魏祖運(yùn) 盧利霞 任秋磊 何天良 陳新華

(福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院, 福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002)

自噬(Autophagy)是一種依賴溶酶體對細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行降解的過程, 在細(xì)胞分化、發(fā)育和免疫等多種生理過程中具有重要作用[1—3]。研究表明, 自噬作為細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境壓力的自我保護(hù)機(jī)制, 參與機(jī)體的抗病毒先天免疫和特異性免疫反應(yīng)[4]。自噬不僅可以直接清除病毒, 還參與調(diào)控天然和適應(yīng)性抗病毒免疫應(yīng)答的多個過程, 包括天然免疫細(xì)胞的分化發(fā)育、天然免疫信號通路的活化、淋巴細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)維持、抗原的加工提呈及抗體應(yīng)答等[4,5]。自噬相關(guān)基因(Autophagy-related genes,ATG)在自噬過程中發(fā)揮重要作用[6], 參與自噬的起始、自噬體膜的延伸、自噬體的成熟與融合及自噬體降解的全過程。目前在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中已鑒定了30多個ATG基因, 其中15個(ATG1-10、ATG12-14、ATG16和ATG18)在哺乳動物中高度保守[7,8]。

ATG10是招募其他自噬相關(guān)因子進(jìn)行復(fù)雜共軛的重要接頭分子, 在自噬體膜延伸的過程中起關(guān)鍵作用[9]。作為E2樣泛素結(jié)合酶(E2-like ubiquitin conjugating enzyme), ATG10在E1樣泛素活性酶(E1-like ubiquitin activating enzyme)ATG7的協(xié)助下, 招募ATG12形成ATG12-ATG10硫酯中間體, 進(jìn)一步與ATG5結(jié)合形成ATG12-ATG5復(fù)合體[10]。在自噬發(fā)生時, ATG12-ATG5復(fù)合體與ATG16L1形成共軛蛋白復(fù)合體, 并定位于自噬小體形成過程中的隔離膜上, 具有E3樣泛素連接酶(E3-like ubiquitinprotein ligase)活性, 參與微管相關(guān)蛋白LC3的脂化,促進(jìn)自噬體的形成[11—13]。研究表明, ATG10在動物抗病毒免疫過程中也具有重要作用[14]。在人肝癌細(xì)胞系Huh 7.5中過表達(dá)ATG10可促進(jìn)自噬體與溶酶體的結(jié)合, 從而抑制丙肝病毒(Hepatitis C virus,HCV)的復(fù)制[15]。在太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)中, 牡蠣外套膜中的CgATG10的轉(zhuǎn)錄水平在受到病毒類似物poly (I:C)刺激后顯著上調(diào), 表明CgATG10可能參與抗病毒免疫反應(yīng)[9]。然而, 目前有關(guān)魚類ATG10的研究還未見報道, 其在魚類抗病毒免疫中的功能尚不清楚。

大黃魚(Larimichthys crocea)在我國沿海地區(qū)養(yǎng)殖規(guī)模大, 經(jīng)濟(jì)價值高, 但近年來病害頻發(fā), 造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[16,17]。由于自噬在動物抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用, 因此解析大黃魚自噬的分子基礎(chǔ)及機(jī)制, 對于認(rèn)識自噬在大黃魚抗病毒免疫中的功能, 及大黃魚病毒病的防治具有重要意義。為此, 我們研究了大黃魚ATG10基因(LcATG10)在正常大黃魚組織和免疫相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)水平及該基因?qū)︳~類病毒復(fù)制的影響, 這些結(jié)果將為闡明ATG10在魚類抗病毒免疫中的功能及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用大黃魚均購自寧德富發(fā)水產(chǎn)有限公司, 將大黃魚在流動的海水中適應(yīng)性養(yǎng)殖10d, 水溫為25℃。在暫養(yǎng)結(jié)束后, 將正常狀態(tài)大黃魚分為實(shí)驗(yàn)組和對照組, 每組30尾。實(shí)驗(yàn)組以2.5 μg/g大黃魚的劑量腹腔注射poly (I:C), 對照組注射等體積的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS, pH=7.4), 分別于注射后3h、6h、12h和24h采集大黃魚頭腎和脾臟樣品, 每個時間點(diǎn)各采集3尾。采集正常大黃魚的心臟、肝臟、脾臟、頭腎、胃、腸、血液、鰓、腦、皮膚和肌肉組織, 放入液氮中速凍, 再轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 大黃魚免疫相關(guān)細(xì)胞分離與培養(yǎng)

