姜祝祥 郭早棗 鄭國棟 , 鄒曙明 ,

(1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部團(tuán)頭魴遺傳育種中心, 上海 201306; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306;3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是世界上重要的淡水養(yǎng)殖品種之一, 但草魚易患多種疾病, 其中影響很大的是草魚出血病[1]。草魚出血病目前還沒有有效的治療方法[2], 因此給草魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

先天性免疫反應(yīng)作為魚類抵御病原體入侵的重要屏障, 在抵御草魚出血病中起到了重要作用[4]。先天性免疫反應(yīng)的組成成分之一是淋巴細(xì)胞, 當(dāng)環(huán)境中存在病原體時(shí), 淋巴細(xì)胞會(huì)給通過先天性免疫反應(yīng)給宿主發(fā)送危險(xiǎn)信號(hào)[5]。草魚出血病的主要特征是各個(gè)組織的充血狀態(tài), 病毒的攻擊會(huì)導(dǎo)致血液免疫力的變化, 血液作為免疫反應(yīng)的一道重要屏障,可以將免疫細(xì)胞從一個(gè)部位輸送至另一個(gè)部位, 充當(dāng)了免疫系統(tǒng)的管道[6], 血液中產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞(漿細(xì)胞)更是免疫應(yīng)答的效應(yīng)子[7], 可以增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對GCRV病毒的抵抗能力。

作為先天性免疫反應(yīng)中重要的調(diào)控因子, NF-κB信號(hào)通路的激活可以抑制GCRV病毒的感染,BCL10(B-cell lymphoma)基因作為NF-κB通路的上游調(diào)節(jié)劑, 可以激活NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)來抑制病毒復(fù)制。目前關(guān)于BCL10基因的研究主要集中在人類上[12],BCL10基因最初是從與黏膜相關(guān)淋巴樣組織克隆出來的, 它通過將含有CARD的支架蛋白與MALT1對半胱氨酸酶橋接來充當(dāng)NF-κB信號(hào)的誘導(dǎo)劑。而BCL10在魚類抗病研究中鮮有報(bào)道, 有研究表明BCL10可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的存活[13], 而BCL10表達(dá)的缺乏還會(huì)導(dǎo)致適應(yīng)性免疫反應(yīng)的缺乏[14], 說明BCL10在免疫反應(yīng)方面起著重要作用。

在本研究中, 我們觀察到草魚感染GCRV后血液中淋巴細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量均發(fā)生了顯著變化, 并且克隆了與之相關(guān)的BCL10基因。此外, 還研究了BCL10基因在草魚各個(gè)組織中表達(dá)情況, 為今后研究BCL10基因在魚類先天性免疫反應(yīng)中的機(jī)理提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用草魚來自上海海洋大學(xué)團(tuán)頭魴遺傳與育種中心, 所有的實(shí)驗(yàn)都是按照上海海洋大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進(jìn)行的?？偣彩褂昧?0尾草魚, 平均重量為4.4—6.0 g。本實(shí)驗(yàn)中所有草魚取組織前都先用100 mg/L的MS222(三卡因甲磺酸鹽, Sigma)處理?？焖偃〔蒴~組織儲(chǔ)存在-80℃冰箱中。

1.2 草魚出血病攻毒實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在2個(gè)盛有100 L水的充氣玻璃缸(120 cm×40 cm×30 cm)中進(jìn)行, 對照組和實(shí)驗(yàn)組每組30條草魚, 在病毒注射之前, 將草魚置于(28±1)℃的水溫中暫養(yǎng)1周, 每天投喂2次, 確認(rèn)無任何疾病后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。采用腹腔注射的方式, 對照組按20 μL/g的劑量注射無菌PBS溶液, 實(shí)驗(yàn)組按20 μL/g劑量注射GCRV-II型病毒。該病毒由中國科學(xué)院水生生物研究所汪亞平團(tuán)隊(duì)贈(zèng)送, 毒株S2片段與典型的II型菌株GCRV-HZ08高度相似(98.4%), 被歸為II型GCRV, 命名為GCRV-II, 病毒滴度為2.97×103copy/μL[15]。在注射完GCRV后, 對照組24h后隨機(jī)抽取10條草魚, 而實(shí)驗(yàn)組在1d、4d和7d隨機(jī)選擇10條魚麻醉后尾靜脈采血方式收集血液, 并進(jìn)制備血涂片。同時(shí)收集鰓、肝胰腺和中腎組織放入-80℃冰箱儲(chǔ)存。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)及石蠟切片

