-siRNA-1組略輕于對照組,表明在3組siRNA中ORF57-siRNA-2抑制病毒致細胞病變效果最好。

圖4 ORF57-siRNAs在120h干擾CyHV-2致CSC細胞病變效果Fig. 4 Effect of ORF57-siRNAs on CyHV-2-induced CSC CPE at 120h

2.4 ORF57-siRNA對CyHV-2 ORF57轉(zhuǎn)錄的抑制效率測定

ORF57-siRNA處理后的CSC細胞感染病毒后,提取總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄, 以β-actin為內(nèi)參基因, 進行ORF57表達差異相對定量分析。結(jié)果顯示: 在48h內(nèi), 各siRNA組對病毒ORF57基因表達都有一定的抑制作用; 與MOCK組相比,ORF57-siRNA-2抑制效率最高, 表達量降低至33.55%(P＜0.01),ORF57-siRNA-1組降低至50.59%(P＜0.05),ORF57-siRNA-3組降低至70.72%(P＜0.05; 圖 5)。ORF57-siRNA -2組, 第48h時處于最低的33.55%, 之后緩慢升高, 至120h表達量上升至41.61%(P＜0.05), 而陰性siRNA組的表達量接近于Mock對照組(圖 6)。結(jié)果表明,ORF57-siRNA-2對CyHV-2ORF57轉(zhuǎn)錄具有較強的、較持久的抑制作用。

圖5 ORF57-siRNAs處理后48h ORF57相對表達量Fig. 5 Relative expression of ORF57 at 48h after treatment withORF57-siRNAs

圖6 不同時間點ORF57-siRNA-2對ORF57轉(zhuǎn)錄的抑制作用Fig. 6 Inhibitory effect of ORF57-siRNA-2 on transcription of ORF57 at different times

2.5 ORF57-siRNA對CyHV-2 TCID50的影響

取1.6收集的各組維持至第120h的病毒培養(yǎng)液,分別接種于長滿至80%單層的CSC細胞的96孔板中進行TCID50測定, 按Reed-Muench法計算CyHV-2-ORF57-1組、CyHV-2-ORF57-2組、CyHV-2-ORF57-3組、陰性siRNA組和Mock組的TCID50。TCID50測定結(jié)果表明(表 8),ORF57-siRNAs對Cy-HV-2的復制具有一定的減弱作用, 其中CyHV-2-ORF57-2組的抑制作用最強, 與Mock相比TCID50降低了94%, 與陰性siRNA組相比降低了98.1%。

表8 ORF57-siRNAs對CyHV-2 TCID50的影響Tab. 8 Effect of ORF57-siRNA on CyHV-2 TCID50

3 討論

3.1 siRNA對病毒復制的抑制作用

siRNA作為RNA干擾方式之一, 已被廣泛用于抑制水生動物病毒復制方面的研究[13]。陳蕓[14]通過將針對草魚出血病病毒(Grass carp reovirus,GCRV)VP7的siRNA注射稀有鯽, 降低了實驗組的死亡率, 并延緩了病程; 馬杰等[15]設計并構(gòu)建了同時靶向GCRV JX09-01(GCRVⅠ型)及GCRV 104(GCRVⅢ型)VP2蛋白基因的雙siRNA表達載體,轉(zhuǎn)染CIK細胞后, 可以同時抑制GCRV JX09-01和GCRV 104的復制, 說明多條siRNA可同時作用, 抑制多種病毒的復制。此外, siRNA還被用于包括白斑綜合征病毒[16]、鯉春病毒血癥病毒[17]、條石鯛虹彩病毒[18]和大鯢蛙病毒[19]等病毒的干擾研究。本研究針對DNA病毒CyHV-2的ORF57設計了3組siRNA, 通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CSC細胞后, 評估siRNA對CyHV-2病毒復制的干擾作用。結(jié)果也顯示了siRNA在mRNA水平上抑制了CyHV-2ORF57的表達, 將ORF57mRNA拷貝數(shù)下降為33.55%, 進而延緩或減少細胞病變。以上研究結(jié)果表明, 利用siRNA抑制病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的表達都可以有效抑制病毒的復制, 這為水產(chǎn)動物病毒病的控制與治療提供了有力工具。