取正常大黃魚頭腎組織, 放在70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)上輕輕研磨, 制成細(xì)胞懸液, 將細(xì)胞懸液添加到新制備的34%和51% Percoll溶液上, 4℃, 650×g離心30min。離心后, 吸取中間層的細(xì)胞, 使用L-15培養(yǎng)基洗滌3次, 再接種到6孔板中, 每孔2.0×106個細(xì)胞,28℃培養(yǎng)2h, 分別收集懸浮的原代淋巴細(xì)胞和貼壁的原代巨噬細(xì)胞。將研磨后的細(xì)胞懸液用移液槍加入到51%Percoll上, 4℃, 650×g離心30min, 收集離心管底部的原代粒細(xì)胞。

大黃魚頭腎細(xì)胞系(LYCK), 是本實(shí)驗(yàn)室建立并長期保存的細(xì)胞系[18], 使用L-15培養(yǎng)基(15% FBS)進(jìn)行培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度為28℃。

1.3 RNA提取和cDNA合成

采用Eastep?Super Total RNA Extraction Kit(Promega)分別提取大黃魚各組織和免疫相關(guān)細(xì)胞的總RNA, 用Eastep?RT Master Mix Kit(Promega)合成cDNA, 具體方法參考試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.4 LcATG10基因克隆與序列分析

從NCBI上查找出大黃魚ATG10基因序列(Gen-Bank登錄號: XM_019277201.2), 設(shè)計(jì)特異引物L(fēng)cATG10-F和LcATG10-R(表 1), 以大黃魚脾臟的cDNA為模板, PCR擴(kuò)增ATG10基因的開放閱讀框(Open reading frame, ORF)全長序列, 并測序驗(yàn)證。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域采用SMART軟件進(jìn)行預(yù)測, 其他物種ATG10序列來自GenBank數(shù)據(jù)庫, 通過DNAMAN進(jìn)行序列比對; 使用MEGA7.0 軟件, 采用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.5 LcATG10在大黃魚組織和免疫相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)分析

將采集的3尾大黃魚的組織進(jìn)行RNA提取, 利用特異性引物RT-LcATG10-F和RT-LcATG10-R(表 1)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng), 檢測LcATG10在正常大黃魚各組織中的表達(dá)水平。

表1 引物序列Tab. 1 Primers information

分別收集4種大黃魚免疫相關(guān)細(xì)胞, 用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國ORFLO公司)計(jì)數(shù)2.0 ×106個細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取和cDNA合成, 采用上述方法檢測LcATG10在正常大黃魚4種免疫相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)水平。

熒光定量PCR反應(yīng)體系如下: 2×SYBR GreenⅠ 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL, cDNA模板0.2 μL, 無菌水9.6 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2min, 95℃變性15s, 57℃退火20s, 72℃延伸20s, 共40個循環(huán)。LcATG10的相對表達(dá)水平采用2-ΔΔCt方法計(jì)算, 并用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＜0.05表示差異顯著, 用“*”表示,P＜0.01表示差異極顯著, 用“**”表示。

1.6 poly (I:C)刺激后LcATG10在大黃魚免疫組織和免疫相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)分析

將采集的大黃魚頭腎和脾臟組織分別進(jìn)行總RNA提取和cDNA合成, 采用熒光定量PCR檢測poly (I:C)刺激的大黃魚各組織中LcATG10基因相對于對照組大黃魚各組織的表達(dá)變化。熒光定量PCR和數(shù)據(jù)分析方法如1.5。

將大黃魚LYCK細(xì)胞和原代粒細(xì)胞接種于6孔板中, 每種細(xì)胞各接種6個孔(實(shí)驗(yàn)組和對照組各3孔), 每孔2.0 ×106個細(xì)胞, 用L-15培養(yǎng)基于28℃進(jìn)行培養(yǎng)。LYCK細(xì)胞培養(yǎng)12h后使用終濃度為50 μg/mL的poly (I:C)刺激, 原代粒細(xì)胞接種后立即進(jìn)行poly (I:C)刺激, 同時用無菌PBS溶液處理的細(xì)胞作為對照。收集細(xì)胞后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以大黃魚β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng), 檢測poly (I:C)刺激的LYCK和原代粒細(xì)胞中LcATG10基因相對于對照組細(xì)胞的表達(dá)變化。熒光定量PCR和數(shù)據(jù)分析方法如1.5。