將收集到的血液樣本立即滴上載玻片, 隨機(jī)輕輕推開。用瑞士-姬姆薩染色液(Baso, 珠海)進(jìn)行細(xì)胞染色。將Wright-Giemsa溶液A(約0.5 mL)添加到涂片中染色1min, 再將Wright-Giemsa溶液B(溶液A的2—3倍)添加到溶液A上, 用膠頭滴管混勻, 靜置10min, 之后用水輕輕沖洗, 晾干。最后放入光學(xué)顯微鏡(徠卡, 德國, RM2125RT)中觀察。每尾選取細(xì)胞分布均勻的涂片20片, 在Neubauer計(jì)算版上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù), 并用以下公式計(jì)算:

血液中淋巴細(xì)胞數(shù)(mm3)=N×25/5×10×200×106式中,N表示5個(gè)中方格淋巴細(xì)胞總數(shù), 25/5代表5個(gè)中方格淋巴細(xì)胞數(shù)換算為一個(gè)大格的淋巴細(xì)胞數(shù),10為一個(gè)大格的淋巴細(xì)胞數(shù)換算為1 mL稀釋血液中淋巴細(xì)胞數(shù), 200為血液稀釋倍數(shù), 106則表示1 L=106mL。

從每條魚上取中腎放入波恩氏溶液中固定20—24h。固定好的組織經(jīng)過酒精梯度脫水, 二甲苯梯度透明, 石蠟梯度透蠟, 最后放入正方形盒子中包埋。用組織切片機(jī)將組織切成5 μm的薄片貼于載玻片之上。采用HE染色法(蘇木精與伊紅對比染色法)染色, 最后用中性樹脂封片。干燥過后用徠卡光學(xué)顯微鏡觀察, 并保存觀察到的圖片。

1.4 cDNA合成及BCL10基因克隆、鑒定

根據(jù)試劑盒說明書要求, 將收集的草魚的血液、鰓、肝胰腺和中腎用TRIzol試劑(TaKaRa, 日本)提取總RNA, 使用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano300微量分光光度計(jì)(奧盛, 中國, Nano-300)檢測RNA質(zhì)量, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser)用于合成基因全長 CDS序列克隆的第一鏈 cDNA。

利用本實(shí)驗(yàn)室基因組測序結(jié)果搜索到了BCL10基因的Scaffold序列, 在草魚全基因組數(shù)據(jù)庫中找到了CDS編碼區(qū), 再將得到的CDS序列放在NCBI上Blast比對, 驗(yàn)證其正確性, 用PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 的方法對BCL10基因進(jìn)行克隆, 根據(jù)Seamless Cloning Kit無縫克隆試劑盒說明書(碧云天, 中國)設(shè)計(jì)包含同源臂的引物pEGFP-BCL10-F/ pEGFP-BCL10-R(表 1), PCR擴(kuò)增BCL10全長, 經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性后, PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒 (天根, 中國) 進(jìn)行純化。送至上海生工有限公司測序, 驗(yàn)證序列。

1.5 進(jìn)化樹分析

通過BLASP和Search對不同物種的BCL10蛋白推測序列進(jìn)行比較。Compute pI/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi)預(yù)測蛋白分子量和等電點(diǎn)。https://swissmodel.expasy.org/interactive 在線生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測BCL10蛋白的二級結(jié)構(gòu)。MEGA 6.06構(gòu)建BCL10系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測感染草魚出血病后不同時(shí)間段BCL10基因的表達(dá)變化, 在CFX96 TouchTMReal-time PCR檢測系統(tǒng) (Bio-Rad)中進(jìn)行, 使用primer5.0設(shè)計(jì)熒光定量引物BCL10-F/R (表 1), 以草魚18S rRNA作為內(nèi)參基因(18SF/R)[16], 目的基因相對表達(dá)量用 2-ΔΔCt方法計(jì)算, 用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行單因素方差法分析。