3.2 ORF57的轉(zhuǎn)錄對CyHV-2復制的影響

鯉皰疹病毒包括鯉皰疹病毒Ⅰ型(CyHV-1)、鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)和鯉皰疹病毒Ⅲ型(Cy-HV-3), 3種類型鯉皰疹病毒ORF57編碼的氨基酸序列之間的相似性在50.61%—54.1%, 表明該基因鯉皰疹病毒屬中較為保守。在鰻皰疹病毒1(AngHV-1)和遺傳關(guān)系更遠的鱷痘病毒(CRV)中也存在ORF57的同源基因, 表明該基因可能存在相同的祖先[20,21], 但其具體功能還未有報道。Boutier等[22]構(gòu)建缺失ORF57基因的CyHV-3, 通過攻毒試驗, 表明缺失ORF57的CyHV-3失去了對錦鯉的致病力, 并且ORF57蛋白在CyHV-3病毒粒子中含量最豐富的蛋白之一[23]。作為在中國新發(fā)的病原CyHV-2, 其同源基因ORF57的編碼蛋白是其八大主要免疫原蛋白之一[24], 作為早期基因在感染細胞2—4h后被轉(zhuǎn)錄[25]。但其對CyHV-2毒力的影響, 未有人報道。本研究通過ORF57siRNA的干擾, 將ORF57的轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù)下降50%以上, 相對于未干擾組,siRNA干擾后的病毒TCID50從108.487/mL降低至106.776/mL, 這表明,ORF57的轉(zhuǎn)錄影響著CyHV-2的復制。通常體內(nèi)病毒滴度的高低與病毒致病性存在著較大相關(guān)性, 因此,ORF57對CyHV-2在體內(nèi)致病力的表現(xiàn)具有潛在的影響作用。

3.3 轉(zhuǎn)染時機對siRNA轉(zhuǎn)染效率的影響

陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法已廣泛被用于細胞DNA/RNA的轉(zhuǎn)染, 但也存在有細胞毒性的缺陷[26]。本研究在使用高濃度Lipofectamine 2000及轉(zhuǎn)染高濃度siRNA(120 nmol/L)時, 轉(zhuǎn)染后都出現(xiàn)細胞脫落以及細胞狀態(tài)不佳的情況。根據(jù)熒光強度, siRNA轉(zhuǎn)染終濃度為80 nmol/L、維持24h時, 熒光信號最強, 高于40和120 nmol/L兩組; 測定鯽β-actin基因表達量,轉(zhuǎn)染終濃度為80 nmol/L時, 在第72h時抑制效率達到最大值。本研究選擇80 nmol/L濃度的siRNA進行轉(zhuǎn)染, 既能保證一定的轉(zhuǎn)染效率, 也能讓細胞處在良好的實驗狀態(tài)。轉(zhuǎn)染后120h內(nèi)CSC細胞在siRNA作用下能夠被穩(wěn)定的抑制基因的表達, 在siRNA轉(zhuǎn)染后的第72h表現(xiàn)出最佳的轉(zhuǎn)染抑制效果,這與轉(zhuǎn)染24h接種病毒后第48h抑制效果最佳的結(jié)果相符。在細胞生長旺盛階段進行siRNA的轉(zhuǎn)染能夠提高轉(zhuǎn)染效率, 在實際操作中, 常選擇鋪滿程度為80%的細胞用于轉(zhuǎn)染。在研究過程中, 病毒感染時機的選擇上, 不同學者采取的方法各異, 楊光等[27]就比較了感染病毒與轉(zhuǎn)染siRNA的順序?qū)Σ《靖蓴_結(jié)果的影響, 結(jié)果表明, 先感染病毒后進行siRNA干擾組的細胞存活率要優(yōu)于先轉(zhuǎn)染siRNA后感染病毒組。而李兵[28]研究的RNA干擾抑制草魚呼腸孤病毒復制的細胞模型實驗中, 則是選擇了先轉(zhuǎn)染siRNA, 再進行病毒感染的程序, 對病毒的抑制率達到80%以上。本研究選擇了先轉(zhuǎn)染siRNA,后感染病毒的程序進行siRNA的研究。

4 結(jié)論

在本研究中, 利用RNA干擾技術(shù)針對CyHV-2重要基因ORF57進行干擾, 在CSC細胞上對病毒復制獲得了較好的抑制效果, 對病毒mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制率最高達66.45%, 對病毒滴度最高降低98.1%。該結(jié)果表明,ORF57在CyHV-2的毒力表現(xiàn)中起到重要作用, 其具體生物學功能有待進一步研究。這為CyHV-2毒力相關(guān)基因研究提供借鑒, 也為Cy-HV-2弱毒株的改造和基于siRNA技術(shù)的抗CyHV-2防治提供思路。