1.7 免疫印跡

選擇生長狀態(tài)良好的鯉上皮瘤細(xì)胞系(EPC)接種于6孔板中, 每孔約1×106個細(xì)胞, 加入2 mL含10% FBS的L-15培養(yǎng)基, 28℃培養(yǎng)12h。利用轉(zhuǎn)染試劑FuGENE?HD(Promega)將2 μg pcDNA3.1-LcATG10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EPC細(xì)胞, 以空載體pcDNA3.1作為對照。轉(zhuǎn)染48h后, 加入裂解液使細(xì)胞裂解完全。離心取上清, SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上。取出膜放入洗膜盒中, 加入5 mL TBST緩沖液[5%(w/v)脫脂奶粉], 放在搖床搖動1h, 然后與鼠抗人c-myc單克隆抗體(Thermo Fisher, 1∶2000)室溫孵育1h, TBST洗滌3次,然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)多克隆抗體(Thermo Fisher, 1∶4000)室溫孵育1h, 再用TBST 洗滌3次, 每次5min, 最后用凝膠成像儀檢測結(jié)果。

1.8 LcATG10抗病毒實(shí)驗(yàn)

借助鯉EPC細(xì)胞和鯉春病毒血癥病毒(SVCV)感染模型分析LcATG10在病毒感染過程中的功能。生長狀態(tài)良好的EPC細(xì)胞用胰酶消化下來, 加入L-15培養(yǎng)基并離心, 計(jì)數(shù)后接種于6孔板中, 每孔約1×106個細(xì)胞, 加入2 mL含10% FBS的L-15培養(yǎng)基, 放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。將2 μg pcDNA3.1-LcATG10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EPC細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組, 以空載體pcDNA3.1作為對照組。在轉(zhuǎn)染24h后, 使用感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection, MOI)為1.4的SVCV感染實(shí)驗(yàn)組和對照組EPC細(xì)胞。在感染24h和48h后, 使用顯微鏡觀察細(xì)胞病變程度并拍照,同時對感染48h的細(xì)胞用結(jié)晶紫染料進(jìn)行染色觀察。分別收集感染48h的細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞。培養(yǎng)上清用于測定病毒滴度, 收集的細(xì)胞提取總RNA,并合成cDNA, 以大黃魚β-actin作為內(nèi)參基因, 采用熒光定量PCR檢測病毒基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的相對表達(dá)水平。病毒基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的熒光定量PCR引物見表 1, 熒光定量PCR和數(shù)據(jù)分析方法如1.5。

2 結(jié)果

2.1 大黃魚LcATG10分子特征

克隆的LcATG10基因ORF長747個核苷酸(Gen-Bank登錄號: XP_027143515.1), 該蛋白由248個氨基酸殘基組成, 序列分析發(fā)現(xiàn),LcATG10與哺乳動物ATG10蛋白序列特征相似, 不具有信號肽和跨膜區(qū), 含有1個保守的Autophagy_act_C結(jié)構(gòu)域(124—191位氨基酸), 該結(jié)構(gòu)域含有與ATG12和ATG5結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn), 包括亮氨酸(Leu135、Leu147、Leu149、Leu164、Leu180)、脯氨酸(Pro178、Pro189)、色氨酸(Trp153)和半胱氨酸(Cys190)。氨基酸序列同源性比對顯示,LcATG10與金頭鯛(Sparus aurata)ATG10的序列一致性最高(76.3%)其次為石斑魚(Epinephelus lanceolatus)(74.2%)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示, 所有物種的ATG10與釀酒酵母ATG8分為兩大支, 其中LcATG10與其他魚類的ATG10形成1個分支, 哺乳類、兩棲類和禽類的ATG10聚為另外一支(圖 1)。

2.2 LcATG10在正常大黃魚不同組織或器官及免疫相關(guān)細(xì)胞中表達(dá)分析

采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了正常大黃魚心臟、肝臟、脾臟、頭腎、胃、腸、血液、鰓、腦、皮膚和肌肉組織中LcATG10的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,LcATG10在所有檢測的組織中呈組成型表達(dá), 表達(dá)量最高的為腸道, 在頭腎中最低(圖 2A)。

