蔡明成 孫翰昌 謝明地 李淳鴻添 趙胤年 樊汶樵 楊 帆

(1. 重慶文理學(xué)院, 園林與生命科學(xué)學(xué)院, 永川 402160; 2. 西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 榮昌 402460)

水生動物可能因食物缺乏遭受階段性饑餓, 將影響動物正常生長、發(fā)育、繁殖和存活等[1,2]。饑餓引起水生動物重新分配能量資源, 維持組織器官代謝和生存基本需求, 不同水生動物表現(xiàn)出不同程度耐受性, 如金魚(Carassius auratus)最長可耐受12d, 草魚(Ctenopharyngodon idella)最長可耐受約28d[3]。然而, 在恢復(fù)正常攝食后, 部分水生動物可表現(xiàn)出超過正常生長的速度, 該現(xiàn)象被稱為補(bǔ)償生長, 受品種、年齡和饑餓-攝食間隔時(shí)間等因素影響[4]。鄭小東等[5]研究表明, 采用S1F5投喂模式可顯著提高長蛸(Octopus minor)末體重。周歧存等[6]采用S1F6和S2F5投喂模式, 發(fā)現(xiàn)可激活虎斑烏賊(Sepia pharaonis)補(bǔ)償生長, 但不影響肌肉營養(yǎng)成分。此外, 饑餓再投喂模式可激活黃鰭鰈(Pleucronectes aspeer)[7]、大西洋鱈(Gudus morrhua)[8]、西伯利亞鱘(Acipenser baerii)[9]、幼鱸(Lateolabrax japonicus)[10]、星斑川鰈(Platichthys stellatus)[11]和條石鯛(Oplegnathus fasciatus)[12]等魚類補(bǔ)償機(jī)制。因此, 制定合理有效的饑餓再投喂制度, 可有效提高水生動物生產(chǎn)性能, 降低飼料以及勞動成本, 對推動水生動物科學(xué)養(yǎng)殖、提高養(yǎng)殖效益具有重要意義。

研究表明, 動物機(jī)體在食物匱乏時(shí)產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species, ROS), 當(dāng)ROS生成速率超過去除速率時(shí), 機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。其產(chǎn)生的自由基可導(dǎo)致細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等分子損傷, 最終造成細(xì)胞死亡[14]。魚類屬于異溫脊椎動物, 其特異性免疫反應(yīng)能力相對較低, 但具有抗氧化劑清除系統(tǒng)將ROS維持在相對較低水平, 減輕相關(guān)的損害[15]。在抗氧化防御系統(tǒng)中, 主要包括過氧化物歧化酶(Hepatic superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(Catalse, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(Hepatic glutathione peroxidase, GSH-PX)等, 還廣泛存在非酶抗氧化劑如谷胱甘肽的細(xì)胞內(nèi)水平影響酶類抗氧化劑活性, 且會受到饑餓、缺氧、重金屬及溫度等不利因素的影響[1,16]。此外, 在饑餓條件下魚類不僅可以調(diào)節(jié)消化酶活性, 而且可以改變其消化環(huán)境的組成[17,18]。例如, 當(dāng)卡特拉魮(Gibelion catla)處于饑餓時(shí), 所有的腸道消化酶活性均呈顯著降低, 但當(dāng)重新獲得食物后其活性逐漸恢復(fù)[19]。另外, 有研究表明, 魚類腸道消化酶的活性隨饑餓時(shí)間的延長而發(fā)生改變[20]。因此, 研究不同饑餓再投喂模式下抗氧化酶和腸道消化酶活性的變化, 為科學(xué)制定投喂模式提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)屬于鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae), 花鰍亞科(Cobitinae), 副泥鰍屬(Paramisgurnus), 除青藏高原外, 我國各地區(qū)均有分布[21]。大鱗副泥鰍具有生長速度較快、耐饑餓能力強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)嫩和高蛋白低脂肪等優(yōu)點(diǎn), 是一種生產(chǎn)潛力大的養(yǎng)殖品種[22]。目前, 關(guān)于大鱗副泥鰍補(bǔ)償生長的研究較少, 在泥鰍仔魚的研究中發(fā)現(xiàn), 饑餓再投喂可提高仔魚增重率和特殊生長率。其中, 饑餓7d后再投喂泥鰍仔魚體重高于持續(xù)飼喂組, 表明短時(shí)間饑餓處理可激發(fā)泥鰍生長補(bǔ)償機(jī)制[23]。然而, 在補(bǔ)償生長激活過程中,機(jī)體的生理響應(yīng)激活或抑制情況并不清楚?；诖? 本研究以大鱗副泥鰍為研究對象, 通過不同饑餓-再投喂方式, 檢測其對大鱗副泥鰍生長性能的影響。同時(shí), 研究饑餓再投喂模式對大鱗副泥鰍肝臟抗氧化能力和腸道消化酶的影響, 探討在饑餓脅迫下大鱗副泥鰍的生理響應(yīng)機(jī)制, 為制定高效飼喂策略提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

