劉艷飛，劉真真，呂金峰，呂薏潼，房鈺良，朱元祺,*

(1.青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島266003;2.青島大學醫(yī)學部檢驗系，山東 青島 266071;3.青島市婦女兒童醫(yī)院 山東 青島266034;4.香港城市大學 生物科學專業(yè))

希瓦氏菌屬是于1985年建立的新屬，目前有70余個種[1]。希瓦氏菌屬于非發(fā)酵菌，廣泛分布于自然界。其中，與臨床感染相關的主要是腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)、海藻希瓦氏菌(Shewanellaalgae)、奧奈達希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)和廈門希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)。希瓦氏菌可引起人的中耳炎、血流感染、肝膽系統(tǒng)感染以及皮膚和軟組織的感染[2]。到目前為止，國內外關于廈門希瓦氏菌引起人體臨床感染的報道相對較少。因此，本文對臨床分離的一株耐碳青霉烯類希瓦氏菌HDC555進行分子鑒定、藥敏表型和產碳青霉烯酶檢測，以及對菌株的基因組序列進行測序和分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗和藥敏質控菌株希瓦氏菌HDC555株分離自肺部感染患者的痰液。S1核酸酶切脈沖場電泳的分子量標記沙門菌H9812和藥敏質控菌株ATCC 25922為本實驗室保存。

1.2 儀器與試劑生物梅里埃公司VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)。藥敏結果判定依據CLSI-2021標準[3]。美國BIO-RAD公司脈沖場電泳系統(tǒng)和凝膠成像儀。其他試劑為Takara公司。

1.3 菌株碳青霉烯酶的篩選分別通過mCIM/eCIM(改良碳青酶烯滅活試驗/EDTA改良碳青酶烯滅活試驗)和免疫金標法篩選菌株產生的碳青霉烯酶。mCIM/eCIM實驗操作步驟和結果判定依據CLSI-2021標準[3]。免疫金標法試劑分別為上海復星NG-Test CARBA 5試劑卡(批號W20040311)和北京金山川碳青霉烯酶檢測卡(批號201031)，這兩個廠商的試驗卡的實驗步驟和結果判定按照試劑盒內提供的說明書進行。

1.4 S1核酸酶切脈沖場凝膠電泳(S1-PFGE)希瓦氏菌HDC555攜帶質粒的檢測通過S1核酸酶切脈沖場凝膠電泳，具體操作參照文獻[4]。

1.5 希瓦氏菌HDC555的高通量測序基于Illumina和Nanopore技術平臺對HDC555株進行測序，然后對獲得的序列利用一系列軟件分析菌株的生物學信息。Inkscape0.48.1軟件繪圖。

2 結果

2.1 菌株的藥敏和碳青霉烯酶檢測結果

希瓦氏菌HDC555對頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢他啶、厄他培南、亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星和磺胺甲惡唑/甲氧芐啶哌耐藥，但對哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、頭孢吡肟、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素和左氧氟沙星敏感。

mCIM/eCIM實驗顯示希瓦氏菌HDC555的mCIM和eCIM都是陽性，按照CLSI-2021中結果判讀標準，在該株菌中檢出金屬β-內酰胺酶。然而，在免疫金標法試驗中，上海復星NG-Test CARBA 5試劑卡和北京金山川NDM碳青霉烯酶檢測卡以及OXA-48碳青霉烯酶檢測卡顯示都顯示該株菌產碳NDM和OXA-48碳青霉烯酶。此外，北京金山川OXA-23碳青霉烯酶檢測卡顯示陰性，即，北京金山川OXA-23碳青霉烯酶檢測卡與OXA-48碳青霉烯酶檢測卡之間沒有呈現(xiàn)交叉反應。實驗結果見圖1。

圖1 希瓦氏菌HDC555碳青霉烯酶檢測結果圖

2.2 菌株的S1-PFGE和高通量測序結果

S1-PFGE顯示希瓦氏菌HDC555株攜帶一個大約217 kb的質粒,見圖2。高通量測序獲得了該菌的染色體和攜帶的1個質粒的序列，分別命名為HDC555-chr和pHDC555-1。通過ANI比對，原VITEK 2 Compact儀器鑒定HDC555株為腐敗希瓦氏菌實際上是廈門希瓦氏菌。另外，質粒pHDC555-1的序列長度為217 441 bp，與S1-PFGE顯示的質粒大小相一致。此外，序列分析顯示廈門希瓦氏菌HDC555攜帶blaOXA-199和blaNDM-1基因，并分別位于染色體和質粒上，其他耐藥基因和信息見表1。

圖2 S1核酸酶切脈沖場凝膠電泳

表1 廈門希瓦氏菌HDC555株的生物信息分析結果

通過NCBIblast比對，HDC555的blaOXA-199區(qū)域與廈門希瓦氏菌WCJ25(JN704570.1)的blaOXA-199區(qū)域[5]高度相似,但與廈門希瓦氏菌S4(JX644945.1)的blaOXA-48區(qū)域[5]相似度稍低。blaOXA-199與blaOXA-48周圍環(huán)境區(qū)別主要是ISSheS2插入到了blaOXA-199的下游，見圖3。

圖3 HDC555與WCJ25和S4的MDR部分區(qū)域比較圖

質粒pHDC555-1的MDR區(qū)域含有blaNDM-1和blaCARB-2兩個耐藥基因。blaNDM-1對應區(qū)域源自Tn125轉座子，而其blaCARB-2區(qū)域與PGI2-C74(MK847916.1)的對應核酸序列[6]高度相似。另外，blaNDM-1和blaCARB-2這兩個耐藥基因所在區(qū)域由插入序列IS26相連接，見圖4。