此外, 我們還檢測了LcATG10在大黃魚原代頭腎淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞及頭腎細(xì)胞系LYCK中的相對表達(dá)水平, 結(jié)果表明LcATG10能夠在這些細(xì)胞中表達(dá), 表達(dá)量最高的是原代粒細(xì)胞, 最低的是原代巨噬細(xì)胞(圖 2B)。

2.3 poly(I:C)刺激對LcATG10表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步了解LcATG10是否參與大黃魚抗病毒免疫反應(yīng), 使用病毒類似物poly (I:C)刺激大黃魚, 檢測大黃魚頭腎和脾臟中LcATG10的轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果顯示, poly (I:C)刺激后, 大黃魚頭腎中LcATG10的轉(zhuǎn)錄水平從3h開始上調(diào), 在12h達(dá)到最高值, 是對照組的5.9倍, 而在24h表達(dá)量顯著下降(圖 3A); 在脾臟中,LcATG10的轉(zhuǎn)錄水平在刺激后3h開始上調(diào), 6h 達(dá)到峰值, 為對照組的9.4倍, 隨后下調(diào)(圖 3B)。

此外, 我們還分析了poly (I:C)刺激大黃魚頭腎細(xì)胞系LYCK和原代粒細(xì)胞中LcATG10的轉(zhuǎn)錄變化。結(jié)果顯示, 在poly (I:C)刺激后,LcATG10的轉(zhuǎn)錄水平在LYCK細(xì)胞中先上升, 在12h達(dá)到最大值,是對照組的3.6倍, 隨后有所下降(圖 3C); 在原代粒細(xì)胞中LcATG10的表達(dá)水平快速上調(diào), 但在24h和48h顯著下調(diào)(圖 3D)。

圖3 大黃魚組織和免疫相關(guān)細(xì)胞受poly(Ⅰ∶C)刺激后LcATG10表達(dá)變化Fig. 3 Expression levels of LcATG10 in tissues and immunerelated cells of large yellow croaker after poly (I∶C) stimulation

2.4 LcATG10保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染

為了確定LcATG10在抗病毒免疫中的功能, 利用EPC細(xì)胞過表達(dá)LcATG10, 再分析LcATG10過表達(dá)對SVCV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示LcATG10在EPC細(xì)胞中得到了表達(dá)(圖 4A), 在SVCV感染24h和48h后, 過表達(dá)LcATG10的EPC細(xì)胞中CPEs明顯少于轉(zhuǎn)染空載體的EPC細(xì)胞(圖 4B和4C)。在感染48h后, 過表達(dá)LcATG10的EPC細(xì)胞上清中病毒滴度為103.55TCID50/mL, 顯著低于對照組的病毒滴度(109.36TCID50/mL; 圖 4D)。此外, 在過表達(dá)LcATG10的EPC細(xì)胞中, 感染48h后SVCV標(biāo)志基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的表達(dá)量顯著低于對照組, 分別是對照組的0.022、0.015和0.022倍(圖 4E)。這些數(shù)據(jù)表明LcATG10具有抑制SVCV復(fù)制的功能。

圖4 LcATG10 過表達(dá)對病毒復(fù)制的影響Fig. 4 Effects of LcATG10 overexpression on virus replication

3 討論

ATG10作為自噬小體形成的核心因子之一, 介導(dǎo)了ATG12-ATG5復(fù)合體形成的最后一步反應(yīng)[19,20]。目前,ATG10基因在酵母[12]、人(Homo sapiens)[21]、小鼠(Mus musculus)[22]、牡蠣(Crassostrea gigas)[9]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[11]和小麥(Triticum aestivum)[23]等真核生物中得到了鑒定及功能研究,但在魚類中的研究尚未見報道。因此, 解析大黃魚ATG10的分子特征及其在抗病毒免疫中功能, 有助于闡明魚類ATG10在抗病毒免疫中的作用機(jī)制。