本試驗(yàn)所用大鱗副泥鰍選自于重慶市永川區(qū)水產(chǎn)良種繁育中心, 選取的泥鰍暫養(yǎng)于重慶文理學(xué)院水產(chǎn)中心。室內(nèi)控溫, 保持水溫(22±1)℃, 每日投喂2次(9:00和17:00), 飼料為泥鰍專用全價(jià)配合料(粗蛋白質(zhì)含量為32%), 每次投喂至表觀飽食, 每3天換1次曝氣24h以上的自來水, 并清理水箱。9d后, 將大鱗副泥鰍分組飼養(yǎng), 雌、雄隨機(jī)分箱, 每箱20尾。

1.2 試驗(yàn)分組

本試驗(yàn)共分為4組, 包括持續(xù)投喂(對照組)、饑餓2d再投喂4d(S2F4)、饑餓2d再投喂6d(S2F6)和饑餓2d再投喂8d(S2F8; 表 1)。每組設(shè)3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)泥鰍共20尾, 分別飼養(yǎng)于12個(gè)水箱(長、寬、高分別為90 cm×50 cm×50 cm), 試驗(yàn)期為30d。

表1 大鱗副泥鰍投喂模式Tab. 1 The feeding model of P. dabryanus

1.3 樣本采集

根據(jù)不同投喂模式, 在投喂的第0、第15和第30天分別從每個(gè)水箱取5尾大鱗副泥鰍, 測定體重和體長, 分離泥鰍內(nèi)臟并稱重; 并將肝臟和腸道進(jìn)行解剖分離, 用滅菌生理鹽水清洗, 用濾紙吸去水分并稱重, 保存于-80℃冰箱待用。

1.4 生長性能測定

本試驗(yàn)測定大鱗副泥鰍增重率(Weight gain rate,WGR)、特定生長率(Specific growth rate,SGR)、肝體比(Hepatosomatic index,HSI)、肥滿度(Condition factor,CF)和臟體比(Visceral index,VSI), 計(jì)算方式如下所示:

增重率(WGR, %)=(Wt-W0)/W0×100%

攝食期內(nèi)特定生長率(SGR, %/d)=(lnWt-lnW0)×100/t

肥滿度(CF, g/cm3)=100×Wt/L3

肝體比(HSI)=100×Wg/Wt

臟體比(VSI)=100×Wv/Wt

式中, 肥滿度單位為(g/cm3),W0和Wt各代表泥鰍初始和末體重(g),Wv表示內(nèi)臟質(zhì)量(g),Wg表示肝臟質(zhì)量(g),C表示總攝食餌料量(g),t表示攝食時(shí)間(d),L表示泥鰍體長(cm)。

1.5 肝臟抗氧化酶和腸道消化酶活性測定

稱取一定質(zhì)量組織(肝臟和腸道)樣本, 按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入無菌生理鹽水, 在冰水浴條件下進(jìn)行機(jī)械勻漿, 于4℃, 2500 r/min離心10min, 收集上清液。測定肝臟抗氧化酶活性(包括SOD、CAT和GSH-PX), 腸道消化酶活性, 包括蛋白酶(Protease, PTA)、脂肪酶(Lipase, LPA)和淀粉酶(Amylase, ALA), 以上檢測試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所, 且參照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。利用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析, 包括單因素方差分析(One-way ANOVA), 雙因素方差分析(Two-way ANOVA), 多重比較(Tukey’s)分析, 以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 周期性饑餓再投喂對大鱗副泥鰍生長性能的影響