表1 所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)是通過單向方差分析獲得的, 然后使用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行多次比較。P值＜0.01和＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3遍。

2 結(jié)果

2.1 感染期間血液及腎組織變化

注射GCRV病毒以后, 草魚血液中的淋巴細(xì)胞的變化如圖 1所示, 在對照組中淋巴細(xì)胞的數(shù)量為(12.13±1.52)×106ind./mL, 與對照組相比, 第1天淋巴細(xì)胞數(shù)目下降, 第4天顯著下降, 達(dá)到最小值。第7天淋巴細(xì)胞數(shù)目與對照組相比顯著下降, 與第4天相比數(shù)目上升。對照組中草魚的中腎組織排列整齊, 第1天基膜間隙開始出現(xiàn), 第4天時(shí)出現(xiàn)了空泡化現(xiàn)象, 第7天時(shí)出現(xiàn)了嚴(yán)重的空泡變性, 脫落壞死的現(xiàn)象, 大量的炎性細(xì)胞浸潤了腎組織(圖 2)。

圖1 感染GCRV以后淋巴細(xì)胞的數(shù)量變化Fig. 1 Changes in the number of lymphocytes after infection with GCRV

圖2 感染GCRV以后血液及腎組織病理學(xué)變化Fig. 2 Pathological changes of blood and kidney after GCRV infection

2.2 草魚BCL10 cDNA序列

本文克隆的草魚BCL10基因序列開放閱讀框?yàn)?38 bp, 編碼245個(gè)氨基酸。經(jīng)預(yù)測其蛋白分子量為 26644.73 ku, 等電點(diǎn) (pI) 為5.28。通過NCBI BLASP發(fā)現(xiàn),BCL10基因廣泛存在于硬骨魚中,包括鯉科、脂鯉科和遮目魚科。通過在線生物信息學(xué)網(wǎng)站https://swissmodel.expasy.org/interactive 預(yù)測了草魚BCL10基因的二級結(jié)構(gòu)(圖 3), 發(fā)現(xiàn)人類、斑馬魚與草魚BCL10二級結(jié)構(gòu)都以α螺旋為主, 而且結(jié)果相似。系統(tǒng)發(fā)育樹分析也表明草魚BCL10與其他硬骨魚種的直系同源體均有良好的聚類關(guān)系(圖 4), 并且由于物種的巨大進(jìn)化分離, 魚類BCL10序列分為不同的進(jìn)化枝。

圖3 預(yù)測人類、斑馬魚及草魚BCL10二級結(jié)構(gòu)Fig. 3 The predicted the secondary structure of BCL10 in human,zebrafish and grass carp

圖4 草魚BCL10基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of grass carp BCL10 sequences in vertebrates

2.3 感染GCRV后BCL10基因表達(dá)變化

為了研究草魚在感染GCRV以后BCL10基因在各組中的表達(dá)情況, 按20 μL/g注射含GCRV的組織勻漿液以后, 熒光定量 qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn), 與對照組0天相比, 第1天草魚BCL10基因在鰓和肝胰腺中表達(dá)量增加, 在血細(xì)胞和中腎中表達(dá)量顯著增加,第4天BCL10在血細(xì)胞、鰓、肝胰腺和中腎中表達(dá)量均顯著增加, 第7天BCL10在血細(xì)胞和鰓中表達(dá)量顯著下降, 肝胰腺和中腎中表達(dá)量下降(圖 5)。

圖5 感染GCRV后BCL10在血細(xì)胞、鰓、肝胰腺和中腎中的表達(dá)情況Fig. 5 The effect of GCRV on the expression of BCL10 in blood cells, gills, hepatopancreas and trunk kidney