圖4 pHDC555-1與PGI2-C74的blaCARB-2區(qū)域比較

3 討論

隸屬于希瓦氏菌屬的廈門希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)是Huang 于2010年首次報道[7]。該菌株分離于福建省廈門沿海的海洋沉積物。目前，臨床上應用的微生物自動鑒定系統(tǒng)不能對希瓦氏菌屬進行正確地鑒定，使得一些新菌種被誤鑒定為腐敗希瓦氏菌或海藻希瓦氏菌[8-9]。本研究的希瓦氏菌HDC555經VITEK 2 Compact儀器最初鑒定為腐敗希瓦氏菌，但通過平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)比對，希瓦氏菌HDC555全基因組與廈門希瓦氏菌基因組的OrthoANIu value高達97.41%，即，原VITEK 2 Compact自動儀鑒定HDC555株為腐敗希瓦氏菌實際上是廈門希瓦氏菌。另外，廈門希瓦氏菌HDC555全基因組測序數(shù)據經分析顯示：①HDC555-chr序列長度為5023 766 bp,blaOXA-199基因位于該染色體上;②質粒pHDC555-1的長度為217 441 bp，除了與S1-PFGE顯示的質粒大小相一致外，blaNDM-1和blaCARB-2這兩個耐藥基因都位于質粒上。

Zong于2012年首次報道[5]攜帶blaOXA-199基因的廈門希瓦氏菌。該菌分離自一位胰腺炎患者術后所放置的胰周引流管。通過NCBIblast比對，HDC555的blaOXA-199區(qū)域長度為11 940 bp，與廈門希瓦氏菌WCJ25(GenBank No：JN704570.1)的blaOXA-199區(qū)域高度相似(coverage100%,identity99.96%),但與廈門希瓦氏菌S4(GenBank No：JX644945.1)的blaOXA-48區(qū)域相似度稍低(coverage78%,identity 96.70%)。blaOXA-199上游毗鄰orf(編碼肽酶)、sprT(編碼功能未知蛋白)、endA(編碼內切核酸酶)、rsmE(編碼核糖體RNA甲基轉移酶)，下游與ISShes2(插入序列)、lysR(轉錄調節(jié)因子基因)、acc(乙酰輔酶A羧化酶編碼基因)相鄰。blaOXA-199和blaOXA-48周圍環(huán)境高度相似，區(qū)別主要在于ISSheS2插入到了blaOXA-19的下游(圖3)。

blaCARB-2耐藥基因是染色體盒(chromosomal cassette)的一部分，早期曾被確認為blaPSE-1基因[10-11]。關于該基因在不同的菌種和國家分布的報道不多。到目前為止，已有報道在鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、皮特不動桿菌和多噬伯克霍爾德菌中有檢出blaCARB-2基因[12-13]，但在廈門希瓦氏菌中檢出blaCARB-2耐藥基因尚未見報道。此外，在希瓦氏菌中檢出blaNDM-1基因也比較少。到目前為止，僅僅Potter于2017年報道1株腐敗希瓦氏菌SA70株攜帶了位于染色體上的blaOXA-436基因和位于質粒上的blaNDM-1基因，且該SA70株分離自巴基斯坦一所教學醫(yī)院重癥監(jiān)護室的水槽把手[14]。除了blaOXA-199基因外，也有報道廈門希瓦氏菌攜帶其他D類碳青霉烯酶耐藥基因，如blaOXA-181、blaOXA-416blaOXA-538和blaOXA-894基因[15-18]。

本研究中的廈門希瓦氏菌HDC555攜帶有一個質粒(pHDC555-1)。測序數(shù)據經分析顯示，該質粒的MDR(多重耐藥)區(qū)域含有blaNDM-1和blaCARB-2兩個耐藥基因：blaNDM-1對應區(qū)域源自Tn125轉座子，基因結構為dsbD-trpF-bleMBL-blaNDM-1-ΔISAba125;blaCARB-2對應區(qū)域與PGI2-C74(GenBank No：MK847916.1)的對應核酸序列高度相似，PGI2-C74包含一個Ⅰ類整合子，基因結構為dfrA16-blaCARB-2-aadA2-cmlA1-aadA1，并且已有研究表明PGI2-C74可以從奇異變形桿菌成功地結合轉移到大腸埃希菌[6]。另外，在質粒pHDC555-1中，blaNDM-1和blaCARB-2這兩個耐藥基因所在區(qū)域由插入序列IS26相連接，Ⅰ類整合子的組件和插入序列 IS26之間的同源重組可能促進了MDR 區(qū)域的多樣性(圖4)。

值得注意的是廈門希瓦氏菌HDC555對頭孢三代和碳青酶烯類的厄他培南、亞胺培南和美羅培南耐藥，但對哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、頭孢吡肟敏感，其原因有待于進一步研究。另外，按照CLSI-2021中推薦的mCIM/eCIM實驗方法，在希瓦氏菌HDC555僅僅中檢出金屬β-內酰胺酶(盡管在指南[3]中已經提示該方法對產兩種碳青霉烯酶的細菌會有假陰性)，而在免疫金標法中顯示該菌攜帶兩種碳青霉烯酶。因此，在臨床工作中，有必要將這兩種方法相互結合，以增加檢出的陽性率。

綜上所述，廈門希瓦氏菌未來有可能成為引起臨床感染的潛在重要病原菌。經檢索，同時攜帶了blaOXA-199、blaNDM-1和blaCARB-2耐藥基因的廈門希瓦氏菌引起的臨床感染為國內外首次報道。