在30d周期性饑餓再投喂后, 各組間泥鰍存活率無顯著差異。對體重和體長研究發(fā)現(xiàn), S2F8組末體重(15.92±0.57) g顯著高于對照組(15.04±0.09) g(P＜0.05), S2F8組末體重顯著高于S2F6(15.27±0.57) g(P＜0.05), 而各組間的末體長不具有顯著性差異(P＞0.05; 表 2)。另外, S2F8組增重率(36.54±9.36)顯著高于對照組(29.34±2.99)和S2F6組(28.96±4.12;P＜0.05), 其余各組之間無顯著差異。各組間特定生長率均無顯著性差異(P＞0.05)。在第0和第30天,各組間肥滿度、臟體比和肝體比無顯著性差異(P＞0.05), 而30d后各組大鱗副泥鰍肥滿度均顯著低于第0天(P＜0.05); 對照組、S2F4和S2F8組中30d臟體比顯著高于第0天(P＜0.05), S2F6組中無顯著差異(P＞0.05)。另外, 投喂30d后, 各組間肝體比無顯著差異(P＞0.05; 表 3)。

表2 周期性饑餓再投喂對大鱗副泥鰍生長性能的影響Tab. 2 Effect of periodical starvation-refeeding on growth performance of Paramisgurnus dabryanus (mean±SD, n=5)

表3 周期性饑餓再投喂第0和第30天肥滿度、臟體比和肝體比的差異Tab. 3 The difference of condition factor, visceral index and hepatosomatic index between 0 and 30d during periodical starvation-refeeding (mean±SD, n=5)

2.2 周期性饑餓再投喂對大鱗副泥鰍肝臟抗氧化活性酶的影響

如表 4所示, 隨飼養(yǎng)時(shí)間增加, 對照組和S2F4組肝臟SOD活性呈升高趨勢, 但均無顯著性差異(P＞0.05); 在S2F6組中, 第30天 SOD活性呈顯著高于第0天(P＜0.05); 在S2F8組中, 第15和第30天SOD活性均顯著高于第0天(P＜0.05)。在第0天時(shí),各組間SOD活性無顯著差異(P＞0.05); 第15天時(shí),S2F8組SOD活性顯著高于對照組(P＜0.05); 第30天時(shí), S2F6和S2F8組SOD活性顯著高于對照組(P＜0.05)。對肝臟CAT活性研究發(fā)現(xiàn), 對照組CAT活性隨飼養(yǎng)時(shí)間增加而升高, 但無顯著性差異(P＞0.05); S2F4組肝臟CAT活性在第30天顯著高于第0天(P＜0.05); S2F6和S2F8組CAT活性在第15和第30天顯著高于第0天(P＜0.05); 另外, 第15天時(shí),S2F6和S2F8組肝臟CAT活性顯著高于對照組(P＜0.05); 第30天時(shí), S2F6組CAT活性均顯著高于對照組(P＜0.05)。對肝臟GSH-PX活性研究發(fā)現(xiàn),S2F4、S2F6和S2F8組肝臟GSH-PX活性在第15和第30天均顯著高于第0天(P＜0.05)。此外, 第15天時(shí), S2F6和S2F8組GSH-PX活性顯著高于對照組(P＜0.05), 且S2F8組GSH-PX活性顯著高于S2F6(P＜0.05); 在第30天時(shí), S2F6和S2F8組中GSH-PX活性均顯著高于對照組(P＜0.05), S2F8組GSH-PX活性顯著高于S2F4和S2F6組(P＜0.05)。

表4 周期性饑餓再投喂對大鱗副泥鰍肝臟抗氧化酶活性的影響Tab. 4 Effects of periodical starvation-refeeding on hepatosomatic antioxidant indices of P. dabryanus (mean±SD, n=5)