在系統(tǒng)進(jìn)化樹中,LcATG10和其他物種的ATG10與釀酒酵母ATG8分為兩大支, 其中LcATG10與石斑魚和金頭鯛ATG10聚在一起, 處于硬骨魚類分支中, 表明本研究獲得的LcATG10基因確為ATG10的同源基因。大黃魚ATG10蛋白含有一個Autophagy_act_c結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域是ATG10的一個重要功能域, 包含多個高度保守的氨基酸位點(diǎn)。在太平洋牡蠣中亮氨酸(Leu107和Leu159)、脯氨酸(Pro105和Pro161)、色氨酸(Trp125和Trp141)和半胱氨酸(Cys162)被認(rèn)為是參與ATG12-ATG5結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)[19], 而大黃魚Autophagy_act_c結(jié)構(gòu)域同樣包含這些保守氨基酸位點(diǎn)。此外, 在這些保守氨基酸殘基中半胱氨酸Cys是ATG10和ATG12之間硫酯鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[10], 在人和小鼠ATG10中半胱氨酸Cys133殘基周圍序列高度保守, 被認(rèn)為是活性位點(diǎn)[12], 同樣在大黃魚ATG10中半胱氨酸Cys190殘基周圍序列也高度保守, 提示大黃魚ATG10蛋白可能也參與ATG12-ATG5結(jié)合過程。

為了研究LcATG10的功能特征, 本研究首先對LcATG10基因在大黃魚組織中的表達(dá)譜進(jìn)行分析。據(jù)報道, 目前對動物ATG10基因組織表達(dá)譜的分析較少, 僅在太平洋牡蠣中有類似的報道。在本研究中,LcATG10在所有被檢測的大黃魚組織中均有表達(dá), 這種組成型表達(dá)模式不僅與太平洋牡蠣中CgATG10的表達(dá)模式相似[9], 而且與黃顙魚ATG4和LC3(酵母ATG8同源基因)、太平洋鱈ATG5、草魚Beclin1(酵母ATG6同源基因)等魚類自噬相關(guān)基因組織表達(dá)譜類似[24—26], 推測自噬可能在大黃魚多種生理功能中發(fā)揮作用。此外,LcATG10基因在LYCK細(xì)胞以及原代巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞中均有表達(dá), 表明LcATG10可能參與大黃魚免疫功能。

研究表明, 病原感染能夠誘導(dǎo)宿主ATG10基因的上調(diào)表達(dá), 進(jìn)而激活細(xì)胞自噬發(fā)揮抗病原感染的功能, 其中ATG10在自噬小體的形成中具有重要作用, 在受到病毒感染時可以促進(jìn)自噬小體的形成,進(jìn)而抑制病毒的復(fù)制[9,14]。在人肝癌細(xì)胞系Huh7.5中, 過表達(dá)ATG10可以抑制人丙型肝炎病毒HCV的復(fù)制[15]。在本研究中, 病毒類似物poly (I:C)刺激后大黃魚脾臟、頭腎組織及LYCK細(xì)胞和原代粒細(xì)胞中LcATG10基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上升, 與poly(I:C)刺激后太平洋牡蠣中ATG10的表達(dá)上調(diào)相一致, 表明LcATG10可能參與抗病毒免疫反應(yīng)。進(jìn)一步在EPC細(xì)胞中過表達(dá)LcATG10可顯著減少SVCV感染引起的CPEs現(xiàn)象, 同時還顯著降低了感染細(xì)胞培養(yǎng)上清中SVCV滴度和SVCV標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄水平,表明LcATG10具有抑制SVCV病毒在EPC細(xì)胞中復(fù)制的功能。Zhao等[15]在人肝癌細(xì)胞系HepG2中發(fā)現(xiàn), 過表達(dá)ATG10可以促進(jìn)自噬小體的形成, 并導(dǎo)致HCV亞基因組復(fù)制子的降解。因此, 我們推測LcATG10可能通過促進(jìn)自噬小體形成來實(shí)現(xiàn)對病毒的抑制作用, 但這一推測還有待于進(jìn)一步的證實(shí)。

綜上所述, 本研究從大黃魚中鑒定了一個具有保守Autophagy_act_c結(jié)構(gòu)域的ATG10基因(LcATG10)。檢測了LcATG10在大黃魚組織和免疫相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)水平, 結(jié)果顯示其均呈組成型表達(dá)。poly (I:C)刺激后LcATG10表達(dá)在大黃魚免疫相關(guān)組織和免疫細(xì)胞中均顯著上調(diào)。在EPC細(xì)胞中過表達(dá)LcATG10可抑制SVCV的復(fù)制, 提示LcATG10可能通過促進(jìn)自噬小體的形成參與其抗病毒免疫反應(yīng), 然而具體機(jī)制有待闡明。這些研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究自噬在大黃魚抗病毒免疫中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。