3 討論

3.1 感染GCRV后腎組織及淋巴細(xì)胞變化分析

魚類腎臟可以通過血液循環(huán)清除代謝廢物和調(diào)節(jié)離子平衡來維持機(jī)體的穩(wěn)定, 是魚體重要的免疫器官之一, 隨著GCRV病毒的入侵, 腎臟中細(xì)胞逐漸空泡變性及脫落壞死, 而壞死的腎臟最終會(huì)破壞機(jī)體的血液循環(huán)系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明GCRV入侵魚體后會(huì)引起一系列凝血[18,19]及炎癥反應(yīng), 表明了病毒會(huì)入侵了血液的免疫系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞是先天性免疫反應(yīng)的一道重要屏障, 在抵御病毒入侵的過程中起著重要作用[18]。淋巴細(xì)胞可以分泌多特異性抗體, 它是一種有效的天然抗體, 可以限制病原體的傳播[20]。在病毒入侵魚體后, 血液中的淋巴細(xì)胞數(shù)量第7天時(shí)的增加, 表明GCRV的誘導(dǎo)激活了血液中淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)。與GCRV相似的是, 尼羅羅非魚感染西尼羅河病毒后, 早期淋巴細(xì)胞也會(huì)廣泛活化, 第7天后會(huì)產(chǎn)生特異性淋巴細(xì)胞[21], 說明了淋巴細(xì)胞在抵御病毒的重要作用。

3.2 BCL10序列及功能分析

預(yù)測的草魚BCL10二級結(jié)構(gòu)圖與人類、斑馬魚和草魚BCL20相似, 說明草魚BCL10基因在長期進(jìn)化中高度保守。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明, 草魚BCL10與其他硬骨魚種的直系同源體均有良好的聚類關(guān)系, 這表明它們是硬骨魚特異性基因組復(fù)制的結(jié)果。

作為控制細(xì)胞凋亡的基因[21]和NF-κB炎癥反應(yīng)通路上的重要調(diào)控因子[23,24], 病毒入侵先天性免疫反應(yīng)系統(tǒng)后,BCL10起到了重要的調(diào)控作用[4]。它可以激活和終止免疫細(xì)胞信號(hào), 在GCRV入侵魚體后,BCL10首先激活免疫細(xì)胞, 接著免疫細(xì)胞會(huì)調(diào)節(jié)魚體中由病毒引起的凝血[25,26]和炎癥反應(yīng), 在先天性免疫反應(yīng)[23]中起著重要的作用。

3.3 感染GCRV后各組織BCL10表達(dá)分析

本研究首次檢測了GCRV入侵魚體后BCL10基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示, 隨著GCRV的入侵,BCL10基因表達(dá)量在第1和第4天增加, 血細(xì)胞和中腎中最為顯著, 第4天血細(xì)胞、鰓、肝胰腺和中腎中都顯著增加, 說明血液和腎作為先天性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵性組成成分[6,27], 會(huì)第一時(shí)間響應(yīng)病毒的入侵。研究表明用強(qiáng)毒性GCRV-CL毒株感染后草魚后, 在鰓、血液和腎臟等組織中病毒拷貝數(shù)更高[28],腎臟會(huì)啟動(dòng)自噬機(jī)制來抑制病毒復(fù)制并減輕炎癥反應(yīng)[29]。此外, 肝胰腺也會(huì)因?yàn)镚CRV的感染從而釋放儲(chǔ)存的鐵, 鐵超載不利于宿主細(xì)胞抵抗病毒感染并對于病原體感染有益[30]。第7天時(shí)血液中的淋巴細(xì)胞數(shù)量升, 說明了體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。BCL10基因會(huì)起到激活炎癥反應(yīng)的作用, 與其在人體內(nèi)的功能一致[31]。而第7天表達(dá)量的下降可能是由于病毒的大量復(fù)制直接加劇了機(jī)體的炎癥反應(yīng), 使得BCL10基因失去了調(diào)控炎癥的作用。

綜上所述, 我們首次觀察到了草魚感染GCRV以后血液中淋巴細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)變化, 并且研究了中腎組織的病理學(xué)特征及淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BCL10的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 病毒入侵魚體后BCL10表達(dá)量先是升高, 到第7天時(shí)又下降到正常水平以下。然而現(xiàn)在關(guān)于BCL10在草魚出血病中的研究還相對缺乏, 本研究為后續(xù)BCL10基因功能方面的研究提供了重要的依據(jù), 為BCL10在先天性免疫反應(yīng)中的相關(guān)作用機(jī)制提供了線索。