2.3 周期性饑餓再投喂對大鱗副泥鰍腸道消化酶的影響

在不同處理時(shí)間下, 對照組、S2F4和S2F8組中腸道蛋白酶(PTA)含量呈降低趨勢, 但無顯著變化(P＞0.05), S2F6組中腸道PTA活性在第15和第30天顯著低于0(P＜0.05)。組間分析發(fā)現(xiàn), 在第0、第15和第30天, 各組間腸道PTA活性無顯著差異(P＞0.05)。對腸道淀粉酶(ALA)活性研究發(fā)現(xiàn), 各組ALA活性隨時(shí)間增加均呈減低趨勢, 其中S2F6組腸道ALA活性在第30天顯著低于0(P＜0.05), S2F8組腸道ALA在第15和第30天均顯著低于0(P＜0.05);另外, 在第0、第15和第30天各組間腸道ALA活性無顯著差異(P＞0.05)。對腸道脂肪酶(LPA)研究發(fā)現(xiàn), 隨時(shí)間增加, 對照組LPA活性有升高趨勢(P＞0.05), S2F4和S2F6組LPA活性呈先升高后下降的趨勢(P＞0.05), S2F8組LPA活性逐漸降低(P＞0.05)。此外, 在第0和第15天時(shí), 各組間腸道LPA無顯著差異; 在第30天時(shí), S2F6和S2F8組腸道LPA顯著低于對照組(P＜0.05; 表 5)。

表5 周期性饑餓再投喂對大鱗副泥鰍腸道消化酶的影響Tab. 5 Effects of periodical starvation-refeeding on intestinal amylase of P. dabryanus (mean±SD, n=5)

3 討論

3.1 饑餓再投喂對大鱗副泥鰍生長性能的影響

在饑餓狀態(tài)下, 動物通過調(diào)整行為和生理狀態(tài)等機(jī)制以獲取能量滿足代謝需求[24]。在水生動物中, 對饑餓具有不同的耐受力和適應(yīng)度, 且會表現(xiàn)為補(bǔ)償生長現(xiàn)象, 補(bǔ)償生長分為超補(bǔ)償生長、完全補(bǔ)償生長、部分補(bǔ)償生長和不能補(bǔ)償生長[25]。然而, 不同種類水生動物可因種類、環(huán)境、生長狀態(tài)和饑餓時(shí)長等因素產(chǎn)生較大的差異[26]。已有研究表明, 對于補(bǔ)償生長的判斷標(biāo)準(zhǔn)較多, 如將馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)的性腺指數(shù)和生化組分(水分、蛋白質(zhì)、脂肪和糖類)作為衡量標(biāo)準(zhǔn),將成活率和增重率作為無針烏賊(Sepiella japonica)的判斷標(biāo)準(zhǔn)[27,28]。在本研究中, 大鱗副泥鰍周期性饑餓再投喂處理后S2F8組中的末體重和增重率顯著高于對照組, S2F8組增重率顯著高于S2F6,S2F8組表現(xiàn)出超補(bǔ)償生長能力, S2F4和S2F6兩組末體重高于對照組, 但無顯著差異, 表現(xiàn)為完全補(bǔ)償生長能力, 表明周期性饑餓再投喂有助于激發(fā)大鱗副泥鰍補(bǔ)償生長機(jī)制。另外, 對大麻哈魚(Oncorhynchus keta)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)進(jìn)行短期饑餓處理后, 均出現(xiàn)一定的補(bǔ)償生長能力[29,30]。在本試驗(yàn)中, 對大鱗副泥鰍肥滿度和臟體指數(shù)在第30天分別顯著降低和升高, 肝體指數(shù)無顯著差異,而各組間無顯著差異, 表明饑餓再投喂對大鱗副泥鰍形體指標(biāo)無顯著影響。綜上所述, 大鱗副泥鰍在短期周期性饑餓再投喂處理后能提高其生長, 因而從節(jié)約成本, 保障泥鰍生長速度來看, 采用S2F8的周期性投喂模式為最佳。

3.2 肝臟抗氧化酶對饑餓再投喂的響應(yīng)

水生魚類可利用儲存脂質(zhì)的氧化途徑作為能量代謝的主要來源, 然而饑餓會引起ROS的產(chǎn)生,最后引起機(jī)體氧化應(yīng)激[13,31]。魚類作為低-變溫動物, 其免疫應(yīng)答能力相對較弱, 但具有抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng), 以保持機(jī)體內(nèi)源ROS處于較低水平[32]。其中, SOD、CAT和GSH-PX是關(guān)鍵的抗氧化酶, 且在機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激中具有重要作用。SOD主要可將超氧陰離子自由基還原為過氧化氫,且在GSH-PX和CAT作用下將過氧化氫分解為水和氧氣[33]。在本研究中, 隨著處理時(shí)間增長, S2F6和S2F8組SOD活性逐漸升高, 且在第30天時(shí)S2F6和S2F8組SOD活性顯著高于對照組, 表明饑餓再投喂處理引起大鱗副泥鰍機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激, 大鱗副泥鰍通過調(diào)節(jié)肝臟SOD活性抵抗氧化應(yīng)激。在鱘(Acipenser dabryanus)饑餓再投喂研究中[34], 發(fā)現(xiàn)SOD活性在血清和肝臟中顯著升高, 與本研究結(jié)果相似。此外, S2F6和S2F8組大鱗副泥鰍肝臟CAT活性在第15天顯著高于對照組, S2F6組在第30天顯著高于對照組, 在第15和第30天時(shí), S2F6和S2F8組GSH-PX活性均顯著升高, 表明在饑餓再投喂處理中, 隨著處理時(shí)間增加, CAT和GSH-PX作為抗氧化酶系統(tǒng)關(guān)鍵因子參與大鱗副泥鰍抗氧化途徑。以上結(jié)果表明, 長時(shí)間周期性饑餓再投喂可引起大鱗副泥鰍肝臟SOD、CAT和GSH-PX含量升高, 提高機(jī)體抗氧化能力。

3.3 腸道消化酶對饑餓再投喂的響應(yīng)

在饑餓過程中, 魚類所需的食物能量來源不足,自身代謝發(fā)生適應(yīng)性改變, 通過消耗體內(nèi)儲存物質(zhì)(如肝糖原、肌糖原等)以維持生命, 同時(shí)消化酶活性將發(fā)生改變[26]。在各品種的魚類中, 饑餓引起的消化酶變化具有不同的規(guī)律。有研究表明, 饑餓3d將引起厚頜魴(Megalobrama pellegrini)稚魚淀粉酶活性顯著增加, 但隨饑餓時(shí)間增加, 其活性逐漸降低; 脂肪酶活力在饑餓3d后顯著降低, 隨時(shí)間延長卻出現(xiàn)逐漸升高[25]。在虎斑烏賊(Sepia pharaonis)中發(fā)現(xiàn), 饑餓2d時(shí), 淀粉酶和脂肪酶活性處于最低水平, 饑餓3d后脂肪酶活性有一定升高[6]。在本研究中, 對大鱗副泥鰍饑餓再投喂后, 在第15和第30天時(shí)腸道淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶均低于對照組, 表明長時(shí)間饑餓再投喂影響腸道消化酶的分泌,降低機(jī)體消化吸收能力。持續(xù)饑餓再投喂30d后,S2F6組蛋白酶含量顯著低于0, S2F6淀粉酶含量顯著低于0。在第30天時(shí), S2F6和S2F8組腸道脂肪酶顯著低于對照組。由此可知, 饑餓再投喂30d后, 大鱗副泥鰍腸道消化酶活性出現(xiàn)降低趨勢, 其中脂肪酶受影響較大。在不同處理時(shí)間中, 各組蛋白酶和淀粉酶未發(fā)生顯著變化, 保持了適當(dāng)?shù)幕钚? 可能是機(jī)體保證重新獲得食物供給后可產(chǎn)生適當(dāng)?shù)姆纸夥磻?yīng), 與在黃鱔(Monopterus albus)中消化酶活性的影響相似[35]。綜上所述, 長時(shí)間周期性饑餓再投喂引起腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶顯著降低, 說明降低腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用是大鱗副泥鰍應(yīng)對饑餓脅迫的主要響應(yīng)。

4 結(jié)論

本文研究了周期性饑餓再投喂對大鱗副泥鰍生長、抗氧化能力和腸道消化酶活性的影響。結(jié)果表明, S2F4、S2F6和S2F8均出現(xiàn)補(bǔ)償生長。周期性饑餓再投喂引起大鱗副泥鰍氧化應(yīng)激, 導(dǎo)致肝臟抗氧化酶活性升高, 同時(shí)消化代謝功能受到影響,腸道消化酶活性降低。其中S2F8處理后增重率顯著升高, 且在周期性饑餓再投喂過程中肝臟抗氧化酶和腸道消化酶活性保持較高水平, 優(yōu)于S2F4和S2F6投喂模式?；诖? 建議以饑餓2d投喂8d的模式, 提高大鱗副泥鰍生長性能, 降低飼養(yǎng)成本。